Thbs2作為直腸癌血清標(biāo)記物的應(yīng)用及診斷試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及THBS2作為直腸癌血清標(biāo)記物的應(yīng)用及診斷 試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在全世界范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌的死亡率高居前 三，在中國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)生率呈不斷上升之勢(shì)，死亡率居第五。經(jīng)過(guò)積極外科手術(shù)治療和放 化療，結(jié)直腸癌患者5年總體生存率在66%左右。有數(shù)據(jù)表明，結(jié)直腸患者在I期甚至更早 得到有效的診斷和治療的話，生存率能夠提高到90%以上。然而目前結(jié)直腸癌的早期診斷 率只有37%左右，一旦到III期或者IV期才發(fā)現(xiàn)治療，生存率則降低為10%-30%?？梢?jiàn)提高 結(jié)直腸癌的早期診斷率至關(guān)重要。目前結(jié)腸鏡對(duì)結(jié)直腸癌檢查的靈敏度和特異性最高，但 由于費(fèi)用較高、患者痛苦較大和操作要求高等原因降低了患者愿意做該項(xiàng)檢查的程度，致 使很多患者拖到晚期，一般的影像學(xué)檢查確診時(shí)患者常常已經(jīng)處于癌癥晚期，對(duì)提高患者 生存率作用有限。因此，找到特異性和敏感性均佳的腫瘤標(biāo)記物成了可行的方法。然而結(jié) 直腸癌的發(fā)生發(fā)展是多種基因損傷的結(jié)果，目前還沒(méi)找到理想的腫瘤標(biāo)志物。
[0003] 理想的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)符合以下條件：（1)敏感性高；（2)特異性好；（3)腫瘤標(biāo)志 物濃度和腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、惡性程度有關(guān)，能監(jiān)測(cè)腫瘤治療效果和腫瘤的復(fù)發(fā)并預(yù)測(cè)預(yù)后；
[4] 半衰期短，有效治療后濃度很快下降，能較快反映體內(nèi)腫瘤的實(shí)際情況；（5)存在于體 液，特別是血液中，易于檢測(cè)。
[0004] 現(xiàn)在應(yīng)用于臨床的腫瘤標(biāo)記物大約有如下幾種：CA-153, CA19-9, CA-125, AFP， CEA，PAS，F(xiàn)erritin，CA724，CA242等。通過(guò)對(duì)臨床600多例樣本的統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)只有CEA 在診斷結(jié)直腸癌時(shí)的敏感性在臨床應(yīng)用中能達(dá)到50%以上，其余都低于20%。
[0005] Thrombospondin-2 (THBS2)屬于人血小板反應(yīng)蛋白家族成員之一。近年來(lái)研究 表明THBS2可在多種組織中表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Naumnik W等研究表明 THBS2表達(dá)水平與晚期非小細(xì)胞肺癌病人的生存時(shí)間相關(guān)，THBS2水平越高，生存時(shí)間越 短，大于24. 15ng/ml的病人平均生存時(shí)間不足9個(gè)月。Matos AR等發(fā)現(xiàn)THBS2的轉(zhuǎn)錄水平 可用于區(qū)分前列腺癌和良性的前列腺增生。而Koch M等的研究則表明⑶36可通過(guò)THBS2 抑制乳腺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，另外，在卵巢癌和急性淋巴白血病中THBS2發(fā)現(xiàn)因甲基化而沉 默。然而目前為止尚無(wú)明確的大樣本數(shù)據(jù)驗(yàn)證其血清表達(dá)水平與腫瘤發(fā)生發(fā)展之間的相關(guān) 性，本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)表明血清THBS2水平診斷結(jié)直腸癌的特異性達(dá)87. 2%，敏感度達(dá)65. 0%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種THBS2作為結(jié)直腸癌 血清標(biāo)記物的應(yīng)用及診斷試劑盒的技術(shù)方案，來(lái)定性或定量檢測(cè)人血清中的THBS2抗原水 平，作為輔助結(jié)直腸癌早期診斷的一種手段，大大提高結(jié)直腸癌早期診斷的敏感性和特異 性。
[0007] 所述的人血小板反應(yīng)蛋白THBS2作為檢測(cè)直腸癌的血清標(biāo)記物的應(yīng)用。
[0008] 所述的人血小板反應(yīng)蛋白THBS2在制備直腸癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0009] 所述的人血小板反應(yīng)蛋白THBS2在制備直腸癌診斷試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于 以常規(guī)方法制備抗人血小板反應(yīng)蛋白THBS2的抗體，建立檢測(cè)人血小板反應(yīng)蛋白THBS2的 定性或定量方法及配套的試劑盒。
[0010] 所述的人血小板反應(yīng)蛋白THBS2在制備直腸癌診斷試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于 抗人血小板反應(yīng)蛋白THBS2的抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
[0011] 所述的一種直腸癌診斷試劑盒，包括固相、位于固相中的抗體、酶標(biāo)記抗體，其特 征在于所述的抗體為抗人血小板反應(yīng)蛋白THBS2的抗體。
[0012] 所述的一種直腸癌診斷試劑盒，其特征在于抗人血小板反應(yīng)蛋白THBS2的抗體是 單克隆抗體或多克隆抗體。
[0013] 本發(fā)明為直腸癌的診斷和/或治療提供一條全新的途徑。
[0014] 本發(fā)明的有益效果在于：1.提供的血清生物標(biāo)志物的特異性為87. 2%，敏感性為 65.0%，具有較高特異性和敏感性。2.提供一種靈敏、可靠、可操作的方法，定量測(cè)定人血清 中THBS2抗原水平，有助于輔助早期診斷結(jié)直腸癌。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為實(shí)施例中的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖； 圖2為實(shí)施例中ROC曲線圖； 圖3為實(shí)施例中THBS2點(diǎn)分布圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解， 這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí) 驗(yàn)方法，通常按常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。 實(shí)施例
[0017] 1、血清樣本的采集與制備： 采集結(jié)直腸癌患者和正常對(duì)照的全血標(biāo)本，室溫放置2小時(shí)內(nèi)3000g離心5分鐘，取上 清即得到血清。得到的血清可立即用于檢測(cè)，或者分裝后于-80°C保存。
[0018] 2、Elisa各種緩沖液及試劑的配置方法 (1) 包被緩沖液：PH9. 6、0. 05M的碳酸鹽緩沖液
(2) 樣品稀釋液：ΡΗ7· 4、0· Olmol/L的PBS緩沖液 CN 105092846 A I兄明 3/5 頁(yè)
(3) 洗滌緩沖液：ΡΗ7· 4、0· OlM 的 PBST 緩沖液(含 0· 05% Tween-20)
(4) 封閉液：含0· 5% BSA的pH 7. 4 PBS溶液。
[0019] (5)底物顯色液： 顯色液A
顯色液B :(現(xiàn)配現(xiàn)用）
(6) 終止緩沖液：2M H2SO4
(7) 抗體（Anti-THBS2)由R&D公司提供，貨號(hào)MAB16351，濃度為20mg/mL。
[0020] (8)標(biāo)準(zhǔn)品由R&D公司提供，濃度為200ng/mL。
[0021] (9 ) HRP 酶標(biāo)抗體濃度為 0· 1-1 μ g/mL。
[0022] 3、雙抗體夾心法Elisa測(cè)定血清中THBS2濃度，以輔助診斷腸癌： 具體操作步驟如下： (1) 包被：用PH9. 6、0. 05M碳酸鹽緩沖液將抗體（Anti-THBS2)稀釋至濃度為1~ IOyg / ml。96孔酶標(biāo)板每孔加100 μ L上述抗體稀釋液，4°C過(guò)夜或37°C包被2h。棄去包 被液，每孔加350 μ L洗滌緩沖液洗板3次，每次3分鐘，拍干，得到捕捉抗體。 (2) 封閉：加0. 3ml封閉液于上述已包被的微孔中，置37°C封閉2小時(shí)。然后洗滌。
[0023] (3)樣品稀釋：每個(gè)血清樣品按體積1:4稀釋。建議取50 μ L血清樣品加入到 150 μ L樣品稀釋液。
[0024] (4)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：用樣品稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為20ng/ml，10 ng/ml, 5 ng/ml, 2. 5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.3125 ng/ml，0 ng/ml 8 個(gè)濃度梯度。
[0025] (5)加樣：每孔加入50 μ L稀釋后的血清樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37°C孵育2小時(shí)；然后洗 滌。
[0026] (6)酶標(biāo)二抗：每孔加入200 μ L HRP酶標(biāo)抗體，置于微型振蕩器37°C孵育2小時(shí)； 然后洗滌。
[0027] (7)顯色：將顯色液A和顯色液B以1:1混合。每孔加入200 μ L，避光反應(yīng)30min。
[0028] (8)終止：每孔加入50 μ L終止液，終止反應(yīng)。5min鐘內(nèi)測(cè)量450nm處各孔吸光度 值。
[0029] (9)標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1所示）：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)吸光度值為縱坐標(biāo)作標(biāo) 準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每個(gè)樣品的濃度。
[0030] (10)結(jié)果判定：小于3. 71為高風(fēng)險(xiǎn)，大于3. 71為正常。
[0031] 對(duì)400例結(jié)直腸癌病人血清，200例正常對(duì)照血清的ROC分析確立了以上參考值， 其中ROC曲線如圖2所示，THBS2點(diǎn)分布圖如圖3所示。
[0032] 對(duì)部分測(cè)定數(shù)據(jù)如下表：（深色標(biāo)記為腫瘤患者，淺色標(biāo)記為正常對(duì)照）：
本發(fā)明所提供的診斷結(jié)直腸癌的特異性為87. 2%，敏感度為65. 0%。
[0033] 以上公開的僅為本申請(qǐng)的幾個(gè)具體實(shí)施例，但本申請(qǐng)并非局限于此，任何本領(lǐng)域 的技術(shù)人員能思之的變化，都應(yīng)落在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 人血小板反應(yīng)蛋白THBS2作為檢測(cè)結(jié)直腸癌的血清標(biāo)記物的應(yīng)用。2. 人血小板反應(yīng)蛋白THBS2在制備結(jié)直腸癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。3. 如權(quán)利要求2所述的人血小板反應(yīng)蛋白THBS2在制備結(jié)直腸癌診斷試劑盒中的應(yīng) 用，其特征在于以常規(guī)方法制備抗人血小板反應(yīng)蛋白THBS2的抗體，建立檢測(cè)人血小板反 應(yīng)蛋白THBS2的定性或定量方法及配套的試劑盒。4. 如權(quán)利要求2所述的人血小板反應(yīng)蛋白THBS2在制備結(jié)直腸癌診斷試劑盒中的應(yīng) 用，其特征在于抗人血小板反應(yīng)蛋白THBS2的抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。5. -種結(jié)直腸癌診斷試劑盒，包括固相、位于固相中的抗體、酶標(biāo)記抗體，其特征在于 所述的抗體為抗人血小板反應(yīng)蛋白THBS2的抗體。6. 如權(quán)利要求5所述的一種結(jié)直腸癌診斷試劑盒，其特征在于抗人血小板反應(yīng)蛋白 THBS2的抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
【專利摘要】THBS2作為直腸癌血清標(biāo)記物的應(yīng)用及診斷試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明一方面提供THBS2作為直腸癌血清標(biāo)記物的應(yīng)用的技術(shù)方案，另一方面提供結(jié)直腸癌診斷試劑盒的技術(shù)方案。本發(fā)明的有益效果在于：1.提供的血清生物標(biāo)志物的特異性為87.2%，敏感性為65.0%，具有較高特異性和敏感性。2.提供一種靈敏、可靠、可操作的方法，定量測(cè)定人血清中THBS2抗原水平，有助于輔助早期診斷結(jié)直腸癌。
【IPC分類】G01N33/574, G01N33/577
【公開號(hào)】CN105092846
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510433036
【發(fā)明人】胡曉彤, 何超, 費(fèi)偉強(qiáng)
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院
【公開日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2015年7月22日