增的TRIMS全長基因及pCAG-loxP-CAT-loxP質(zhì)粒（pCAG-loxP-CAT-loxP質(zhì) 粒由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院楊青林老師提供，制備過程參見文獻(xiàn)：KimT，Zhely油ovska0,LiuJ,etal.GenerationofanInducible,Cardiomyocyte-Specific TransgenicMouseModelwithPPARb/dOverexpression[J].Peroxisome Proliferator-ActivatedReceptors巧PARs), 57.)經(jīng)Xbal(肥B，#R0145L) 酶切后連接，形成pCAG-loxP-CAT-loxP-TRIM8-hGHpA載體（CAG(chicken beta-actin)-CAT(chloramphenicolacetyltransferase) -TRIM8-hGHpA)，將構(gòu)建的質(zhì)粒 通過顯微注射系統(tǒng)注射入野生型巧7BL/6小鼠的單細(xì)胞受精卵內(nèi)，該受精卵移植入健康雌 鼠中，發(fā)育得到F0代小鼠。將得到的F0代小鼠與a-MHC-化e小鼠雜交，并通過他莫昔芬 誘導(dǎo)(他莫昔芬80mg/kg/天，腹腔注射，連續(xù)刺激5天）得到屯、臟特異性TRIMS轉(zhuǎn)基因老 鼠（上述的轉(zhuǎn)基因小鼠參照下述文獻(xiàn)制備：JiangDS,BianZY,ZhangY,ZhangSM,Liu Y,ZhangRetal.Roleofinterferonregulatoryfactor4intheregulationof pathologicalcardiachypertrophy.Hypertension2013; 61:1193-1202.)。
[0042] 飼養(yǎng)環(huán)境：所有實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中屯、，SPF級(jí)大小鼠飼料購自北 京華阜康生物科技有限公司。飼養(yǎng)條件：室溫在22-24°C之間，濕度在40-70%之間，明暗交 替照明時(shí)間為12h，自由飲水?dāng)z食。
[0043] 實(shí)施例1TRIMS在正常人和擴(kuò)屯、病人屯、臟中的表達(dá) 選用正常人屯、臟(非屯、臟原因的死亡捐獻(xiàn)的個(gè)體)、擴(kuò)張型屯、肌病患者屯、臟(做屯、臟 移植手術(shù)病人置換的受體)，對(duì)屯、臟提取蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE-免疫印跡試驗(yàn)（Western blot),結(jié)合特異性識(shí)TRIMS蛋白和屯、肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物ANP(Millipore，AB2232)、Myh7 (Santacruz，SC53090)的抗體進(jìn)行檢測，測定其TRIMS(ProSci，25-217)的表達(dá)，GAPDH (CellSi即alingTechnology,2128)作為內(nèi)參。檢測結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)張型屯、肌病患者 屯、臟中的屯、肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物ANP、Myh7的表達(dá)明顯上調(diào)，TRIMS的表達(dá)也明顯上調(diào)（圖1)。
[0044] 實(shí)施例2TRIMS在野生型小鼠假手術(shù)組和屯、肌肥厚模型組屯、臟中的表達(dá) 1.小鼠屯、肌肥厚模型采用主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)(AB)造模，模型操作流程： 1. 1術(shù)前準(zhǔn)備 (1)麻醉：先給小鼠稱重，按照90mg/kg體重計(jì)算所需麻藥（3%戊己比妥鋼）量，通過腹 腔注射，并記錄注射時(shí)間點(diǎn)。夾尾、夾趾無明顯反應(yīng)且小鼠狀態(tài)良好為麻醉成功標(biāo)準(zhǔn)(一般 注射后約lOmin無明顯反應(yīng)，W麻醉后約50min小鼠夾趾有反應(yīng)，麻醉后30min左右為最佳 手術(shù)時(shí)間)。
[0045] (2)術(shù)區(qū)準(zhǔn)備：將小鼠左胸部、左側(cè)胸部及左前肢蔽下的皮膚去毛。剌毛后用濕紗 布擦拭術(shù)區(qū)去除鼠毛，W不影響手術(shù)視野為宜。
[0046] (3)氣管插管：用橡皮筋將小鼠上口齒固定于V形板斜面上，并迅速將氣管插管經(jīng) 聲口準(zhǔn)確插入氣管內(nèi)，隨后右側(cè)邸位置于加熱墊上(加熱墊需提前預(yù)熱)，然后將氣管插管 與呼吸機(jī)連接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏與呼吸機(jī)頻率一致，說明氣管插管成功。
[0047] 1.2主動(dòng)脈弓縮窄術(shù) AB術(shù)屯、肌肥厚模型組：取右側(cè)邸位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用醫(yī)用膠帶將兩 前肢固定。右胸部下方墊入棉簽，抬高胸廓，依次用艦酒及體積分?jǐn)?shù)為75%酒精對(duì)手術(shù)區(qū)域 皮膚消毒。左手持眼科綴將左胸部皮膚捏起，右手持眼科剪剪開皮膚約1cm，依次分離肌肉 及軟組織，于第2-3肋水平打開胸腔，用棉簽稍撥開左肺，游離主動(dòng)脈弓降支，將7-0手術(shù)縫 線穿過血管，并在血管上方平行放置一段26G(25.0-27. 5g小鼠）或者27G(23. 5-25.Og) 注射器針頭，將血管及針頭一起結(jié)扎好，再抽出針頭即可達(dá)到相應(yīng)程度的血管縮窄。結(jié)扎完 畢后依次縫合，關(guān)閉胸腔，用注射器從縫口處插入胸腔并抽出Icc氣體W恢復(fù)胸腔內(nèi)負(fù)壓， 拔出注射器后迅速縫合皮膚切口。
[0048] 假手術(shù)組（Sham)在游離出主動(dòng)脈降支后只穿線不結(jié)扎，其余步驟同AB術(shù)屯、肌肥 厚模型組。
[0049] 1.3術(shù)后護(hù)理 手術(shù)中主動(dòng)脈弓降支結(jié)扎后，待小鼠出現(xiàn)自主呼吸、夾趾出現(xiàn)強(qiáng)烈反應(yīng)，拔出氣管插 管，并將小鼠放入裝有高壓滅菌過的墊料、飼料和飲用水的飼養(yǎng)籠內(nèi)，于飼養(yǎng)室繼續(xù)飼養(yǎng)觀 察。
[0050] 2.取材 打開分析天平，調(diào)零備用。再稱重處死小鼠。眼科彎綴夾住屯、耳下方的血管蒂，剪下屯、 臟，迅速置于滅菌紗布上，輕輕擠壓屯、腔內(nèi)液體，薩干表面液體后，稱重并記錄，將屯、臟放入 相應(yīng)的凍存管中，迅速置于液氮罐中，于-80°C冰箱保存后用于分子生物學(xué)檢測。
[0051] 3.TRIMS在假手術(shù)組和造模組(屯、肌肥厚模型組）屯、臟中的表達(dá) 分別選野生型小鼠假手術(shù)和造模組AB手術(shù)后4周及8周的屯、臟，對(duì)屯、臟組織提取蛋白 質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE-免疫印跡試驗(yàn)（Westernblot),結(jié)合特異性識(shí)別TRIMS蛋白及屯、肌細(xì)胞 肥大標(biāo)志物ANP、Myh7的抗體進(jìn)行檢測，測定其TRIMS的表達(dá)，GAPDH作為內(nèi)參。檢測結(jié)果 如圖2所示，屯、肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物在AB術(shù)后ANP、Myh7的表達(dá)明顯上調(diào)，TRIMS的表達(dá)在AB 術(shù)后明顯上調(diào)。表明發(fā)生屯、肌肥厚的屯、臟TRIMS的表達(dá)上調(diào)。
[0052] 實(shí)施例3TRIMS在對(duì)照組（PBS)或血管緊張素II(AngII)或苯腎上腺素（PE)刺 激后的屯、肌細(xì)胞中的表達(dá) 分離培養(yǎng)新生1天Sprague-Dawley乳鼠屯、肌細(xì)胞，培養(yǎng)原代屯、肌細(xì)胞4化后換液(原 代新生SD大鼠屯、肌細(xì)胞培養(yǎng)的具體過程見下述實(shí)施例4)，加入無血清的DMEM/F12饑餓屯、 肌細(xì)胞1化使細(xì)胞同步化后，分別給予PBS、血管緊張素血管緊張素II(AngII，lyM)、苯 腎上腺素（PE，1yM)刺激48小時(shí)，對(duì)屯、肌細(xì)胞提取蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE-免疫印跡試驗(yàn) (Westernblot),結(jié)合特異性識(shí)別TRIMS蛋白及屯、肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物ANP、Myh7的抗體進(jìn)行 檢測，測定其TRIMS的表達(dá)，GAPDH作為內(nèi)參。檢測結(jié)果如圖3所示，經(jīng)血管緊張素II(Ang II)或苯腎上腺素（PE)刺激后的屯、肌細(xì)胞中ANP、Myh7的表達(dá)明顯上調(diào)，TRIMS的表達(dá)明顯 上調(diào)。
[0053] 實(shí)施例4TRIMS干擾（AdshTRIMS)及過表達(dá)（AdTRIMS)腺病毒對(duì)AngII刺激的原 代屯、肌細(xì)胞肥大的影響 1.原代新生SD大鼠屯、肌細(xì)胞培養(yǎng) (1)新生1天Sprague-Dawley乳鼠8只，頸部W下75%酒精消毒，用眼科剪和顯微綴取 下屯、臟，放入盛有10血DMEM/F12液的玻璃平皿中。再取另一只，重復(fù)W上過程。
[0054] (2)用0161/。12培養(yǎng)基清洗屯、臟，并將屯、臟剪成1-2111111 3的碎片。轉(zhuǎn)入到放有轉(zhuǎn)子 的血清瓶中，吸去DMEM/F12,加入膜酶消化液。轉(zhuǎn)速為12化/min,消化15min，靜止數(shù)秒鐘， 棄去上清液。
[00巧](3)加入膜酶消化液，轉(zhuǎn)速為12化/min,消化15min。靜止數(shù)秒鐘，吸取上清液，用 20%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，并置于4°C冰箱保存。重復(fù)該步驟，循環(huán)若干次。 取上清時(shí)應(yīng)盡量取盡，當(dāng)組織塊變白并明顯變小時(shí)，終止消化。
[0056] (4)將收集好的屯、肌細(xì)胞懸液，W1500巧m轉(zhuǎn)速離屯、8min，棄去上清液。在離屯、管 中加入適量培養(yǎng)基，輕柔吹打重懸細(xì)胞，集中至1個(gè)50mL離屯、管中，細(xì)胞懸液用細(xì)胞40ym過濾網(wǎng)過濾。
[0057] (5)將細(xì)胞接種在100mm的培養(yǎng)皿中，差時(shí)貼壁90min，吸取未貼壁的細(xì)胞懸液過 濾。根據(jù)細(xì)胞懸液的總量加入化化（終濃度0.ImM)，混勻之后，加入到用0. 1%明膠包被的 器皿中。
[005引（6)輕搖分散細(xì)胞，勿縱滿搖晃。37°C、5% %解育48小時(shí)用PBS清洗1次，更換 培養(yǎng)基。
[0059] 2.TRIMS干擾（AdshTRIMS)及過表達(dá)（AdTRIMS)腺病毒對(duì)經(jīng)AngII誘導(dǎo)的屯、肌 細(xì)胞肥大模型的影響 AdshRNA(含shRNA(沉默RNA)的腺病毒，用作對(duì)照）、AdshTRIM8 (含shRNA-TRIM8 (沉 默RNA-TRIM8融合蛋白）的腺病毒)、AdGFP(含GFP(綠色巧光蛋白）的腺病毒，用作對(duì)照)及 AdTRIMS(含GFP-TRIM8 (綠色巧光蛋白-TRIMS融合蛋白）的腺病毒）（運(yùn)些腺病毒的構(gòu)建 過程參見文獻(xiàn)：ChenK,GaoL,LiuY,etal.Vinexin-Pprotectsagainstcardiac hypertrophybyblockingtheAkt-dependentsignallingpathway[J].BasicRes 仍r扣2013，108(2): 1-14.)腺病毒10MOIs分別感染培養(yǎng)3天的原代屯、肌細(xì)胞，12小 時(shí)后用1yM血管緊張素2(AngII)(購自Sigma公司，A9525)或?qū)φ誔BS刺激48小時(shí)，然 后進(jìn)行免疫巧光試驗(yàn)。結(jié)果表明AdshTRIMS腺病毒感染后的屯、肌細(xì)胞表面面積較AdshRNA 對(duì)照組減少，而經(jīng)AdTRIMS腺病毒感染的屯、肌細(xì)胞表面面積則比對(duì)照組AdGFP明顯增加（圖 4);即TRIMS的干擾腺病毒抑制屯、肌細(xì)胞肥大，TRIMS的過表達(dá)腺病毒促進(jìn)屯、肌細(xì)胞肥大。
[0060] 實(shí)施例5小鼠屯、肌肥厚模型屯、肌肥厚及纖維化檢測和屯、功能檢測 1.小鼠屯、肌肥厚模型采用主動(dòng)脈弓縮窄手術(shù)（AB)造模 選用8-10周齡、體重在23. 5-27. 5g的野生型小鼠（TRIM8+/+)、TRIMS基因敲除小鼠(TRIMS-/-)、屯、臟特異性TRIMS轉(zhuǎn)基因小鼠（TRIM8-TG)及非轉(zhuǎn)基因小鼠（NTG)各分成假 手術(shù)組（Sham)和AB術(shù)屯、肌肥厚模型組（造模組)，即TRIM8+/+ Siam組、TRIM8+/+ AB組， TRIMS-/- Siam組、TRIMS-/- AB組，TRIM8-TG Siam組、TRIM8-TG AB組，NTG Siam組、NTG AB組，每組10只小鼠。造模方法同實(shí)施例2。AB術(shù)后4周分別進(jìn)行屯、肌肥厚及纖維化的檢 測和屯、功能的檢測。
[00川 2.取材 (1)前期工作：預(yù)先準(zhǔn)備裝有20mL的體積分?jǐn)?shù)10%甲醒的尿杯，并貼好標(biāo)簽(小鼠編號(hào)、 組別、手術(shù)類型及取材日期)。將倒?jié)M質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%KC1溶液的培養(yǎng)皿置于取材處。打開分 析天平，調(diào)零備用。再稱重處死小鼠。
[0062] (2)取材：眼科彎綴夾住屯、耳下方的血管蒂，剪下屯、臟，迅速置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%KC1 溶液中。待屯、臟停跳在舒張期后，置于滅菌紗布上，輕輕擠壓屯、腔內(nèi)液體，薩干表面液體后， 稱重并記錄，將屯、臟放入相應(yīng)的尿杯中，固定4化后用于病理學(xué)檢測。
[0063] (3)相關(guān)測量及計(jì)算：取出小鼠肺臟，修剪后濾紙吸干，稱重并記錄。剪開小鼠后 肢腔骨處皮膚，測量并記錄腔骨長度。計(jì)算屯、重與體重的比值（冊(cè)/BW)，肺重與體重的比值 (LW/BW)W及屯、重與腔骨長度的比值（冊(cè)AL)。
[0064] 3.病理學(xué)檢測 3. 1制備石蠟標(biāo)本切片 主要