檢測(cè)全血中氮末端腦鈉肽的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用磁微粒化學(xué)發(fā)光技術(shù)和微流控芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)NT-proBNP高靈敏定量檢測(cè)的方法，特別公開了一種檢測(cè)全血中氮末端腦鈉肽的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，實(shí)現(xiàn)了心腦血管疾病尤其是心力衰竭中NT-proBNP的快速準(zhǔn)確定量檢測(cè)，可廣泛用于基層醫(yī)院和診所，屬于微流控芯片化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]目前用于臨床檢測(cè)的BNP有NT-proBNP和BNP兩種。雖兩者有相同生物學(xué)來源，但生物學(xué)效應(yīng)和臨床意義不完全相同。心肌細(xì)胞受刺激后，產(chǎn)生初始基因產(chǎn)物前BNP前體，該肽的一個(gè)26氨基信號(hào)肽被立即切除，生成BNP前體(proBNP，108個(gè)氨基酸)，前體在內(nèi)切酶作用下裂解為無生物活性的NT-proBNP(76個(gè)氨基酸)和有活性的BNP(32個(gè)氨基酸)。BNP清除主要通過與清除受體結(jié)合，半衰期短(22min)，體外穩(wěn)定性差；而NT-proBNP則主要由腎小球?yàn)V過，半衰期較長(120min)，體外穩(wěn)定性強(qiáng)。
[0003]BNP和NT-proBNP已廣泛用于臨床實(shí)踐，成為心衰診斷的生物標(biāo)志物。測(cè)定NT-proBNP主要方法有放射免疫法、電化學(xué)發(fā)光法和膠體金法等。放射免疫法存在放射線輻射和污染等問題。電化學(xué)發(fā)光法較放射免疫法更為敏感、準(zhǔn)確，精密，但成本昂貴，需要配套化學(xué)發(fā)光儀才能檢測(cè)。膠體金免疫層析法雖簡(jiǎn)便快速，但靈敏度低、重復(fù)性差。
[0004]中國專利200720140928.5，公布了一種氮末端腦鈉肽前體/C-反應(yīng)蛋白/肌鈣蛋白I診斷試紙，利用快速免疫層析法，定性檢測(cè)臨床標(biāo)本中NT-proBNP/C-反應(yīng)蛋白/肌鈣蛋白I。該法靈敏度低、線性范圍窄。中國專利201010241048.3公布了一種免疫層析試紙條的測(cè)試使用及應(yīng)用這種測(cè)試方法的NT-proBNP快速定量試劑。其采用上轉(zhuǎn)發(fā)光材料作為生物標(biāo)記物，檢測(cè)NT-proBNP，但仍未解決試紙條重復(fù)性差的缺陷。
[0005]因此開發(fā)快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的檢測(cè)方法，具有巨大發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。與熒光和吸收光相比，化學(xué)發(fā)光沒有外來激發(fā)光源背景信號(hào)干擾，交叉干擾小，靈敏度高、線性范圍寬。微流控芯片技術(shù)把樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，可完成全過程分析。
[0006]針對(duì)現(xiàn)有NT-proBNP檢測(cè)方法的不足和缺陷，微流控磁微?；瘜W(xué)發(fā)光方法利用磁微粒化學(xué)發(fā)光和微流控技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)NT-proBNP準(zhǔn)確、高靈敏定量檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題為針對(duì)現(xiàn)有快速診斷方法靈敏度低、重復(fù)性差、受干擾明顯，以及現(xiàn)有化學(xué)發(fā)光配套儀器昂貴、檢測(cè)時(shí)間長的問題，提供一種檢測(cè)全血中氮末端腦鈉肽的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，通過集成化芯片(把除測(cè)試樣本外所有組分均集成到芯片內(nèi))并配套小型便攜設(shè)備，從而實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)樣本中NT-proBNP的快速、準(zhǔn)確、高靈敏定量檢測(cè)。
[0008]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0009]一種檢測(cè)全血中氮末端腦鈉肽的磁微粒化學(xué)發(fā)光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括頂板(1)結(jié)構(gòu)和底板(2)結(jié)構(gòu)，其中頂板(1)上的氣栗(3)、加樣口(4)、樣本填充區(qū)(12)、標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池(5)和樣本混合區(qū)(13)依次相連；底板⑵上的過濾區(qū)
(6)、磁顆粒包被區(qū)(7)、清洗區(qū)(14)、檢測(cè)區(qū)⑶依次連接，底板(2)上檢測(cè)區(qū)⑶通過液體釋放通道(16)與清洗液存儲(chǔ)池(9)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10)連接；所述標(biāo)記配體存儲(chǔ)池(5)、清洗液存儲(chǔ)池(9)、發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10)和磁顆粒包被區(qū)(7)中存儲(chǔ)預(yù)封裝試劑；所述標(biāo)記配體存儲(chǔ)池(5)、清洗液存儲(chǔ)池(9)、發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10)為液體密封池，可通過外力擠壓而局部破裂，釋放液體；所述標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池(5)中存儲(chǔ)酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗NT-proBNP抗體溶液；所述磁顆粒包被區(qū)(7)包被磁顆粒標(biāo)記抗NT-proBNP抗體；
[0010]所述微流控芯片測(cè)試流程中，用磁鐵操控磁顆粒移動(dòng)或聚集。
[0011 ] 具體地，所述酶標(biāo)記抗NT-proBNP抗體使用的酶包含過氧化氫酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)。
[0012]具體地，所述發(fā)光劑標(biāo)記抗NT-proBNP抗體使用的發(fā)光劑包含吖啶酯和吖啶磺酰胺。
[0013]具體地，所述磁顆粒標(biāo)記抗NT-proBNP抗體優(yōu)選的磁顆粒為超順磁性顆粒，顆粒尺寸為0.1?10 μ m，磁感應(yīng)強(qiáng)度為500?30000高斯。
[0014]優(yōu)選地，所述磁顆粒為超順磁性顆粒，包含三氧化二鐵和四氧化三鐵化合物，顆粒尺寸為1?3 μ m，磁感應(yīng)強(qiáng)度為1000?8000高斯。
[0015]具體地，所述酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗體溶液包含牛血清白蛋白、吐溫-20和Proclin300的pH7.4Tris_HCl緩沖液；所述磁顆粒標(biāo)記抗體溶液包含牛血清白蛋白、葡萄糖、吐溫-20 和 Proclin300 的 pH7.4Tris_HCl 緩沖液。
[0016]本發(fā)明所述微流控芯片制備方法如下:
[0017]步驟1)酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗NT-proBNP抗體，磁顆粒標(biāo)記抗NT-proBNP抗體，這兩種抗體可相同或不同；
[0018]步驟2)將酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗體溶液放入頂板的存儲(chǔ)池中，密封，將磁顆粒標(biāo)記抗體溶液放入底板的包被區(qū)中，干燥，將清洗液和發(fā)光基底液分別注入清洗液存儲(chǔ)池和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池中，密封，用膠帶(19和20)密封頂板和底板，并組裝成微流控芯片。
[0019]本發(fā)明提供的檢測(cè)全血中氮末端腦鈉肽的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片是一種以化學(xué)發(fā)光為基礎(chǔ)、在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)氮末端腦鈉肽快速、準(zhǔn)確、高靈敏檢測(cè)的新方法。
[0020]這種方法是將抗NT-proBNP抗體修飾酶，抗NT-proBNP抗體修飾在磁顆粒上，利用抗原抗體作用，如雙抗體夾心法原理結(jié)合磁顆粒富集、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)樣本中是否含有NT-proBNP,并準(zhǔn)確分析其含量。
[0021]本發(fā)明中所述的發(fā)光基底液為酶對(duì)應(yīng)的發(fā)光底物(如魯米諾或金剛烷)和發(fā)光增強(qiáng)液(如苯衍生物等增強(qiáng)劑)，其中發(fā)光底物和發(fā)光增強(qiáng)液可合并，如圖1所示混合均勻后注入一個(gè)發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10);但當(dāng)混合液保質(zhì)期少于1年時(shí)應(yīng)分開，如圖4所示分別注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A (23)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B (24)，通過預(yù)混合通道(25)混合均勻，如圖3所示。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例采用過氧化氫酶。
[0022]本發(fā)明所述發(fā)光劑與發(fā)光基底液作用后，不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例采用吖啶酯。發(fā)光基底液包含H202溶液和堿性溶液，可合并成堿性H202溶液，注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(10);但當(dāng)穩(wěn)定性不好時(shí)，H202溶液和堿性溶液應(yīng)分別注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池A(23)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池B (24)，通過預(yù)混合通道(25)混合均勻，如圖3所示。
[0023]本發(fā)明采用的標(biāo)記方法包含化學(xué)交聯(lián)或生物分子間特異性作用將抗NT-proBNP抗體連接到酶/發(fā)光劑或磁顆粒表面，得到抗體標(biāo)記的酶/發(fā)光劑或抗體標(biāo)記的磁顆粒。
[0024]本發(fā)明的NT-proBNP抗體包含單克隆抗體和多克隆抗體。該抗體可與NT-proBNP結(jié)合(如雙抗體夾心法)。其中酶/發(fā)光劑標(biāo)記的抗體與磁顆粒標(biāo)記的抗體可以相同，也可以不同。
[0025]本發(fā)明的酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗體溶液和磁顆粒標(biāo)記抗體溶液均包含緩沖液、蛋白質(zhì)、表面活性劑和防腐劑，且磁顆粒標(biāo)記抗體溶液還包含糖類。其中HRP標(biāo)記的配體，緩沖體系中不能含有NaN3;ALP標(biāo)記配體，緩沖體系不能是磷酸體系。
[0026]本發(fā)明的微流控芯片如圖1所示，包含頂板結(jié)構(gòu)(1)和底板結(jié)