一種不同生理或病理?xiàng)l件下整體蛋白質(zhì)的定量分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)分子的分析方法，尤其是涉及一種不同生理或病理?xiàng)l件下整體蛋白質(zhì)的定量分析方法，涉及與生物質(zhì)譜相關(guān)的系統(tǒng)生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]近兩三年來，商業(yè)化的高質(zhì)量分辨、高質(zhì)量測量精度質(zhì)譜儀有了飛躍式發(fā)展，也就是軌道阱質(zhì)譜儀的出現(xiàn)。軌道阱質(zhì)譜儀跟傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀分辨率和精度相當(dāng)；但價(jià)格相對(duì)便宜，質(zhì)譜采集速度更快、解離效率更高。該質(zhì)譜儀的相對(duì)普及為分子量相對(duì)較大的整體蛋白的質(zhì)譜及串級(jí)質(zhì)譜分析提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。在整體蛋白定量標(biāo)記方面，基于SILAC的體內(nèi)標(biāo)記和基于TMT的體外標(biāo)記，由于靶向氨基酸的非完全標(biāo)記(如重的賴氨酸或精氨酸在SILAC中的非完全替代)和非靶向氨基酸的非選擇性標(biāo)記(如蘇氨酸的TMT標(biāo)記)，其應(yīng)用范圍受到了比較大的限制。二甲基(同位素，isotopic或同重，isobaric)標(biāo)記由于其試劑易得，標(biāo)記效率高，在多肽定量方面已得到了廣泛的研究和應(yīng)用；我國科學(xué)家在這個(gè)定量技術(shù)方面也做出了巨大的貢獻(xiàn)，發(fā)展了多種不同形式的二甲基標(biāo)記；其中中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所張玉奎院士和張麗華研究員課題組發(fā)展的N端同重二甲基標(biāo)記和復(fù)旦大學(xué)楊亢原教授和陸豪杰教授課題組發(fā)展的賴氨酸殘基上的氨基的胍化保護(hù)組合起來可直接應(yīng)用于蛋白的定量標(biāo)記，有較好的前景。
[0003]在整體蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫新算法和引擎發(fā)展方面，公布號(hào)為CN103389335A的中國專利公布了一種鑒定生物大分子的分析裝置和方法。公布號(hào)為CN104359967A的中國專利公布了一種生物質(zhì)譜重疊同位素輪廓的解析方法。上述專利中公布了同位素輪廓指紋比對(duì)算法(isotopic envelope fingerprinting，iEF)，直接在原始數(shù)據(jù)上進(jìn)行匹配離子的搜索和蛋白質(zhì)的鑒定。該算法無需對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行“去同位素”預(yù)處理，可以節(jié)省相應(yīng)的時(shí)間；根據(jù)各個(gè)離子中是否有同位素峰缺失和同位素峰相對(duì)強(qiáng)度的偏差對(duì)理想及非理想實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行很好的區(qū)分，保證蛋白鑒定的可信度；以已知理論同位素輪廓信息為參考對(duì)重疊實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行有效的解析?；谠撍惴ǔ晒Φ亻_發(fā)了整體蛋白數(shù)據(jù)庫搜索引擎ProteinGoggle，在單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白(泛素、肌紅蛋白)及整體蛋白質(zhì)組混合物(組蛋白H4家族翻譯后修飾異構(gòu)體、大腸桿菌)的定性鑒定中，表現(xiàn)出較高的可信度和較好的應(yīng)用前景。在定量分析方面，ProteinGoggle有著它內(nèi)在的和獨(dú)特的潛在優(yōu)勢；一方面基于同位素輪廓及其中每個(gè)同位素的指紋比對(duì)可以快速精確地搜索同位素或同重標(biāo)記的定量離子對(duì)；另一方面，搜索過程中每個(gè)離子中每個(gè)同位素峰的實(shí)驗(yàn)強(qiáng)度都被記錄和輸出，可以用來直接計(jì)算相對(duì)定量比。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種標(biāo)記效率高、glj反應(yīng)少、準(zhǔn)確度高的不同生理或病理?xiàng)l件下整體蛋白質(zhì)的定量分析方法。
[0005]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0006]—種不同生理或病理?xiàng)l件下整體蛋白質(zhì)的定量分析方法，包括以下步驟:
[0007](1)將兩組不同生理或病理?xiàng)l件的整體蛋白分別作為控制組與疾病組，統(tǒng)一用二硫蘇糖醇進(jìn)行還原和碘乙酰胺進(jìn)行烷基化；
[0008](2)對(duì)兩組烷基化的蛋白序列中賴氨酸殘基上的ε -氨基進(jìn)行化學(xué)保護(hù)；
[0009](3)將經(jīng)化學(xué)保護(hù)后的兩組蛋白質(zhì)的Ν端氨基進(jìn)行同重標(biāo)記，分別標(biāo)記為-N(CH2D)$ -N( 13CH3)2，其質(zhì)量差異為 0.00584Da ；
[0010](4)同重標(biāo)記后兩組蛋白按等比例混合進(jìn)行高分辨質(zhì)譜和串級(jí)質(zhì)譜分析得到一個(gè)數(shù)據(jù)組；
[0011](5)對(duì)數(shù)據(jù)組進(jìn)行定性、定量數(shù)據(jù)庫搜索，得到蛋白質(zhì)的ID及疾病組每一個(gè)蛋白質(zhì)相對(duì)于控制組的相對(duì)比例，即疾病條件下所有蛋白的上調(diào)或下調(diào)情況，上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)最大的蛋白即為與該疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的蛋白。
[0012]優(yōu)選地，步驟⑵中，用0-甲基異尿素對(duì)兩組烷基化的蛋白質(zhì)序列中賴氨酸殘基上的ε-氨基進(jìn)行胍化保護(hù)。進(jìn)行胍化保護(hù)的方法為:在pH為11，65°C條件下，用0-甲基異尿素與蛋白質(zhì)反應(yīng)15分鐘后用10% (v/v)三氟乙酸溶液淬滅。所述的0-甲基異尿素為2mol/L，溶于100mM碳酸氫鈉溶液中。本發(fā)明的方法同樣適用于蛋白質(zhì)序列中賴氨酸殘基上的ε-氨基其他化學(xué)保護(hù)。
[0013]優(yōu)選地，步驟(3)中，一組蛋白質(zhì)用甲醛和氘代氰基硼氫化鈉標(biāo)記，另一組蛋白質(zhì)用13c標(biāo)記甲醛和氰基硼氫化鈉標(biāo)記；反應(yīng)過程和條件如下:保護(hù)后的蛋白重新溶解在乙酸鈉緩沖溶液后，加入4% (v/v)甲醛溶液；在攪拌條件下加入600mM的新配制的氰基硼氫化鈉溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)后，用4% (v/v)的氨水淬滅。所述的乙酸鈉緩沖溶液為lOOmmol/L，pH為5-6。本發(fā)明的方法同樣適用于蛋白質(zhì)序列N端氨基的任何同重標(biāo)記。
[0014]步驟(4)所述的等比例混合指:按照控制組與疾病組的重量、體積或摩爾量以1:1比例進(jìn)行混合。
[0015]步驟(5)中對(duì)數(shù)據(jù)組進(jìn)行定性、定量數(shù)據(jù)庫搜索，得到蛋白質(zhì)的ID及疾病組每一個(gè)蛋白質(zhì)相對(duì)于控制組的相對(duì)比例為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，優(yōu)選使用【背景技術(shù)】中介紹的整體蛋白數(shù)據(jù)庫搜索引擎1^(^61116(^816，同時(shí)也可以使用其他數(shù)據(jù)庫。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的解析方法基于所述質(zhì)譜的原始二級(jí)質(zhì)譜，通過計(jì)算同重標(biāo)記的N端碎片離子的平均相對(duì)強(qiáng)度從而計(jì)算標(biāo)記蛋白在不同生理或病理?xiàng)l件下的相對(duì)強(qiáng)度。本發(fā)明的定量方法對(duì)整體蛋白質(zhì)序列N端氨基酸氨基的同重標(biāo)記和其高分辨串級(jí)質(zhì)譜N端碎片離子同位素輪廓指紋比對(duì)原位數(shù)據(jù)解析，標(biāo)記效率高，準(zhǔn)確度高，適用于整體蛋白質(zhì)基于高分辨串級(jí)質(zhì)譜的定量分析。
【附圖說明】
[0017]圖1為基于蛋白質(zhì)N端氨基同重二甲基標(biāo)記的定量示意圖。