一種凝血激活檢測(cè)試劑及其制備方法與用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及凝血檢測(cè)試劑領(lǐng)域，特別是涉及一種凝血激活檢測(cè)試劑及其制備方法 與用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前常規(guī)內(nèi)外源凝血功能實(shí)驗(yàn)（如：ΡΤ，APTT)只能檢測(cè)無(wú)血小板參與狀態(tài)下的血 漿中凝血因子活性，它不能闡明凝血全過(guò)程，只能反映凝血過(guò)程中某一階段或某種凝血產(chǎn) 物在生理狀態(tài)下無(wú)血小板參與的凝血反應(yīng)，但是血小板與凝血因子的相互作用極其復(fù)雜， 無(wú)血小板參與的凝血檢測(cè)不能反應(yīng)凝血全貌，并且存在的缺點(diǎn)為檢測(cè)樣本為血漿，檢測(cè)過(guò) 程中無(wú)血細(xì)胞參與，同時(shí)對(duì)纖維蛋白原測(cè)定和血小板計(jì)數(shù)僅反映數(shù)量，未對(duì)功能進(jìn)行測(cè)定 而且不能預(yù)測(cè)血栓風(fēng)險(xiǎn)；檢測(cè)過(guò)程為分段式檢測(cè)，不能對(duì)凝血過(guò)程進(jìn)行整體評(píng)估。
[0003] Simmons等研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)蘇效果如何與PT及PTT的相關(guān)性不佳，提示這些值異常 改變?cè)谛菘思按罅枯斞委熀笱舆t（>24小時(shí)）發(fā)生（AnnSurg. 1969 ;169:4:455 - 482); Counts等對(duì)接受大量輸血病人的凝血功能的進(jìn)行了一項(xiàng)大規(guī)模的前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)PT、 PTT及出血時(shí)間只有當(dāng)顯著延長(zhǎng)時(shí)才有幫助，不能作為指導(dǎo)許多其他病人治療的標(biāo)準(zhǔn) (AnnSurg. 1979 ; 190:91 - 99);另外Lucas等在一項(xiàng)關(guān)于低血容量休克及復(fù)蘇的一項(xiàng)大 型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中報(bào)道，PT及PTT很少發(fā)生改變，除非當(dāng)輸血量超過(guò)相當(dāng)于15單位全血（Ann Surg. 1981 ;47:125 - 130)。
[0004] 因此，強(qiáng)調(diào)組織因子通路在止血過(guò)程中的決定性地位以及強(qiáng)調(diào)激活的因子 VII(FVIIa)以及TF/FVIIa復(fù)合體是穩(wěn)定血栓形成的重要步驟的經(jīng)典的內(nèi)、外源性凝血反 應(yīng)近來(lái)受到了"細(xì)胞水平"凝血概念的挑戰(zhàn)。所以用全血進(jìn)行檢測(cè)的方法如ACT(活化凝血 時(shí)間）和TEG(血栓彈力圖）就突出其顯著的優(yōu)點(diǎn)，其中ACT(activatedclottingtime, 活化凝血時(shí)間）是將抽出的血液放入裝有白陶土或硅藻土試管中，觀察血液凝固時(shí)間的長(zhǎng) 短，其值即為ACT值，活化凝血時(shí)間是"凝血時(shí)間"的改良試驗(yàn)，是內(nèi)源性凝血系統(tǒng)較敏感的 篩選試驗(yàn)之一，也是監(jiān)護(hù)體外循環(huán)肝素用量的較好指標(biāo)，可以非常準(zhǔn)確反映藥物預(yù)防接觸 性血栓的能力。TEG是用物理方法模擬人體內(nèi)環(huán)境下凝血、纖溶，迅速判斷患者是否存在高 凝、低凝、纖溶亢進(jìn)，并分析形成原因。它實(shí)現(xiàn)凝血因子啟動(dòng)、血小板聚集、纖溶的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)， 提供患者真實(shí)凝血全貌。血栓彈力圖儀是一種從整個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程來(lái)監(jiān)測(cè)凝血過(guò)程的分析儀。 1948年由德國(guó)人Harter發(fā)明，80年代開(kāi)始廣泛用于指導(dǎo)臨床術(shù)中輸血，現(xiàn)已成為當(dāng)今監(jiān)測(cè) 凝血功能的最重要指標(biāo)之一，TEG使用全血作為檢測(cè)標(biāo)本，在體外加入高嶺土（Kaolin)激 活，從而啟動(dòng)凝血機(jī)制，從內(nèi)外源凝血系統(tǒng)的啟動(dòng)、纖維蛋白的形成、到血塊溶解進(jìn)行全程 監(jiān)測(cè)。TEG具有的優(yōu)勢(shì)為：更能準(zhǔn)確反映機(jī)體凝血功能的變化、敏感性高，相比之下凝血試 驗(yàn)只檢測(cè)了凝血當(dāng)中的一部分或一個(gè)點(diǎn)。TEG是檢測(cè)除了血管因素之外的從凝血到纖溶的 整個(gè)凝血過(guò)程，包括了凝血因子、血小板、纖維蛋白以及纖維蛋白溶解的整個(gè)過(guò)程，另外它 的穩(wěn)定性好，凝血試驗(yàn)需處理血樣，以血漿或特定血樣為主，易受采樣、儲(chǔ)存、檢驗(yàn)、試劑、設(shè) 備的影響，TEG以全血作為檢測(cè)對(duì)象，不須處理血樣。此外TEG更能準(zhǔn)確反映機(jī)體凝血功能 的變化的臨床意義：可用于手術(shù)或有創(chuàng)治療前，凝血異常功能的監(jiān)測(cè)（感染、黃疸、SAP等）、 抗凝治療期間凝血功能異常的監(jiān)測(cè)（體外循環(huán)、CRRT等）、危重病人出血風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估等。 更重要的是TEG能夠更準(zhǔn)確的糾正凝血功能異常?？梢酝ㄟ^(guò)鑒別不同凝血功能障礙而制 定特異性的目標(biāo)指導(dǎo)治療，使得輸血量的減少（JTrauma. 2008;64:564 - 568);并且可以 早期糾正凝血功能異常，以便起到生理性止血作用（JTrauma. 2009;66:1253 - 1257);可 以糾正紊亂的凝血功能，使得止血過(guò)程正常進(jìn)行，這可提高急性失血的生存率（CritCare Med. 2008 ;36:187.)，還可減輕包括ARDS及MOF在內(nèi)免疫炎癥并發(fā)癥的程度，從而改善預(yù)后 (CurrOpinAnesthesiol. 2009 ;22:289 - 298.)。另外TEG對(duì)低濃度的肝素、類(lèi)肝素或低分 子肝素更敏感，可檢測(cè)出〇. 〇〇5U/ml的低濃度用量，TEG能夠綜合反映體外循環(huán)時(shí)的凝血狀 況，較ACT全面，可反映凝血機(jī)制中除血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管壁以外的所有出凝血因素。
[0005] 采用全血進(jìn)行檢測(cè)的方法如ACT(活化凝血時(shí)間）和TEG(血栓彈力圖）兩者都 采用體外全血中加入Kaolin(高嶺土）的方法激活凝血途徑，Kaolin對(duì)于血液而言是一 種異物，通過(guò)激活ΧΠ因子促使血液發(fā)生凝固，其途徑為接觸性激活途徑，ACT和TEG為非常 準(zhǔn)確反映藥物預(yù)防接觸性血栓能力的方法，如果用Kaolin刺激血液后不容易發(fā)生凝固，那 么換做其他異物（如濾器、導(dǎo)管、導(dǎo)絲和玻璃管）刺激血液也同樣不容易發(fā)生凝固。因此， Kaolin(高嶺土）在目前的全血檢測(cè)方法如ACT和TEG中具有重要的作用，對(duì)Kaolin在TEG 中應(yīng)用的研究同樣具有很大的前景，因此，對(duì)凝血激活檢測(cè)試劑（凝固法）的研究具有重要 意義，目前卻沒(méi)有相關(guān)的成熟技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種凝血激活檢測(cè)試劑， 用于解決現(xiàn)有技術(shù)中缺乏能夠適用于ACT(活化凝血時(shí)間）、TEG(血栓彈力圖）等方法的凝 血激活檢測(cè)試劑的問(wèn)題。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供一種凝血激活檢測(cè)試 劑，包括如下組分：Tris(三羥甲基氨基甲烷）、穩(wěn)定劑、磷脂酰乙醇胺、高嶺土，穩(wěn)定劑為 PEG3000 或PEG6000。
[0008] 優(yōu)選地，穩(wěn)定劑為PEG3000。
[0009] 進(jìn)一步地，包括如下重量份的組分：Tris(三羥甲基氨基甲烷）121-24200份、穩(wěn)定 劑1-1000份、磷脂酰乙醇胺600-2000份、高嶺土 0. 1-0. 5份。
[0010] 進(jìn)一步地，包括如下重量份的組分：Tris(三羥甲基氨基甲烷）121-12100份、穩(wěn)定 劑1-100份、磷脂酰乙醇胺1000-1400份、高嶺土 0. 3-0. 5份。
[0011] 進(jìn)一步地，包括如下重量份的組分：Tris(三羥甲基氨基甲烷）121份、穩(wěn)定劑10 份、磷脂酰乙醇胺1200份、高嶺土 0. 4份。
[0012] 進(jìn)一步地，高嶺土的細(xì)度彡4000目。
[0013] 進(jìn)一步地，Tris(三羥甲基氨基甲烷）、穩(wěn)定劑、磷脂酰乙醇胺、高嶺土均為市售產(chǎn) 品。
[0014] 本發(fā)明第二方面提供上述凝血激活檢測(cè)試的制備方法，包括如下步驟：
[0015]1)、配制Tris-HCl緩沖液：按配方量稱(chēng)取Tris固體溶于水，充分混勾，調(diào)節(jié)pH值 為7. 35-7. 45,制得Tris-HCl緩沖液，備用；
[0016] 2)、配制穩(wěn)定劑溶液：按配方量稱(chēng)取穩(wěn)定劑，溶于步驟1)制得的Tris-HCl緩沖液 中，制得穩(wěn)定劑溶液，備用；
[0017] 3)、配制磷脂酰乙醇胺溶液：按配方量稱(chēng)取磷脂酰乙醇胺，溶于步驟1)制得的 Tris-HCl緩沖液中，制得磷脂酰乙醇胺溶液，備用；
[0018] 4)、混合液的配制：將步驟2)制得的穩(wěn)定劑溶液與步驟3)制得的磷脂酰乙醇胺溶 液混合，制得混合液，備用；
[0019] 5)、配制含有高嶺土的稀釋液：按配方量稱(chēng)取高嶺土，溶于上述步驟4)制得的混 合液中，加入步驟1)制得的Tris-HCl緩沖液稀釋?zhuān)频煤懈邘X土的稀釋液，備用；
[0020] 6)、真空凍干：將步驟5)制得的稀釋液分裝至試劑杯中，真空凍干，制得凝血激活 檢測(cè)試劑。
[0021] 優(yōu)選地，步驟1)中所述水為蒸餾水或去離子水。
[0022] 更優(yōu)選地，步驟1)中所述水為去離子水，所述去離子水的電阻率為18. 2MQ*cm。
[0023] 優(yōu)選地，步驟1)的Tris-HCl緩沖液中Tris的濃度為0. 01-2mol/L;步驟4)的混 合液中穩(wěn)定劑的終濃度為〇. 〇〇〇l-lg/l〇〇mL，磷脂酰乙醇胺的終濃度為0. 6-2. 0g/100mL; 步驟5)的稀釋液中高嶺土的終濃度為0. 0001-0. 0005g/100mL。
[0024] 更優(yōu)選地，步驟1)的Tris-HCl緩沖液中Tris的濃度為0. 01mol/L;步驟4)的混 合液中穩(wěn)定劑的終濃度為〇. 〇lg/l〇〇mL，磷脂酰乙醇胺的終濃度為1. 2g/100mL;步驟5)的 稀釋液中高嶺土的終濃度為〇. 0004g/100mL。
[0025] 優(yōu)選地，步驟6)中每個(gè)試劑杯分裝的稀釋液體積為20-500μL，每個(gè)試劑杯中高 嶺土的含量為0. 5Χ10 7-2. 5Χ10 7g(即稀釋液中高嶺土的終濃度與分裝至試劑杯的稀釋 液的體積的乘積）。
[0026] 更優(yōu)選地，步驟6)中每個(gè)試劑杯分裝的稀釋液體積為25μL。
[0027] 優(yōu)選地，步驟6)中真空凍干的溫度為_(kāi)50°C至_40°C，真空凍干的時(shí)間為2h以上。
[0028] 本發(fā)明第三方面提供上述凝血激活檢測(cè)試劑在全血檢測(cè)中的用途。
[0029] 本