>[0018]圖2為蛋白質分子賴氨酸ε -氨基胍化保護和N端氨基同重二甲基標記示意圖。
【具體實施方式】
[0019]下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。
[0020]實施例
[0021]—種不同生理或病理條件下整體蛋白質的定量分析方法，采用如圖1所示的整體流程，包括以下步驟:
[0022](1)兩種不同生理或病理條件的整體蛋白(以控制組與疾病組為例)先統(tǒng)一用二硫蘇糖醇進行還原和碘乙酰胺進行烷基化；
[0023](2)上述兩組烷基化的蛋白統(tǒng)一用0-甲基異尿素(2M，lOOmM碳酸氫鈉溶液)對蛋白序列中賴氨酸殘基上的ε -氨基進行胍化(用2Μ NaOH調(diào)節(jié)pH到11，65 °C )，反應15分鐘后用10% (v/v)三氟乙酸溶液淬滅；
[0024](3)保護后的兩組蛋白質分別用甲醛和氘代氰基硼氫化鈉、13C標記甲醛和氰基硼氫化鈉對蛋白分子的N端氨基進行同重標記(如圖2所示);也就是分別標記為_N(CH2D)2和-N(13CH3)2，其質量差異為0.00584Da。反應過程和條件如下:保護后的蛋白重新溶解在乙酸鈉緩沖溶液(lOOmM，pH 5-6)后，加入剛剛配制的4%甲醛溶液；在攪拌條件下加入600mM的新配制的氰基硼氫化鈉溶液。室溫反應1小時后，反應用4%的氨水淬滅；
[0025](4)同重標記后兩組蛋白按等比例混合進行高分辨質譜和串級質譜分析得到一個數(shù)據(jù)組；
[0026](5)ProteinGoggle對數(shù)據(jù)組進行定性、定量數(shù)據(jù)庫搜索，得到蛋白質的ID及疾病組每一個蛋白質相對于控制組的相對比例，即疾病條件下所有蛋白的上調(diào)或下調(diào)情況。上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)最大的蛋白即與該疾病發(fā)生、發(fā)展相關的蛋白。
[0027]上述解析方法基于所述質譜的原始二級質譜，通過計算同重標記的N端碎片離子的平均相對強度從而計算標記蛋白在不同生理或病理條件下的相對強度。對整體蛋白質序列N端氨基酸氨基的同重標記和其高分辨串級質譜N端碎片離子同位素輪廓指紋比對原位數(shù)據(jù)解析，標記效率高，準確度高，適用于整體蛋白質基于高分辨串級質譜的定量分析。
[0028]上述的對實施例的描述是為便于該技術領域的普通技術人員能理解和使用發(fā)明。熟悉本領域技術的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應用到其他實施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動。因此，本發(fā)明不限于上述實施例，本領域技術人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進和修改都應該在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權項】
1.一種不同生理或病理條件下整體蛋白質的定量分析方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將兩組不同生理或病理條件的整體蛋白分別作為控制組與疾病組，統(tǒng)一用二硫蘇糖醇進行還原和碘乙酰胺進行烷基化； (2)對兩組烷基化的蛋白序列中賴氨酸殘基上的氨基進行化學保護； (3)將經(jīng)化學保護后的兩組蛋白質的Ν端氨基進行同重標記，分別標記為_N(CH2D)2和_N(13CH3)2，其質量差異為0.00584Da ； (4)同重標記后兩組蛋白按等比例混合進行高分辨質譜和串級質譜分析得到一個數(shù)據(jù)組； (5)對數(shù)據(jù)組進行定性、定量數(shù)據(jù)庫搜索，得到蛋白質的ID及疾病組每一個蛋白質相對于控制組的相對比例，即疾病條件下所有蛋白的上調(diào)或下調(diào)情況，上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)最大的蛋白即為與該疾病發(fā)生、發(fā)展相關的蛋白。2.根據(jù)權利要求1所述的一種不同生理或病理條件下整體蛋白質的定量分析方法，其特征在于，步驟(2)中，用0-甲基異尿素對兩組烷基化的蛋白質序列中賴氨酸殘基上的ε-氨基進行狐化保護。3.根據(jù)權利要求2所述的一種不同生理或病理條件下整體蛋白質的定量分析方法，其特征在于，進行胍化保護的方法為:在pH 11，65°C條件下，用0-甲基異尿素與蛋白質反應15分鐘后用10% (v/v)三氟乙酸溶液淬滅。4.根據(jù)權利要求2所述的一種不同生理或病理條件下整體蛋白質的定量分析方法，其特征在于，所述的0-甲基異尿素為2mol/L，溶于100mM碳酸氫鈉溶液中。5.根據(jù)權利要求1所述的一種不同生理或病理條件下整體蛋白質的定量分析方法，其特征在于，步驟(3)中，一組蛋白質用甲醛和氘代氰基硼氫化鈉標記，另一組蛋白質用13C標記甲醛和氰基硼氫化鈉標記； 反應過程和條件如下:保護后的蛋白重新溶解在乙酸鈉緩沖溶液后，加入4% (v/v)甲醛溶液；在攪拌條件下加入600mM的新配制的氰基硼氫化鈉溶液，室溫反應1小時后，用4% (v/v)的氨水淬滅。6.根據(jù)權利要求5所述的一種不同生理或病理條件下整體蛋白質的定量分析方法，其特征在于，所述的乙酸鈉緩沖溶液為100mmol/L，pH為5_6。7.根據(jù)權利要求1所述的一種不同生理或病理條件下整體蛋白質的定量分析方法，其特征在于，步驟(4)所述的等比例混合指:按照控制組與疾病組的重量、體積或摩爾量以1:1比例進行混合。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種不同生理或病理條件下整體蛋白質的定量分析方法，首先將兩組不同生理或病理條件的整體蛋白分別作為控制組與疾病組，進行還原和烷基化；對兩組烷基化的蛋白序列中賴氨酸殘基上的ε-氨基進行化學保護；將經(jīng)化學保護后的兩組蛋白質的N端氨基進行同重標記；同重標記后兩組蛋白按等比例混合進行高分辨質譜和串級質譜分析得到一個數(shù)據(jù)組；對數(shù)據(jù)組進行定性、定量數(shù)據(jù)庫搜索，得到蛋白質的ID及疾病組每一個蛋白質相對于控制組的相對比例，即疾病條件下所有蛋白的上調(diào)或下調(diào)情況。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明方法標記效率高，準確度高，適用于整體蛋白質基于高分辨串級質譜的定量分析。
【IPC分類】G01N33/68
【公開號】CN105242050
【申請?zhí)枴緾N201510589892
【發(fā)明人】田志新, 肖開捷, 方后琴, 沈赟, 王悅
【申請人】同濟大學
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年9月16日