一種紅豆杉枝葉中10-去乙?；涂ㄍii的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物有效成分質(zhì)量研究技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種紅豆杉枝葉中10-去 乙?；涂ㄍII的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 10-去乙?；涂ㄍII(10-DAB)為紅豆杉中有抑制腫瘤作用的紫杉烷萜類化合 物。它同時是合成多西他賽和紫杉醇的重要原料。紫杉醇是具有抗癌活性的天然二萜類化 合物，其結(jié)構(gòu)新穎、抗癌機理獨特、抗癌效果顯著、抗癌譜廣，對轉(zhuǎn)移性卵巢癌和乳腺癌具有 很好的治療作用，并且對肺癌、食管癌也有一定療效，因此紫杉醇被認(rèn)為是迄今所發(fā)現(xiàn)最好 的抗癌藥物之一，已在40多個國家被批準(zhǔn)上市。然而，紫杉醇供應(yīng)匱乏大大限制了它在臨 床上的應(yīng)用。
[0003]目前，藥用紫杉醇的主要來源是從天然紅豆杉屬植物的根部中提取分離。但由于 該種屬植物數(shù)量少，生長慢，含量低，且提取難度頗大，從長遠(yuǎn)考慮根本無法滿足日益增長 的臨床需求。近年來，紫杉醇類化學(xué)半合成是具有實用價值的一種制備方法，該方法是以紅 豆杉屬植物（以枝葉為主）中提取分離的10-去乙?；涂ㄍII(10-DAB)為前體，通過幾 部反應(yīng)得到紫杉醇，其中10-去乙?；涂ㄍII(10-DAB)為前體的半合成紫杉醇已占據(jù)紫 杉醇銷售總量的2/3。
[0004] 目前，已有研究者研究了紅豆杉中測定10-去乙?；涂ㄍII的方法，CN 103808850Α公開了一種紅豆杉中10-去乙?；涂ㄍII的薄層色譜檢測方法，所述方法 包括如下步驟：（1) 10-去乙?；涂ㄍII對照品溶液制備；（2)樣品溶液制備；（3)薄層 色譜檢測，該方法雖然檢測簡單，但是檢測不準(zhǔn)確，只能進行半定量檢測，不能夠準(zhǔn)備知道 10-去乙?；涂ㄍII含量。浙江大德藥業(yè)集團有限公司研究人員建立紅豆杉中10-DAB 的含量測定（《現(xiàn)在中藥研究與實踐》2013年第27卷第5期11-13頁），但是運用該方法 在含量檢測時，供試品溶液處理時間比較長，并且洗脫方式為梯度洗脫，影響基線的波動較 大，影響了 10-去乙?；涂ㄍII含量測定。
[0005] 因此有必要進一步研究更有效的10-去乙酰基巴卡亭III含量測定方法，新方法的 建立可以幫助我們快速、準(zhǔn)確獲知紅豆杉中10-DAB有效含量，便于我們大規(guī)模從紅豆杉枝 葉提取10-DAB。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足及實際的需求，本發(fā)明提供一種紅豆杉枝葉中10-去乙?；?巴卡亭III的檢測方法，所述檢測方法檢測時間短，檢測限低，操作簡單且能夠準(zhǔn)確的測量紅 豆杉枝葉中10-去乙?；涂ㄍII的含量。
[0007] 為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0008] -方面，本發(fā)明提供一種紅豆杉枝葉中10-去乙?；涂ㄍII的檢測方法，包括 以下步驟：
[0009] (1)制備供試品溶液：將紅豆杉枝葉用有機溶劑浸泡超聲，過濾，得到供試品溶 液；
[0010] ⑵制備對照品溶液：用有機溶劑配制10-去乙?；涂ㄍII對照品，過濾，得到 對照品溶液；
[0011] (3)檢測方法：用高效液相色譜對步驟（1)得到的供試品和步驟（2)得到的對照 品進彳丁檢測。
[0012] 本發(fā)明中，首先，所述檢測方法由于紅豆杉只需要浸泡超聲和過濾兩個環(huán)節(jié)即可 進行檢測，整個過程只需3h即可完成，而相比于現(xiàn)有的色譜檢測方法的檢測時間都需要1 天以上，時間上大大縮短了；其次，本發(fā)明的檢測方法，檢測限低，可以檢測到萬分之二濃度 的10-去乙?；涂ㄍII，且HPLC的特征峰明顯，10-去乙?；涂ㄍII的濃度與峰面積的 線性關(guān)系良好，檢測穩(wěn)定，誤差低。
[0013] 優(yōu)選地，步驟（1)所述的有機溶劑為甲醇。
[0014] 優(yōu)選地，所述甲醇與紅豆杉枝葉的體積質(zhì)量比為（5-12) :1，例如可以是5 :1、6 :1、 7 :1、8 :1、9 :1、10 :1、11 :1 或 12 :1，優(yōu)選為（6-10) :1，進一步優(yōu)選為 8 :1。
[0015] 優(yōu)選地，所述浸泡超聲的時間為80_160min，例如可以是80min、81min、82min、 85min、88min、90min、92min、95min、98min、100min、105min、110min、115min、120min、 125min、130min、135min、140min、145min、150min、155min或 160min，選為 100_150min，進一 步優(yōu)選為120min。
[0016] 本發(fā)明中，所述甲醇溶劑可以溶解部分細(xì)胞壁，加上超聲可以充分破壞細(xì)胞壁， 同時細(xì)胞中的10-去乙?；涂ㄍII可以溶解在甲醇中，故此方法可以提取紅豆杉中的 10-去乙?；涂ㄍII。
[0017] 優(yōu)選地，步驟（2)所述的有機溶劑為甲醇和醋酸的混合液。
[0018] 優(yōu)選地，所述甲醇和醋酸的體積比為（150-300) :1，例如可以是150 :1、151 :1、 152 :1、155 :1、160 :1、165 :1、170 :1、175 :1、180 :1、185 :1、190 :1、195 :1、200 :1、210 :1、 220 :1、230 :1、240 :1、250 :1、260 :1、270 :1、280 :1、290 :1 或 300 :1，優(yōu)選為（180-240) :1， 進一步優(yōu)選為200 :1。
[0019] 優(yōu)選地，步驟（2)所述的對照品的濃度為0· 05-0. 5mg/mL，例如可以是0· 05mg/ mL、0. 06mg/mL、0. 08mg/mL、0.lmg/mL、0. 2mg/mL、0. 3mg/mL、0. 4mg/mL或 0· 5mg/mL，優(yōu)選為 0· 1-0. 3mg/mL，進一步優(yōu)選為 0· 2mg/mL。
[0020] 優(yōu)選地，步驟（3)所述的高效液相色譜中的色譜柱為ShimpackC18分析柱。
[0021] 優(yōu)選地，所述分析柱的規(guī)格為250mmX4. 60mm，5. 0μπι。
[0022] 優(yōu)選地，步驟（3)所述的高效液相色譜檢測時的進樣量為10-20μL，例如可以 是 10yL、llyL、12yL、13yL、14yL、15yL、16yL、17yL、18yL、19yL或 20yL，優(yōu)選為 15-20μL，進一步優(yōu)選為20μL。
[0023] 優(yōu)選地，步驟（3)所述的高效液相色譜檢測時的流動相為水、甲醇和乙腈的混合 溶液。
[0024]優(yōu)選地，所述混合溶液中水、甲醇和乙腈的體積比為（20-35):(5-20):(3-12)，例 如可以是 20 :5 :3、21 :6 :4、22 :7 :5、23 :8 :6、24 :9 :7、25 :10 :8、28 :12 :9、30 :12 :10、31 : 14 :10、32 :16 :11 或 35 :20 :12,優(yōu)選為（25-30) :(10-18) :(5-10)，進一步優(yōu)選為 29 :13 :8。
[0025] 優(yōu)選地，步驟（3)所述的高效液相色譜檢測時的流動相的流速為0. 9-1.lmL/min， 例如可以是0. 9mL/min、lmL/min或1.lmL/min，優(yōu)選為lmL/min。
[0026] 優(yōu)選地，所述高效液相色譜檢測時的洗脫方式為等濃度洗脫。
[0027] 優(yōu)選地，步驟（3)所述的高效液相色譜檢測時的檢測波長為200-250nm，例如可 以是 200nm、20lnm、202nm、205nm、210nm、215nm、220nm、225nm、227nm、228nm、230nm、23lnm、 235nm、236nm、238nm、240nm、245nm或 250nm，優(yōu)選為 210_230nm，進一步優(yōu)選為 228nm。
[0028] 優(yōu)選地，所述的高效液相色譜檢測時的柱溫為25_35°C，例如可以是25°C、26°C、 27°(：、28°(：、29°(：、30°(：、31°(：、32°(：、33°(：、34°(：或35°(：，優(yōu)選為 28-32°(：，進一步優(yōu)選為 3(TC〇
[0029] 作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述紅豆杉枝葉中10-去乙?；涂ㄍII的檢測方法，包括 以下步驟：
[0030] (1)制備供試品溶液：將紅豆杉枝葉用甲醇浸泡超聲80-160min，甲醇與紅豆杉枝 葉的體積質(zhì)量比為（5-12) :1，0.45μm的濾膜過濾，得到供試品溶液；
[0031] (2)制備對照品溶液：用體積比為（150-300) :1的甲醇和醋酸混合液配制10-去 乙?；涂ㄍII對照品，配制的濃度為0. 05-0. 5mg/mL，0. 45μm的濾膜過濾，得到對照品 溶液；
[0032] (3)檢測方法：用高效液相色譜對步驟⑴得到的供試品和步驟⑵得到的對照 品進行檢測，采用色譜柱為ShimpackC18分析柱，規(guī)格為250mmX4. 60mm，5.Ομπι;
[0033] 其中，檢測條件為進樣量為10-20yL，采用流動相為水、甲醇和乙腈的混合溶液， 水、甲醇和乙腈的體積比為（20-35) : (5-20) : (3-12)，流動相的流速為0. 9-1.lmL/min，檢 測波長為200-250nm，柱溫為25-35°C。
[0034] 優(yōu)選地，所述紅豆杉枝葉中10-去乙?；涂ㄍII的檢測方法，包括以下步驟：
[0035] (1)制備供試品溶液：將紅豆杉枝葉用甲醇浸泡超聲120min，甲醇與紅豆杉枝葉 的體積質(zhì)量比為8 :1，0. 45μm的濾膜過濾，得到供試品溶液；
[0036] (2)制備對照品溶液：用體積比為200:1的甲醇和醋酸混合液配制10-去乙?；?巴卡亭III對照品，配制的濃度為0. 2mg/mL，0. 45μm的濾膜過濾，得到對照品溶液；
[0037] (3)檢測方法：用高效液相色譜對步驟⑴得到的供試品和步驟⑵得到的對照 品進行檢測，采用色譜柱為ShimpackC18分析柱，規(guī)格為250mmX4. 60mm，5.Ομπι;
[0038] 其中，檢測條件為進樣量為10-20yL，采用流動相為水、甲醇和乙腈的混合溶液， 水、甲醇和乙腈的體積比為29 :13 :8,流動相的流速為lmL/min，檢測波長為228nm，柱溫為 3(TC〇
[0039] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0040] (1)本發(fā)明的檢測方法由于紅豆杉只需要浸泡超聲和過濾兩個環(huán)節(jié)即可進行檢 測，整個過程只需3h即可完成，而相比于現(xiàn)有的色譜檢測方法的檢測時間都需要1天以上， 時間上大大縮短了；
[0041] (2)本發(fā)明的檢測方法，檢測限低，可以檢測到萬分之二濃度的10-去乙?；涂?亭III，且HPLC的特征峰明顯，10-去乙?；涂ㄍII的濃度與峰面積的線性關(guān)系良好，檢測 穩(wěn)定，誤差低；
[0042] (3)本發(fā)明的檢測方法在準(zhǔn)確度、精密度、線性范圍、中間精密度、耐用性和溶液的 穩(wěn)定性等方面均能達(dá)到要求，采用的分析方法科學(xué)、合理，且所述方法相比于現(xiàn)有方法更快 速、簡便、有效，更大限度減少了每次配制流動相的人為誤差和由于溶劑揮發(fā)所引起的流動 相比例變化的誤差，也解決了基線波動較大的問題。
【附圖說明】
[0043] 圖1是本發(fā)明10-去乙酰基巴卡亭III對照品高效液相色譜圖；
[0044] 圖2是本發(fā)明紅豆杉供試品溶液高效液相色譜圖；
[0045] 圖3是本發(fā)明10-去乙酰基巴卡亭III對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實施方式】
[0046] 為更進一步闡述本發(fā)明所采取的技術(shù)手段及其效果，以下結(jié)合附圖并通過具體實 施方式來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明并非局限在實施例范圍內(nèi)。
[0047] 本發(fā)明所用的儀器與試劑如下：
[0048] 儀器：高效液相色譜儀：Agilent1200;電子天平：梅特勒（型號：XS105du);