r>[0079] 按照上述方法制備供試品、對照品溶液，進行高效液相色譜檢測，結果如圖7所 示。通過圖7中的檢測結果可以看出，該條件下能夠有效分離出6個雜質（A-F)和莫沙必 利主峰，其分離度均大于1. 5,峰形對稱，響應值較高，檢測靈敏度好，其中通過對照品對應 保留時間可以看出，A峰為枸櫞酸，B峰為枸櫞酸酰化莫沙必利，C峰為452苯甲酸，D峰為 脫氟莫沙必利，1為莫沙必利，E為452苯甲酸乙酯，F(xiàn)為452苯甲酸異丁酯。
[0080] 實施例八枸櫞酸莫沙必利的有關物質的檢測
[0081] 供試品溶液制備：取適量枸櫞酸莫沙必利，精密稱定，用流動相溶解并定量稀釋制 成每1ml中含1.0 mg的溶液。
[0082] 高效液相色譜檢測條件：0· OlM磷酸二氫鈉溶液（0· 1 %三乙胺，pH = 6. 0):乙腈 為75 :25為流動相A，0.0 lM磷酸二氫鈉溶液（0. 1%三乙胺，pH = 4. 0):乙腈為20 :80為流 動相B米用梯度洗脫。
[0084] 流速：lml/min ;檢測波長：220nm ;柱溫：35°C，進樣體積為10 μ 1。
[0085] 按照上述方法制備供試品溶液，進行高效液相色譜檢測，結果如圖8所示，該梯度 下整個出峰時間滯后，檢測時間延長，雜質檢出個數(shù)少，且色譜峰響應值低，檢測靈敏度低。
[0086] 實施例九枸櫞酸莫沙必利的有關物質的檢測
[0087] 供試品溶液制備：取適量枸櫞酸莫沙必利，精密稱定，用流動相溶解并定量稀釋制 成每1ml中含1.0 mg的溶液。
[0088] 高效液相色譜檢測條件：0. 05Μ磷酸二氫鈉溶液（0. 3 %三乙胺，pH = 3. 5):乙腈 為75:25為流動相4,0.051磷酸二氫鈉溶液（0.3%三乙胺，？!1=3.5) :乙腈為20:80為流 動相B米用梯度洗脫。
[0089]
[0090] 流速：lml/min ;檢測波長：220nm ;柱溫：35°C，進樣體積為10 μ 1。
[0091] 按照上述方法制備供試品溶液，進行高效液相色譜檢測，結果如圖9所示，其基線 雖有一定波動，但仍然能有效分離出枸櫞酸莫沙必利中的A-F共6個雜質和1個莫沙必利 主峰，且響應值較高，靈敏度好。
[0092] 實施例十枸櫞酸莫沙必利的有關物質的檢測
[0093] 供試品溶液制備：取適量枸櫞酸莫沙必利，精密稱定，用流動相溶解并定量稀釋制 成每1ml中含1.0 mg的溶液。
[0094] 莫沙必利對照品溶液制備：取莫沙必利對照品適量，加流動相B稀釋制成每1ml溶 液約含莫沙必利對照品1.0 mg的溶液。
[0095] 高效液相色譜檢測條件：0· OlM磷酸二氫鈉溶液（0· 1 %三乙胺，pH = 3. 5):乙腈 為75 :25為流動相A，0.0 lM磷酸二氫鈉溶液（0. 1%三乙胺，pH = 3. 5):乙腈為20 :80為流 動相B米用梯度洗脫。
[0097] 流速：lml/min ;檢測波長：220nm ;柱溫：35°C，進樣體積為10 μ 1。
[0098] 分別精密量取6份樣品IOul進行高效液相色譜檢測，結果如圖10所示，圖中6份 樣品出峰時間一致，峰面積一致，表明該方法重現(xiàn)性良好，檢測結果穩(wěn)定。
[0099] 實施例^^一枸櫞酸莫沙必利中雜質F、G的結構確認
[0100] 從實施例7中結果可以看出，本申請中檢測方法能夠有效檢測A-F共6個雜質，其 中雜質E、F目前尚未見枸櫞酸莫沙必利有關物質的檢測中報道。通過LC-MS分析，進一步 確證其結構，確證過程如下：
[0101] 測試儀器：Agilent Infinityl290 (CA, USA)與 Finnigan LTQ Ion Trap Mass Spectrometer (San Jose, CA, USA)聯(lián)用，軟件分別為 Agilent Chemstation 和 Xcalibur。
[0102] 質譜條件：質譜儀流速為0. 2ml/min。電噴霧電離，正離子模式檢測，氮氣作為鞘 氣、輔助氣和吹掃氣。噴霧電壓3. 6kV :鞘氣為15arb，輔助氣為5arb，吹掃氣為Oarb ;毛細 管溫度：275°C，毛細管電壓為10V，透鏡電壓為80V。全掃描質量范圍：150-400amu。二級質 譜用數(shù)據依賴模式采集，全掃描圖譜中響應度強度最高的1個峰用于二級質譜分析，高純 氦氣用作碰撞氣，碰撞能量為35ev。
[0103] 對實施例7中液相色譜條件得到的樣品分離結果和對照品E、F分別進行質譜檢 測，得到的總粒子流質譜圖譜見圖11。
[0104] 1、雜質E(452苯甲酸乙酯）的結構確證
[0105] 對圖10中數(shù)據進行分析，其中RT = 19. 76時峰為雜質E，其質譜圖見圖12,數(shù)據 分析結果見表1。
[0106] 表1雜質E對照品質譜測定數(shù)據
[0108] 樣品的分子離子峰與對照品化合物結構相吻合，其結構與對照品452苯甲酸乙酯 結構一致。
[0109] 2、雜質F(452苯甲酸異丁酯）的結構確證
[0110] 對圖10中數(shù)據進行分析，其中RT = 26.27時峰為雜質F，其質譜圖見圖13,數(shù)據 分析結果見表2。
[0111] 表2雜質F對照品質譜測定數(shù)據
[0113] 樣品的分子離子峰與對照品化合物結構相吻合，其結構與對照品452苯甲酸異丁 酯結構一致。
【主權項】
1. 一種枸櫞酸莫沙必利有關物質的檢測方法，其包含以下步驟：取枸櫞酸莫沙必利供 試品溶液進樣，按照液相色譜條件進行檢測，其中所述高效液相色譜測定條件為：色譜柱： 十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相A為體積比為75 :25的磷酸二氫鈉溶液/乙腈的混 合溶液，流動相B為體積比為20:80的磷酸二氫鈉溶液/乙腈的混合溶液，采用梯度洗脫。2. 根據權利要求1所述的枸櫞酸莫沙必利有關物質的檢測方法，其中所述梯度洗脫程 序為：3. 根據權利要求1所述的供枸櫞酸莫沙必利有關物質的檢測方法，其中所述高效液相 色譜測定條件中，磷酸二氫鈉溶液濃度為0. 001-0.lmol/L，優(yōu)選為0. 01-0. 05mol/L，更優(yōu) 選為 0· 01mol/L。4. 根據權利要求1所述的枸櫞酸莫沙必利有關物質的檢測方法，其中所述高效液相色 譜測定條件中，磷酸二氫鈉溶液的pH值為2. 0-6. 0,優(yōu)選為3. 5,所述磷酸二氫鈉溶液的pH 調節(jié)試劑優(yōu)選為H3P04。5. 根據權利要求1所述的枸櫞酸莫沙必利有關物質的檢測方法，其中所述高效液相色 譜測定條件中，檢測波長為210~360nm，優(yōu)選為220nm。6. 根據權利要求1所述的高效液相色譜測定條件中柱溫為15-40°C，優(yōu)選為35°C;流 速為 0· 5-1. 5ml/min,優(yōu)選為lml/min〇7. 根據權利要求1所述的枸櫞酸莫沙必利有關物質的檢測方法，其中所述高效液相色 譜測定條件中，流動相A和B中還含有三乙胺，所述三乙胺的體積濃度為0. 01 % -1 %，優(yōu)選 為0. 1% -0. 3%，更優(yōu)選為0. 1%。8. 根據權利要求1所述的枸櫞酸莫沙必利有關物質的檢測方法，其中所述供試品溶液 的制備方法為，取適量枸櫞酸莫沙必利，精密稱定，加流動相B溶解并稀釋制成每lml約含 lmg的溶液即得。9. 根據權利要求1-8中任意一項所述的枸櫞酸莫沙必利有關物質的檢測方法，其包含 以下步驟： (a) 供試品溶液的制備： 取適量枸櫞酸莫沙必利，精密稱定，加流動相B溶解并稀釋制成每lml約含lmg的溶液 即得； (b) 色譜條件：色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，流動相A為體 積比為75 :25的磷酸二氫鈉溶液/乙腈的混合溶液，流動相B為體積比為20:80的磷酸二 氫鈉溶液/乙腈的混合溶液，柱溫為350°C，流速為lml/min，檢測波長為220nm，所述梯度洗 脫程序為：其中，所述流動相A和流動相B中的磷酸二氫鈉溶液中含有體積濃度為0. 1%的三乙 胺，并用磷酸調PH值至3. 5。 (c)測定：吸取供試品溶液注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種枸櫞酸莫沙必利有關物質的檢測方法，該方法包括，通過高效液相色譜法，采用梯度洗脫方法，對藥物組合物中的相關物質進行檢測，該檢測方法檢出雜質個數(shù)最多，分離度較好，且響應值高，靈敏度好。
【IPC分類】G01N30/02
【公開號】CN105301118
【申請?zhí)枴緾N201410312949
【發(fā)明人】柯瀟, 鄔智剛, 林楠
【申請人】成都康弘藥業(yè)集團股份有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2014年7月2日