一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移敏化淬滅轉(zhuǎn)化因子的測量方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)敏化淬滅轉(zhuǎn)化因子(G因子）的測量方 法，具體涉及一種基于部分受體光漂白的G因子測量方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 基于熒光蛋白（FPs)的FRET顯微術(shù)已經(jīng)成為在活細胞中研究生化動態(tài)分子過程的 重要工具。獲得不依賴于檢測系統(tǒng)和FPs表達水平的定量FRET信號是進行學術(shù)交流和比較 的前提。
[0003] 由于高靈敏性、低損傷和快速的特性，基于三個濾光片組合的FRET顯微成像術(shù)(簡 稱3-cube FRET microscopy)成為活細胞中主流的定量FRET成像分析技術(shù)。這種受體敏化 FRET檢測方法(SE-FRET方法)要求分別利用三個不同的熒光濾光片組對FRET樣本得到三種 圖像:供體通道圖像(I?，通過供體激發(fā)光激發(fā)時在供體熒光探測通道探測到的供體熒光）， 受體通道圖像(Iaa，通過受體激發(fā)光激發(fā)時在受體熒光探測通道探測到的受體熒光），F(xiàn)RET 通道圖像(Ida，通過供體激發(fā)光激發(fā)時在受體熒光探測通道探測到的熒光）。
[0004] G因子表示的是敏化受體發(fā)射的熒光(Fc)占由于發(fā)生FRET使供體發(fā)生淬滅的熒光 的比值。對于一種給定的FRET熒光團對和成像系統(tǒng)，G因子是一個恒量。測量可靠的G因子是 3-cube FRET測量的關(guān)鍵。
[0005]目前已有多種測量G因子的方法，Ho ppe[A.D. Hoppe，K. Christensen, and J.A.Swanson,"Fluorescence resonance energy transfer-based stoichiometry in living cells，"Biophys.J.83(6)，3652-3664(2002)]利用熒光壽命FRET測量方法(FUM) 先測量出一種供受體濃度比為1:1的FRET串聯(lián)結(jié)構(gòu)的FRET效率(E)，然后再用該質(zhì)粒測量出 G因子。這種方法需要額外昂貴復雜FUM測量儀器，并且測定速度慢，且容易受到光漂白的 影口向。Zal和Gascoigne[T.Zal and N.R.J.Gascoigne,uPhotobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells，"Biophys.J.86(6) ,3923-3939(2004)]提出一種基 于逐漸漂白固定FRET樣本的受體來確定G因子的方法，該方法需要固定細胞(死細胞），并需 要同時測量漂白前后FRET樣本三個通道的圖像，至少需要轉(zhuǎn)換濾光片組(cube)4次。另外， 利用死細胞測量的G值是否適合活細胞中FRET的精確測量一致存在爭議。Nagy [Nagy， Peter,et al."Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins," Cytometry Part A 67(2)86-96(2005)]通過三種E值不同的供受體濃度比為1:1的FRET串 聯(lián)結(jié)構(gòu)來確定G值。這種方法需要的活細胞樣本多，實驗過程繁瑣，數(shù)據(jù)處理較為困難。Chen [H.Chen et al·，"Measurements of FRET Efficiency and Ratio of Donor to Acceptor Concentration in living Cells，"Biophys.J.91(5)，L39_L41(2006)]在活細 胞中用兩個E值未知的供受體濃度比1:1的FRET串聯(lián)結(jié)構(gòu)來確定G因子。這種方法需要準備 兩種效率不同的FRET活細胞樣本，并且兩種FRET樣本必須在完全相同的條件下測量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移 敏化淬滅轉(zhuǎn)化因子的測量方法。對于一個給定的供受體對和檢測系統(tǒng)，其G因子是一個恒 量。G因子的準確測量是基于受體敏化熒光強度測量的FRET效率定量檢測的關(guān)鍵。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0008] 本發(fā)明是基于部分受體光漂白來測量G因子，即將我們最近發(fā)明的部分受體光漂 白FRET效率測量技術(shù)[H.N.Yu et al.，"An empirical quantitative fluorescence resonance energy transfer method for multiple acceptors based on partial acceptor photobleaching/'Appl .Phys.Lett. 100,253701(2012) ·]與E-FRET方法相結(jié)合， 提出了一種G因子的測量新方法。
[0009] -種熒光共振能量轉(zhuǎn)移敏化淬滅轉(zhuǎn)化因子的測量方法，包括以下具體的步驟：
[0010] (1)在活細胞中表達一種含有1個供體和n個受體(1 :n)的FRET串聯(lián)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)；
[0011] (2)首先利用寬場熒光顯微鏡對上述細胞進行三通道熒光成像，分別得到IDD、IAA、 Ida三種熒光強度圖，然后選擇性光漂白部分受體，再進行熒光成像獲得和的熒光 強度圖；
[0012] ⑶計算G因子：
[0013]
[0014] 其中，F(xiàn)c 是敏化到受體的熒光強度，F(xiàn)c = IDA-a(lM-cIDD)-d(IDD-blM)，a、b、c、d是光 譜串擾系數(shù)；
[0015] IDD表示通過供體激發(fā)光激發(fā)時在供體熒光探測通道探測到的供體熒光強度；
[0016] Iaa表示通過受體激發(fā)光激發(fā)時在受體熒光探測通道探測到的受體熒光強度；
[0017] Ida表示通過供體激發(fā)光激發(fā)時在受體熒光探測通道探測到的熒光強度；
[0018] igf表示選擇性光漂白部分受體后探測到的IDD;
[0019] 表示選擇性光漂白部分受體后探測到的Iaa ;
[0020]
%漂白程度，控制為10~80%，優(yōu)選為15~30% ;
[0021] η為止整數(shù)，n1 尤選為1~50的整數(shù)。
[0022]為了更好的闡述本發(fā)明，下面以一個G因子測量的實例進行說明：
[0023]給定的供體受體對:供體為Cerulean(簡稱C)，受體為Venus(簡稱V)。
[0024]測量系統(tǒng):本實例采用雙通道寬場熒光顯微鏡，結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0025] F R E T串聯(lián)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)C 3 2 V :由3 2個氨基酸的連接序列 (TSGLETRDIRSENLYFQGPREFPGGTAGPVAT)將 C和 V鏈接組成的 FRET 串聯(lián)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。
[0026] 具體測量過程如下：
[0027] (1)在人的肝癌細胞(HepG2細胞）中轉(zhuǎn)染并表達C32V;
[0028] (2)在寬場熒光顯微鏡對上述細胞進行三通道熒光成像。采用445 ±12.5nm、510 土 8 · 5nm的光分別作為Cerulean和Venus的激發(fā)光，采用480± llnm、長通530nm的通道分別作 為Cerulean和Venus熒光的探測通道，可以測得IDD、IAA、Ida三種熒光強度圖；圖像采集后利 用較強的受體激發(fā)光(510±8.5nm)選擇性地漂白部分受體Venus，實際過程中為了減少細 胞的光損傷將X控制在15~30%之間，漂白時間在2~4s之間；受體部分漂白之后，同樣進行 熒光成像獲得if和的熒光強度圖。
[0029] (3)用 C32V(n = l)計算 G 因子：
[0030]
[0031] 由于Fc = IDA-a(lM-cIDD)-d(IDD-blM)，其中a、b、c、d在FRET 定量測量中通過單轉(zhuǎn)的 供體C樣本和受體V樣本求出；X = (7^ - / /^為漂白程度。
[0032] 因此，我們通過測量漂白前的IDD、IM、IDA以及漂白后的/^、ijf值，就能很快的 得至|JFC和X值，進而求出對應的G因子。
[0033] 本發(fā)明的基本原理如下：
[0034] 對Zal和Gascoigne提出的E-FRET公式進行整理：
[0035]
⑴
[0036]其中fD表不FRET結(jié)構(gòu)體中供體分子占所有供體分子的比例。
[0037]從該式可以看出，如果能測量出已知受供體濃度比的FRET串聯(lián)結(jié)構(gòu)的E值，并結(jié)合 該FRET串聯(lián)結(jié)構(gòu)在三通道測得的熒光強度就可以求出G值。
[0038]這里可以運用我們最近發(fā)明的部分受體光漂白FRET效率測量技術(shù)[H.N.Yu et al.，"An empirical quantitative fluorescence resonance energy transfer method for multiple acceptors based on partial acceptor photobleaching，'， Appl.Phys.