其中1為頂板，2為底板，3為氣栗，4為加樣口，5為標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池，6為過(guò)濾區(qū)，7為磁顆粒包被區(qū)，8為檢測(cè)區(qū)，9為清洗液存儲(chǔ)池，10為發(fā)光基底液存儲(chǔ)池，11為蓋子，12為樣本填充區(qū)，13為樣本混合區(qū)，14為清洗區(qū)，15為廢液池，16為液體釋放通道，17為發(fā)光基底液和清洗液存儲(chǔ)池讓位孔(于頂板)，18為磁鐵滑軌讓位孔。
[0054]圖2為完整微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為頂板，2為底板，19為雙面膠帶，20為單面膠帶，21為發(fā)光基底液和清洗液存儲(chǔ)池讓位孔(于雙面膠帶)，22為混合液流入過(guò)濾區(qū)時(shí)的讓位孔。
[0055]圖3為雙發(fā)光基底液的微流控芯片底板結(jié)構(gòu)示意圖，其中23為發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A，24為發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B，25為預(yù)混合通道。
【具體實(shí)施方式】
[0056]本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)全血中氮末端腦鈉肽的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0057]為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0058]實(shí)施例1:酶促化學(xué)發(fā)光測(cè)定NT-proBNP
[0059](一 )抗體標(biāo)記
[0060]取5 μ g HRP溶解于lmL蒸餾水中，再加入0.2mL0.1M新配Na104溶液，室溫避光反應(yīng)20min后，以ImM pH4.4醋酸鈉緩沖液透析純化溶液。再以0.2M pH9.5碳酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH至9.0，加入10 μ g抗NT-proBNP單抗，室溫避光反應(yīng)2h。加0.lmL新配的4mg/mLNaBH4液，混勻，于4°C反應(yīng)2h。將上述溶液裝入透析袋，以0.15M pH7.4PBS透析，4°C過(guò)夜，得到HRP標(biāo)記NT-proBNP抗體。
[0061 ] 向磷酸緩沖液中加入lmg磁顆粒(尺寸為2 μ m)、10 μ g EDC和15 μ g NHS溶液和10?30 μ g抗NT-proBNP單抗(與HRP標(biāo)記的抗體不同)溶液，混合均勾并于室溫下反應(yīng)4h，加入lmg甘氨酸封閉。用色譜柱或?qū)游鲋蛛x純化，得到磁顆粒標(biāo)記NT-proBNP抗體。
[0062]( 二 )微流控芯片組裝
[0063]HRP標(biāo)記NT-proBNP抗體溶液中含0.2%牛血清白蛋白、0.1 %吐溫20和0.02%Proclin300的pH7.4Tris_HCl緩沖液；磁顆粒標(biāo)記NT-proBNP抗體溶液為包含0.5%牛血清白蛋白、1%葡萄糖、0.2%吐溫20和0.02% Proclin300的pH7.4Tris-HCl緩沖液。
[0064]將HRP標(biāo)抗體溶液放入頂板標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池中，密封。將磁標(biāo)抗體溶液放入底板磁顆粒包被區(qū)中，室溫干燥。
[0065]清洗液為0.3 %牛血清白蛋白、0.2 %曲拉通X-100和0.02 % Proclin300的pH7.0Tris-HCl緩沖液。將清洗液注入清洗液存儲(chǔ)池。發(fā)光基底液分為HRP底物(魯米諾的雙氧水溶液)和堿性增強(qiáng)液(苯衍生物的堿性溶液)，分別注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A (23)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B(24)中，密封。按圖1所示，將濾血膜粘入底板過(guò)濾區(qū)中，將存儲(chǔ)池內(nèi)置入底板。然后按圖2所示，以單面膠帶和雙面膠帶，將頂板和底板組裝成微流控芯片。裝入鋁箔袋中，密封4°保存。
[0066](三)樣本檢測(cè)
[0067]用正常人血楽作稀釋液，將NT-proBNP標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成如下濃度:0pg/ml、5pg/ml、50pg/ml、500pg/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、1000ng/ml 和 5000ng/ml。
[0068]將50 μ 1樣本滴入加樣口后，蓋上蓋子。將微流控芯片放入配套儀器(磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度為6000高斯)中，儀器擠出HRP標(biāo)記單抗，并使樣本和HRP標(biāo)記單抗混合均勻后注入底板過(guò)濾區(qū)。樣本過(guò)濾后，到達(dá)微通道，并溶解磁顆粒標(biāo)記單抗，磁鐵加速樣本反應(yīng)，形成HRP標(biāo)記單抗-NT-proBNP抗原-磁顆粒標(biāo)記單抗的三明治結(jié)構(gòu)，然后磁鐵收集磁顆粒。清洗液存儲(chǔ)池釋放清洗液，將磁顆粒清洗后，發(fā)光基底液釋放，儀器檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度?？倷z測(cè)時(shí)間15min。每個(gè)樣本分別用3個(gè)微流控芯片測(cè)定3次，取平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0069]將50 μ 1全血樣本滴入加樣口，15分鐘內(nèi)儀器檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣本中NT-proBNP濃度。
[0070]檢測(cè)原理為:當(dāng)全血加入微流控芯片后，全血先與HRP標(biāo)記抗體混合，然后經(jīng)過(guò)濾區(qū)后，混合了 HRP標(biāo)記抗體的血漿到達(dá)微通道，血漿溶解磁標(biāo)記抗體。當(dāng)血樣中含有NT-proBNP,則形成HRP標(biāo)記抗體-NT-proBNP-磁顆粒標(biāo)記抗體的三明治結(jié)構(gòu)(雙抗體夾心法)。經(jīng)清洗后，再發(fā)光基底液作用下發(fā)光，儀器檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)試發(fā)光信號(hào)。依據(jù)配套儀器獲取的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而分析血樣中NT-proBNP濃度。樣本中NT-proBNP含量越高，則發(fā)光信號(hào)越強(qiáng)。
[0071]結(jié)果表明，其最低檢測(cè)限為1.0pg/ml，最低定量限為10pg/ml，定量檢測(cè)范圍為
1.0?35000pg/ml，線性相關(guān)系數(shù)R2〉0.99 ;在檢測(cè)范圍內(nèi)，未出現(xiàn)Η00Κ效應(yīng)；且批內(nèi)與批間重復(fù)性均小于10%?？蔀樾墓Ｐ乃ゼ膊≡\斷提供參考。
[0072]實(shí)施例2:直接化學(xué)發(fā)光測(cè)定NT-proBNP
[0073](一 )抗體標(biāo)記
[0074]向磷酸緩沖液中加入適量活化的吖啶酯和100 μ g抗NT-proBNP單抗溶液，混合均勻并于室溫下反應(yīng)4h，加入lmg甘氨酸封閉。透析后，得到吖啶酯標(biāo)記NT-proBNP抗體。
[0075]向1ml 10mM pH7.4磷酸緩沖液中加入lmg磁顆粒(尺寸為1 μ m)、10 μ g EDC和15 μ g NHS溶液和20 μ g鏈霉親和素，混合均勻并于室溫下反應(yīng)4h，加入lmg甘氨酸封閉。以磁鐵吸附富集，去除未反應(yīng)的鏈霉親和素，得到磁顆粒標(biāo)記鏈霉親和素。
[0076]將10 μ g 抗 NT-proBNP 單抗加入 5 μ L 0.25mg/mL Sulfo-NHS-LC-b1tin 溶液中，反應(yīng)lh。以超濾離心管純化，去除未反應(yīng)的生物素。得到生物素化抗NT-proBNP抗體。
[0077]通過(guò)親和素-生物素間的相互作用，把抗NT-proBNP抗體連接到磁顆粒表面，得到磁顆粒標(biāo)記NT-proBNP抗體。其中親和素標(biāo)記的磁顆粒和生物素化的抗體比例為1: 104。
[0078]( 二 )微流控芯片組裝
[0079]吖啶酯標(biāo)記NT-proBNP抗體溶液中含0.1 %牛血清白蛋白、0.05 %吐溫20和0.05% Proclin300的pH7.4磷酸緩沖液；磁顆粒標(biāo)記NT-proBNP抗體溶液為包含0.2 %牛血清白蛋白、0.1 %酪蛋白、2 %蔗糖、0.2 %吐溫20、0.1 %曲拉通X-100和0.02 %Proclin300的pH7.4磷酸緩沖液。將吖啶酯標(biāo)記抗體溶液放入頂板標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池中，密封。將磁標(biāo)抗體溶液放入底板磁顆粒包被區(qū)中，室溫干燥。
[0080]清洗液為0.3%牛血清白蛋白、0.1%吐溫20、0.2%曲拉通X-100和0.02 %Proclin300的pH7.0磷酸鹽緩沖液。將清洗液注入清洗液存儲(chǔ)池。發(fā)光基底液分為包含H202溶液和堿性溶液，分別注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A (23)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B (24)，密封。按圖1