即使用山銀花，配比為，山銀花:玄參:麥冬:天冬:甘草為26:21:21:21:11，含金銀花的口炎清顆粒用金銀花代替山銀花制得。給藥時用培養(yǎng)基配成不同濃度的溶液。
[0040]2.3細胞培養(yǎng)
[0041]將KB細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPM1-1640完全培養(yǎng)基(pH 7.2，青霉素100U/ml，鏈霉素100 μ g/ml)中，在37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱中孵育。
[0042](1)傳代:用吸管吸棄舊培養(yǎng)基，更換吸管，于非細胞培養(yǎng)面加入等量磷酸鹽緩沖液(PBS)，輕輕搖晃使其覆蓋整個瓶底，吸棄PBS，更換吸管，重復(fù)洗滌一次；加入少量細胞消化液，37°C鏡下觀察消化；當細胞明顯回縮后，加入少量新鮮細胞培養(yǎng)基終止消化，輕柔吹打底面2?3次后收集所有液體入新離心管中；1200轉(zhuǎn)/分鐘離心8分鐘，棄上清，細胞沉淀用適量新鮮培養(yǎng)基懸?。患尤氲叫屡囵B(yǎng)瓶中，標記瓶號與細胞批次。
[0043](2)鋪板:MTT測定時用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1 X 104個/mL，并鋪96孔板，每孔200 μ L ;ELISA測定時用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為4 X 105個/mL，并鋪24孔板，每孔
0.5mL。細胞培養(yǎng)24h后，待密度至80%可給藥。
[0044]2.4CSE及各樣品對KB細胞存活率的影響
[0045]取生長狀態(tài)良好的KB細胞，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔1000 - 10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200 μ 1，在37°C、5% C02條件下培養(yǎng)1_2天；實驗前，將培養(yǎng)板中舊的培養(yǎng)基移除，換成新鮮的無血清RPM1-1640培養(yǎng)基處理過夜。將100%香煙煙霧提取物用無血清RPM1-1640培養(yǎng)基稀釋成一系列梯度的CSE溶液(1%、5%,10%,15%,20%,25%,50%,75% )，金銀花浸膏、山銀花浸膏、金銀花口炎清浸膏及山銀花口炎清浸膏配制成一系列梯度溶液(1 μ g/ml、10 μ g/ml、100 μ g/ml、1000 μ g/ml)后加入96孔板的細胞中，37°C、5% C02條件下孵育24h ;每孔加入MTT溶液(5mg/ml用pH =7.4的PBS配制)20 μ L，37°C培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h，棄去上清后每孔加入200 μ L DMSO，然后將96孔板置于搖床上輕微搖動5min使紫色結(jié)晶充分溶解，用超微量紫外/可見光分光光度計于490nm波長下檢測96孔板的0D值?？疾鞚舛忍荻鹊腃SE對KB細胞的毒性，根據(jù)公式:存活率=給藥組0D值/空白組0D值，可計算出相應(yīng)的存活率。
[0046]2.5考察各藥物對香煙提取物誘導(dǎo)的急性口腔炎癥的抗炎作用
[0047](1)細胞培養(yǎng)及藥物處理
[0048]將KB細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPM1-1640完全培養(yǎng)基(pH 7.2，青霉素100U/ml，鏈霉素100 μ g/ml)中，在37°C、5% C02培養(yǎng)箱中孵育；用含10%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔5000個細胞接種到24孔板；培養(yǎng)24h，待細胞長至80%密度時，以含各藥物的無FBS培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，預(yù)處理30分鐘后用6% CSE刺激KB細胞造模。
[0049]實驗共設(shè)置空白對照組、模型組CSE)、陽性對照組(1 μΜ地塞米松)、金銀花浸膏不同劑量組(0.1532，1.532，15.32,153.19,306.38,612.77 μ g/ml)、山銀花浸膏不同劑量組(0.1645，1.645，16.45，164.54，329.08，658.16 μ g/ml)、金銀花口 炎清不同劑量組(0.822，8.22，82.2,822.2 μ g/ml)、山銀花口炎清不同劑量組(1，10，100，1000 μ g/ml)。
[0050](2)樣品中IL-6、IL-8、TNF-α和IL-10蛋白含量檢測
[0051]細胞給藥24h后收集細胞上清，4°C下1500rpm離心5min后，棄去底部沉淀留上清，按試劑盒說明采用Elisa法測定IL-6、IL_8、TNF-α和IL-10含量，實驗具體方法為:首先，設(shè)標準曲線蛋白孔，每孔依次加入不同濃度的標準蛋白溶液(1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.2pg/ml、15.6pg/ml、標準蛋白稀釋液)100 μ 1 ;其次，加樣孔中每孔加入100 μ 1樣品蛋白，每個樣品設(shè)置6個重復(fù)孔，加樣后標記，酶標板覆膜，37°C下孵育2h ;棄去孔內(nèi)液體，甩干，不用洗滌；每孔加100 μ L提前配好的檢測工作液A，孵育lh ;棄去孔內(nèi)液體，用自動洗板機重復(fù)洗板3次，洗完后把孔內(nèi)的洗滌液盡量甩干；每孔加100 μ 1提前配好的檢測工作液Β，溫育30min ;棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次；酶標板內(nèi)每孔加入底物反應(yīng)溶液90 μ L，37°C避光待其標準蛋白溶液顯色(反應(yīng)時間在15-25min之間)，當標準蛋白孔的前4個孔顏色出現(xiàn)明顯梯度，后4個孔也出現(xiàn)明顯藍色時，即可終止；每孔小心加入反應(yīng)終止液50 μ 1，避免產(chǎn)生氣泡影響光密度測量，此時藍色的溶液轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色；立即用多孔酶標儀測量Α450下的的光密度(0.D值)。
[0052](3)統(tǒng)計分析
[0053]使用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計分析實驗結(jié)果，采用方差分析法對不同給藥組間差異進行統(tǒng)計分析，各組實驗結(jié)果均以平均數(shù)土標準差(mean土S.D)表示，p〈0.05說明兩者間有顯著性差異，P〈0.01說明兩者間有極顯著性差異。
[0054]3、實驗結(jié)果
[0055]3.1CSE及各樣品對KB細胞存活率的影響。
[0056]由圖1可知:1% CSE刺激KB細胞24h后與空白組沒有顯著區(qū)別，存活率為0.98 ；10% CSE條件下，KB細胞的存活率下降至0.79，與空白組有極顯著差異(**P〈0.01)，更高濃度CSE刺激下細胞存活率持續(xù)降低。由圖2、3、4、5可知:各樣品的系列梯度溶液對KB細胞的存活率并無明顯影響。
[0057]實驗結(jié)果小結(jié):四種樣品對KB細胞均無毒性，CSE在10%濃度時對KB細胞有明顯毒性。
[0058]3.2利用CSE誘導(dǎo)急性口腔炎癥模型考察金銀花、山銀花的抗炎活性差異
[0059](1)促炎因子TNF-α水平
[0060]由圖6可知:在6% CSE刺激24h后，KB細胞促炎因子TNF-α蛋白表達量顯著增加，模型組蛋白表達量是空白組的5倍，說明造模成功。金銀花、山銀花對TNF-a的分泌都具有抑制作用，且呈劑量依賴關(guān)系。整體看來，山銀花對TNF-a升高的抑制作用強于金銀花，在濃度3、4、5、6組中二者的抑制作用具有顯著性差異(P〈0.01，P〈0.05)。圖6的實驗結(jié)果以mean土S.D表示。與正常組比較，##P<0.01 ;與模型組比較，**P<0.01 ;兩組之間比較，ΔΡ〈0.05，Δ ΔΡ〈0.01。
[0061](2)抗炎因子IL-10水平
[0062]由圖7可知:在6% CSE刺激24h后，KB細胞抗炎因子IL-10分泌量顯著降低。而金銀花、山銀花對CSE刺激引起的IL-10分泌減少都具有改善作用，且呈劑量依賴關(guān)系。山銀花對IL-10分泌的促進作用均強于金銀花，在濃度6組中二者的作用具有顯著性差異(Ρ〈0.05)。
[0063]圖7實驗結(jié)果以mean土S.D表示。與正常組比較，##Ρ〈0.01 ;與模型組比較，*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01 ;兩組之間比較，ΔΡ〈0.05。
[0064](3)促炎因子IL-6水平
[0065]由圖8可知:在6% CSE刺激24h后，KB細胞促炎因子E-6分泌量顯著升高。而金銀花、山銀花對CSE誘導(dǎo)的IL-6分泌都具有抑制作用，且呈劑量依賴關(guān)系。并且山銀花的抑制作用均強于金銀花，在濃度6組中二者的作用具有極顯著差異(P〈0.01)。圖8實驗結(jié)果以mean土S.D表示。與正常組比較，##Ρ<0.01 ;與模型組比較，*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01 ;兩組之間比較，Δ ΔΡ〈0.01。
[0066](4)促炎因子IL-8水平
[0067]由圖9可知:在6% CSE刺激24h后，KB細胞促炎因子IL-8蛋白水平顯著升高。而金銀花、山銀花都能抑制CSE誘導(dǎo)的IL-8表達水平上升。濃度5、濃度6組對IL-8升高有顯著抑制作用(Ρ〈0.05)。圖9實驗結(jié)果以mean土S.D表示。與正常組比較，##Ρ<0.01 ；與模型組比較，*Ρ〈0.05。
[0068]3.2分別以金銀花和山銀花為原料的口炎清顆粒對CSE誘導(dǎo)急性口腔炎癥的抗炎活性差異。
[0069](1)促炎因子TNF-α水平
[0070]由圖10可知:在6% CSE刺激24h后，KB細胞促炎因子TNF_ α蛋白表達量顯著增加，模型組蛋白表達量是空白組的5倍，說明造模成功。金銀花口炎清、山銀花口炎清對TNF-a的分泌都具有抑制作用，且呈劑