量依賴關(guān)系。山銀花口炎清對(duì)TNF-a升高的抑制作用明顯強(qiáng)于金銀花口炎清，在濃度2、3組中二者的抑制作用具有顯著性差異(P〈0.01，Ρ〈0.05)。圖10實(shí)驗(yàn)結(jié)果以mean土S.D表示。與正常組比較，##Ρ〈0.01 ;與模型組比較，*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01 ;兩組之間比較，ΔΡ〈0.05，Δ ΔΡ〈0.01。
[0071](2)抗炎因子IL-10水平
[0072]由圖11可知:在6% CSE刺激24h后，KB細(xì)胞抗炎因子E-10分泌量顯著降低。而金銀花口炎清、山銀花口炎清對(duì)CSE刺激引起的IL-10分泌減少都具有改善作用，且呈劑量依賴關(guān)系。山銀花口炎清對(duì)IL-10分泌的促進(jìn)作用強(qiáng)于金銀花口炎清，且均有顯著性差異(Ρ〈0.05)。圖11實(shí)驗(yàn)結(jié)果以mean土S.D表示。與正常組比較，##Ρ〈0.01 ;與模型組比較，*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01 ;兩組之間比較，ΔΡ〈0.05。
[0073](3)促炎因子IL-8水平
[0074]由圖12可知:在6% CSE刺激24h后，KB細(xì)胞促炎因子E-8蛋白水平顯著升高。而金銀花口炎清、山銀花口炎清都能抑制CSE誘導(dǎo)的IL-8表達(dá)水平上升。并且山銀花口炎清的抑制作用均強(qiáng)于金銀花口炎清，在濃度1、3、4組中二者的作用具有顯著差異(P〈0.01，Ρ〈0.05)。
[0075]圖12實(shí)驗(yàn)結(jié)果以mean土S.D表示。與正常組比較，##Ρ〈0.01 ;與模型組比較，*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01 ;兩組之間比較，ΔΡ〈0.05，Δ ΔΡ〈0.01。
[0076](4)促炎因子IL-6水平
[0077]由圖13可知:在6% CSE刺激24h后，KB細(xì)胞促炎因子IL_6分泌量顯著升高。而金銀花口炎清、山銀花口炎清對(duì)CSE誘導(dǎo)的IL-6分泌都具有抑制作用，且呈劑量依賴關(guān)系。山銀花口炎清的抑制作用均強(qiáng)于金銀花口炎清。圖13實(shí)驗(yàn)結(jié)果以mean土S.D表示。與正常組比較，##Ρ<0.01 ;與模型組比較，**Ρ〈0.01。
[0078]4、小結(jié)
[0079]本實(shí)驗(yàn)首先采用了一種穩(wěn)定便捷的香煙煙霧提取物溶液制備方法，這種方法和其他大型制備裝置相比，香煙煙霧能更充分溶于培養(yǎng)液中，香煙煙霧提取溶液質(zhì)量均一穩(wěn)定，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程具有很好的可操作性和重復(fù)性。由于香煙煙霧提取溶液完成后最好在一小時(shí)內(nèi)使用，而采用大型裝置提取的香煙煙霧提取溶液量比較大，容易造成浪費(fèi)和實(shí)驗(yàn)誤差，采取本實(shí)驗(yàn)的方法在節(jié)約資源，避免浪費(fèi)的同時(shí)，使實(shí)驗(yàn)更為精確可靠。使用50ml注射器重復(fù)抽取六次共300ml煙霧，劇烈搖晃使煙霧充分混勻于10ml培養(yǎng)基中，并用紫外分光光度法檢測(cè)320nm處波長(zhǎng)的方法，對(duì)香煙煙霧提取物溶液的質(zhì)量進(jìn)行全面驗(yàn)證，以保證制備的香煙提取物質(zhì)量穩(wěn)定，確保模型組數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。
[0080]此外，通過(guò)MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，考察了濃度梯度的CSE及各樣品對(duì)KB細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果表明，6%的CSE劑量對(duì)于KB細(xì)胞的存活率沒(méi)有顯著影響，可以用于造模。而各樣品不同濃度對(duì)KB細(xì)胞活性影響的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在1000 μ g/ml及以下的劑量時(shí)，各樣品對(duì)KB細(xì)胞的存活率都不會(huì)產(chǎn)生顯著影響。
[0081]在炎癥誘發(fā)的免疫應(yīng)答過(guò)程中，細(xì)胞因子起著重要的調(diào)節(jié)作用，如促炎細(xì)胞因子IL-8、IL-6、TNF-α，以及抗炎癥因子IL-10等。在本實(shí)驗(yàn)中，用6% CSE刺激KB細(xì)胞24h后，可以顯著誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)炎性因子TNF-a、IL-6, IL-8和IL-10分泌，造成急性口腔炎癥模型效果顯著。隨后，利用此模型對(duì)金銀花、山銀花的抗炎作用進(jìn)行了分析和比較，結(jié)果表明金銀花和山銀花對(duì)TNF-a、IL-6和IL-10的調(diào)控作用均具有顯著差異，山銀花的作用強(qiáng)于金銀花；同時(shí)也考察了分別以金銀花和山銀花為原料的復(fù)方制劑口炎清顆粒，結(jié)果顯示以山銀花為原料的口炎清對(duì)炎性因子TNF-a、IL-6, IL-8和IL-10的調(diào)控作用顯著強(qiáng)于金銀花口炎清，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明利用本方法可以對(duì)金銀花、山銀花以及成方制劑中金銀花、山銀花的使用情況進(jìn)行區(qū)分，同時(shí)所得結(jié)果與抗炎活性直接相關(guān)聯(lián)，對(duì)指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。
[0082]二、鑒別實(shí)驗(yàn)
[0083](一 )鑒別六批次金銀花或山銀花原材料。
[0084]取金銀花原材料和山銀花原材料各3批次，按本【具體實(shí)施方式】第一部分2.2項(xiàng)下制備供試樣品和山銀花標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品。香煙提取物刺激人口腔表皮樣癌細(xì)胞(KB細(xì)胞)，構(gòu)建急性口腔炎癥模型。將KB細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPM1-1640完全培養(yǎng)基(pH 7.2，青霉素100U/ml，鏈霉素100 μ g/ml)中，在37°C、5% C02培養(yǎng)箱中孵育；用含10%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔5000個(gè)細(xì)胞接種到24孔板；培養(yǎng)24h，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%密度時(shí)，以含供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的無(wú)FBS培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，預(yù)處理30分鐘后用6% CSE刺激KB細(xì)胞造模。細(xì)胞給藥24h后收集細(xì)胞上清，4°C下1500rpm離心5min后，棄去底部沉淀留上清，按試劑盒說(shuō)明采用Elisa法測(cè)定IL-6、IL_8、TNF- α和IL-10含量。比較含量結(jié)果表明，3批山銀花原材料的IL-6、IL-8、TNF-α和IL-10含量與標(biāo)準(zhǔn)品無(wú)顯著差別，3批金銀花原材料的TNF- α含量與標(biāo)準(zhǔn)品有顯著差別，且IL-6和IL-8含量的差別顯著。因此，可以驗(yàn)證本發(fā)明方法可行。
[0085]( 二 )鑒別三批次口炎清顆粒。
[0086]取三批次口炎清顆粒，由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司提供。以確定含山銀花的口炎清顆粒制備標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，參照(一)所述的方法進(jìn)行鑒別，結(jié)果顯示，三批次口炎清顆粒的IL-6、IL-8、TNF-a和IL-10含量與標(biāo)準(zhǔn)品無(wú)顯著差別，可判斷，此三批次口炎清顆粒中的原材料使用的是山銀花，符合用藥要求。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種區(qū)分金銀花和山銀花的鑒別方法，其特征在于包括以下步驟: (1)以山銀花或以山銀花為原料的制劑為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，制備對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品； (2)構(gòu)建急性口腔炎癥模型； (3)比較供試品和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)急性口腔炎癥模型細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10表達(dá)水平的影響；若供試品與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品相比，包括TNF-a表達(dá)水平在內(nèi)，有三種或以上的炎癥因子調(diào)控作用顯著弱于對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，則判斷該供試品為金銀花或以金銀花為原料的制劑；沒(méi)有顯著性差異，則認(rèn)為是山銀花或以山銀花為原料的制劑。2.如權(quán)利要求1所述的鑒別方法，其特征在于所述的步驟(1)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法具體為:參照《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版口炎清顆粒標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)工藝，制備原料浸膏后制備對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品。3.如權(quán)利要求1所述的鑒別方法，其特征在于，所述步驟(2)中急性口腔炎癥模型的構(gòu)建方法為:用香煙提取物刺激人口腔表皮樣癌細(xì)胞，構(gòu)建急性口腔炎癥模型。4.如權(quán)利要求3所述的鑒別方法，其特征在于: 所述香煙提取物的制備方法為:抽取適量充分燃燒的香煙煙霧，使其完全溶于無(wú)血清RPM1-1640培養(yǎng)基，用0.22 μ m濾膜過(guò)濾，除菌，制備100%香煙煙霧提取物； 所述香煙提取物刺激人口腔表皮樣癌細(xì)胞，造成急性口腔炎癥模的具體方法為:將人口腔表皮樣癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPM1-1640完全培養(yǎng)基中，在37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱中孵育；用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，接種到孔板；培養(yǎng)24h，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%密度時(shí)，以含對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品或供試品的無(wú)胎牛血清培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，預(yù)處理30分鐘后用6 %的香煙提取物刺激人口腔表皮樣癌細(xì)胞造模，繼續(xù)孵育24小時(shí)，終止培養(yǎng)，用孔內(nèi)上清液進(jìn)行檢測(cè)所述炎癥因子的水平。5.如權(quán)利要求1所述的鑒別方法，其特征在于所述的步驟(3)中炎癥因子TNF-a、IL-6、IL-8和IL-10表達(dá)水平的測(cè)定方法為:用Elisa試劑盒檢測(cè)所述炎癥因子TNF-a、IL-6、IL-8 和 IL-10 的濃度。6.如權(quán)利要求1或3或4或5所述的鑒別方法，其特征在于，所述的山銀花為原料的制劑包括口炎清顆粒或其他口炎清制劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種區(qū)分金銀花和山銀花的鑒別方法，包括以下步驟：以山銀花或含山銀花原料的制劑為對(duì)照；構(gòu)建急性口腔炎癥模型；通過(guò)比較供試品和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)急性口腔炎癥模型細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10表達(dá)水平的影響，鑒別區(qū)分金銀花和山銀花或其復(fù)方制劑。利用該方法不僅可以對(duì)金銀花、山銀花藥材進(jìn)行區(qū)分，還可以對(duì)復(fù)方成方制劑中金銀花、山銀花的使用情況進(jìn)行鑒別。本方法技術(shù)穩(wěn)定，鑒別標(biāo)準(zhǔn)與藥效直接相關(guān)聯(lián)，對(duì)指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。
【IPC分類】G01N33/68
【公開號(hào)】CN105277721
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510665071
【發(fā)明人】蘇薇薇, 李楚源, 賀利利, 王德勤, 李泮霖, 朱東海, 吳忠
【申請(qǐng)人】廣州白云山和記黃埔中藥有限公司, 中山大學(xué)
【公開日】2016年1月27日
【申請(qǐng)日】2015年10月14日