一種區(qū)分金銀花和山銀花的鑒別方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從藥效學(xué)角度區(qū)分金銀花和山銀花的鑒別方法。
【背景技術(shù)】
[0002]金銀花和山銀花自2005版《中華人民共和國(guó)藥典》起分列為兩種藥材。由于二者原植物種屬相近、藥材外觀形態(tài)相似，難以區(qū)分，因此市場(chǎng)上金銀花和山銀花藥材品種混亂、來(lái)源不清、質(zhì)量良莠不齊的現(xiàn)象極為突出，進(jìn)而直接影響到藥材及其制劑的療效。
[0003]現(xiàn)有的金銀花、山銀花品種鑒別方法均存在一些不足之處，如傳統(tǒng)的外觀形態(tài)鑒別依賴經(jīng)驗(yàn)、主觀性大；化學(xué)成分分析法對(duì)幾種主要化學(xué)成分進(jìn)行檢測(cè)，難以體現(xiàn)藥材整體質(zhì)量；DNA分子鑒定法技術(shù)復(fù)雜、成本高，結(jié)果重復(fù)性差。這些方法雖然可以在一定程度上對(duì)近緣品種進(jìn)行區(qū)分，但無(wú)法對(duì)藥效的優(yōu)劣進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0004]同時(shí)，金銀花是許多中藥方劑的原料藥材，現(xiàn)有方法很難對(duì)中藥制劑中原料的投料情況進(jìn)行考察。口炎清顆粒由山銀花、玄參、麥冬、天冬、甘草5味藥材組成，臨床用于治療陰虛火旺的口腔炎癥疾病。
[0005]本發(fā)明克服上述技術(shù)的不足，首次采用口腔炎癥模型，從藥效作用方面對(duì)金銀花、山銀花進(jìn)行評(píng)價(jià)和區(qū)分；并對(duì)以金銀花和山銀花為原料的口炎清復(fù)方制劑進(jìn)行鑒別。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種以抗炎藥效學(xué)為判斷指標(biāo)，從藥效作用方面區(qū)別金銀花和山銀花的鑒別方法。方法同樣適用于區(qū)別以金銀花或山銀花為原料的復(fù)方制劑，特別是口炎清顆?；蚱渌谘浊鍙?fù)方制劑。
[0007]本發(fā)明包括以下步驟:
[0008](1)以山銀花或以山銀花為原料的制劑為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，制備對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品；
[0009](2)構(gòu)建急性口腔炎癥模型；
[0010](3)比較供試品和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)急性口腔炎癥模型細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-10表達(dá)水平的影響；若供試品與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品相比，包括TNF-α表達(dá)水平在內(nèi)，有三種或以上的炎癥因子調(diào)控作用顯著弱于對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，則判斷該供試品為金銀花或以金銀花為原料的制劑；沒(méi)有顯著性差異，則認(rèn)為是山銀花或以山銀花為原料的制劑。
[0011]所述對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法建議參照《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版口炎清顆粒標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)工藝，制備原料浸膏后制備對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，和供試品。
[0012]所述急性口腔炎癥模型的方法可用香煙提取物刺激人口腔表皮樣癌細(xì)胞，造成急性口腔炎癥模型。具體為抽取適量充分燃燒的香煙煙霧，使其完全溶于無(wú)血清RPM1-1640培養(yǎng)基，用0.22 μ m濾膜過(guò)濾，除菌，制備100%香煙煙霧提取物待用。
[0013]然后將人口腔表皮樣癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPM1-1640完全培養(yǎng)基中，在37°C、5% C02培養(yǎng)箱中孵育；用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，接種到孔板；培養(yǎng)24h，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%密度時(shí)，以含對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品或供試品的無(wú)胎牛血清培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，預(yù)處理30分鐘后用6%的香煙提取物刺激人口腔表皮樣癌細(xì)胞造模，繼續(xù)孵育24小時(shí)，終止培養(yǎng)，用孔內(nèi)上清液，用Elisa試劑盒進(jìn)行檢測(cè)所述炎癥因子的濃度。
[0014]本發(fā)明采用細(xì)胞學(xué)方法，可以從藥效作用層面對(duì)金銀花、山銀花以及成方制劑中金銀花、山銀花的使用情況進(jìn)行區(qū)分。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)所得結(jié)果與抗炎活性直接相關(guān)聯(lián)，更能直接、地監(jiān)控生產(chǎn)過(guò)程中原料藥材、半成品、成品的質(zhì)量，對(duì)指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1是CSE對(duì)KB細(xì)胞存活率的影響(η = 6)。
[0016]圖2是金銀花對(duì)ΚΒ細(xì)胞存活率的影響(η = 6)。
[0017]圖3是山銀花對(duì)ΚΒ細(xì)胞存活率的影響(η = 6)。
[0018]圖4是口炎清(金銀花)對(duì)ΚΒ細(xì)胞存活率的影響(η = 6)。
[0019]圖5是口炎清(山銀花)對(duì)ΚΒ細(xì)胞存活率的影響(η = 6)。
[0020]圖6是金銀花和山銀花的抗炎活性差異試驗(yàn)中ΚΒ細(xì)胞炎性因子TNF- α蛋白表達(dá)量(n = 6) ο
[0021]圖7是金銀花和山銀花的抗炎活性差異試驗(yàn)中ΚΒ細(xì)胞炎性因子IL-10蛋白表達(dá)量(n = 6) ο
[0022]圖8是金銀花和山銀花的抗炎活性差異試驗(yàn)中ΚΒ細(xì)胞炎性因子IL-6蛋白表達(dá)量(n = 6) ο
[0023]圖9是金銀花和山銀花的抗炎活性差異試驗(yàn)中ΚΒ細(xì)胞炎性因子IL-8蛋白表達(dá)量(n = 6) ο
[0024]圖10是以金銀花和山銀花為原料的口炎清顆?？寡谆钚圆町愒囼?yàn)中ΚΒ細(xì)胞炎性因子TNF-α蛋白表達(dá)量(η = 6)。
[0025]圖11是以金銀花和山銀花為原料的口炎清顆粒抗炎活性差異試驗(yàn)中ΚΒ細(xì)胞炎性因子IL-10蛋白表達(dá)量(η = 6)。
[0026]圖12是以金銀花和山銀花為原料的口炎清顆粒抗炎活性差異試驗(yàn)中ΚΒ細(xì)胞炎性因子IL-8蛋白表達(dá)量(η = 6)。
[0027]圖13是以金銀花和山銀花為原料的口炎清顆?？寡谆钚圆町愒囼?yàn)中ΚΒ細(xì)胞炎性因子IL-6蛋白表達(dá)量(η = 6)。
【具體實(shí)施方式】
[0028]以下通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0029]一、香煙提取物誘導(dǎo)口腔急性炎癥模型及各藥物的抗炎活性差異研究
[0030]1、實(shí)驗(yàn)材料
[0031]1.1實(shí)驗(yàn)藥品與試劑
[0032]金銀花浸膏、山銀花浸膏、以金銀花為原料的口炎清浸膏、以山銀花為原料的口炎清浸膏(均由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司提供)；椰樹(shù)牌香煙(廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，含有一氧化碳13mg，焦油llg，煙堿lmg) ;KB細(xì)胞(人口腔表皮樣癌細(xì)胞，廣州弗爾博生物科技有限公司);TNF- a、IL-8, IL-6, IL-lOElisa試劑盒(武漢優(yōu)爾生公司，貨號(hào):SEA133Hu, SEA080Hu，SEA079Hu，SEA056Hu) ;RPMI_1640 培養(yǎng)基(美國(guó) GIBC0，貨號(hào):C11875500BT);胎牛血清(美國(guó) GIBCO，貨號(hào):1420768) ;MTT(美國(guó) Sigma Aldrich，貨號(hào):M2128);地塞米松(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):100129-201105) ;二甲基亞砜(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20140909);磷酸鹽緩沖溶液(美國(guó)Hyclone，貨號(hào):SH30256.01B)。
[0033]1.2實(shí)驗(yàn)儀器
[0034](25cm2和75cm2)細(xì)胞培養(yǎng)瓶(德國(guó)Corning公司，貨號(hào):430639) ；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(廣州JET B10FIL，貨號(hào):TCP001006) ;96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(廣州JET B10FIL，貨號(hào):TCP001096) ;50mL—次性醫(yī)用注射器；紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，型號(hào):TU-1901);自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器(中國(guó)廈門致微儀器有限公司，型號(hào):GR60DA);電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司，型號(hào):HWS24);細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)賽默飛世爾科技公司，型號(hào):Forma3111);超凈工作臺(tái)(蘇州凈化安泰技術(shù)有限公司，型號(hào):HT_840);倒置顯微鏡(福建Motic實(shí)業(yè)公司，型號(hào):AE21);超速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司，型號(hào):5430R);電子天平(美國(guó)ACCMLAB公司，型號(hào):ALC-210_4);超低溫冰箱(青島海爾公司，型號(hào):DW-86L486);多孔超微量核酸蛋白分析儀(美國(guó)B1tek Epoch);超微量紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)(美國(guó)賽默飛世爾科技公司，型號(hào):Nanodrop 2000c) ;0.22μηι無(wú)菌過(guò)濾器(美國(guó)密理博，貨號(hào):SLGP033RB)。
[0035]2、實(shí)驗(yàn)方法
[0036]2.1香煙煙霧提取物的配制
[0037]制備香煙煙霧提取物裝置時(shí)，將1.5mL離心管接上香煙，將其底部剪開(kāi)，然后套上橡膠軟管，同時(shí)橡膠軟管的另一端連接上50mL注射器。將10mL無(wú)血清RPM1-1640培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至50mL注射器中，并將注射器中剩余空氣完全排出后待用。將香煙點(diǎn)燃，將裝置連接設(shè)置好，并確保裝置不漏氣即可開(kāi)始實(shí)驗(yàn):先連接一只空的50mL注射器，反復(fù)抽取3次，觀察抽取的香煙煙霧，確保香煙已充分燃燒，然后連接裝有10mL無(wú)血清RPM1-1640的50mL注射器，抽取50mL充分燃燒的香煙煙霧到注射器中，充分震蕩，確保煙霧與培養(yǎng)基充分混勾，反復(fù)抽取6次，共計(jì)300mL香煙煙霧，待煙霧完全溶于培養(yǎng)基后用0.22 μ m濾膜過(guò)濾后除菌即可得到100%香煙煙霧提取物母液(100% CSE)。為驗(yàn)證CSE母液的穩(wěn)定性，設(shè)置6組平行重復(fù)，檢測(cè)A320下的吸光度值，得到RSD值為1.68%，說(shuō)明該方法所制備的CSE母液質(zhì)量穩(wěn)定可靠。
[0038]2.2樣品的制備
[0039]金銀花浸膏、山銀花浸膏、以金銀花為原料的口炎清浸膏、以山銀花為原料的口炎清浸膏均委托廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，按照現(xiàn)有的口炎清顆粒標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)工藝制備。其中口炎清顆粒原處方