一種用于診斷肝癌的聯(lián)合型代謝標志物及其檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分析化學(xué)，生物化學(xué)以及臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一，致死 率高。中國是世界上肝癌發(fā)病率最高的地區(qū)之一，大部分肝癌病人主要由肝硬化發(fā)展形成。 肝癌早期癥狀不明顯，具有進展迅速、易早期轉(zhuǎn)移的特點，在臨床上早診困難、預(yù)后效果差。 當前，B型超聲顯像、腫瘤標志物甲胎蛋白（a-fetoprotein, AFP)的血清含量檢查是肝癌 篩查的主要方法。然而，B超在小肝癌和肝硬化結(jié)節(jié)的鑒別上常有困難。甲胎蛋白（AFP)血 清水平在診斷肝癌時存在敏感性和特異性較低的缺點，單獨用于確診時的檢出率一般只有 50%-75%左右。以上方法的局限性極大地限制了肝細胞癌的早期有效診斷，預(yù)警作用有 限。對于肝細胞癌的早期有效診斷有助于顯著提高患者的生存率，因此，開發(fā)具有臨床早診 潛力的新方法對于降低肝細胞癌的發(fā)病率和死亡率具有非常重要的現(xiàn)實意義。
[0003] 近年來，代謝組學(xué)技術(shù)作為一個新的有力工具，被廣泛運用于疾病研究中。色譜質(zhì) 譜聯(lián)用技術(shù)是代謝組學(xué)的主要研究手段，其檢測小分子代謝物在疾病診斷中的應(yīng)用已有成 功的案例，包括基于檢測多種氨基酸的新生兒疾病篩查、檢測肌氨酸的前列腺癌判別等。由 于單一代謝物所受影響因素較多，因此從血清代謝譜中優(yōu)選出由少數(shù)代謝物構(gòu)成的"聯(lián)合 型的代謝標志物"，并以判別公式計算"判別可能性" P值（Probability)，能夠顯著改善代 謝物對疾病診斷的靈敏度以及特異性?？紤]到體內(nèi)極性代謝物在腫瘤生成及抑制方面的關(guān) 鍵調(diào)控作用，本發(fā)明采用基于毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用的代謝組學(xué)技術(shù)和研究方法，檢測血 清中的極性代謝物，經(jīng)過生物信息學(xué)分析，篩選目標代謝物，旨在肝細胞癌的診斷中進行應(yīng) 用。
[0004] 本發(fā)明從利用毛細管電泳-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用獲取的肝癌患者，肝硬化患者以及 正常人的血清代謝譜中，經(jīng)多次優(yōu)選，確定了基于色氨酸、谷氨酰胺及2-羥基丁酸的聯(lián)合 使用，以作為一種聯(lián)合型的代謝標志物在判斷肝癌中的新用途。該組代謝物分別是體內(nèi)參 與生理過程的重要代謝物。色氨酸參與調(diào)控腫瘤的免疫抑制，谷氨酰胺參與腫瘤能量代謝 及合成過程，而2-羥基丁酸與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，目前尚無將該三種代謝物聯(lián)合用于肝癌 診斷的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對肝細胞癌早期診斷困難尤其是與肝硬化患者難以區(qū)分的臨 床實際問題，提供了一種基于新的小分子極性代謝物的組合對肝癌患者有效判斷的新用 途，并提供用于上述小分子代謝物的檢測方法。
[0006] 該代謝物聯(lián)合標志物包括下列三種代謝物：色氨酸、谷氨酰胺以及2-羥基丁酸。 其中，色氨酸在質(zhì)譜正離子模式下檢測到的質(zhì)核比為205. 0972,谷氨酰胺正離子模式下的 質(zhì)核比147. 0764 ;2_羥基丁酸在質(zhì)譜負離子模式下檢測到的質(zhì)核比為103. 0401。
[0007] 上述三種物質(zhì)的檢測試劑盒如下：
[0008] 標準品：包括色氨酸、谷氨酰胺、2-羥基丁酸，所述標準品分別用于對應(yīng)的血清代 謝物色氨酸、谷氨酰胺、2_羥基丁酸的定性；用于預(yù)處理來自受試者的血清樣品的提取液： 包含內(nèi)標物5-10 μ M的蛋氨酸砜，5-10 μ M的D-樟腦-10-磺酸鈉鹽或穩(wěn)定同位素標記的色 氨酸、谷氨酰胺、2-羥基丁酸，及其它穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)源性小分子代謝物的甲醇溶液； 用于毛細管電泳-質(zhì)譜分離的緩沖液，包括IM甲酸（正離子模式下采用），50mM的乙酸銨 (PH值以氨水調(diào)節(jié)至8. 5,負離子模式下采用）。
[0009] 計算受試者血清樣品中的聯(lián)合標志物變量P的方法如下：
[0010] 1)受試者樣本處理：以血清樣品的提取液處理來自受試者的血清樣本，然后進一 步提取極性代謝物。
[0011] 2)以毛細管電泳-質(zhì)譜對經(jīng)步驟1)處理的血清樣本進行分離，并由質(zhì)譜檢測。
[0012] 3)經(jīng)毛細管電泳-質(zhì)譜分析后，所得電泳峰強度與分別與內(nèi)標物比較，正離子與 蛋氨酸砜（或同位素內(nèi)標），負離子與D-樟腦-10-磺酸鈉鹽（或同位素內(nèi)標）相比較，獲 得上述三種物質(zhì)的相對濃度。
[0013] 4)進一步將色氨酸、谷氨酰胺及2-羥基丁酸回歸為聯(lián)合標志物變量P，二元邏輯 回歸方程如下：
[0014] P I y ( I+e (14. 315+0. 776a 13. 437b 0. 829c))
[0015] 其中，a為血清中2-羥基丁酸的相對含量，b為血清中色氨酸的相對含量，c為血清 中谷氨酰胺的相對含量。所得變量P在肝細胞癌患者中增高，該變量值可用于輔助判斷肝 細胞癌。本發(fā)明確定的該聯(lián)合標志物的對肝癌判斷的最佳截點值（cut-off值）設(shè)為0. 424， 高于該截點值的則可能為肝細胞癌。也可以根據(jù)實驗者的實際結(jié)果通過二元邏輯回歸得到 新的方程，并定義該實驗室的最佳截點值。截點值的確定依據(jù)為根據(jù)聯(lián)合標志物變量P值 作受試者工作特征曲線（R0C曲線），取靈敏度與特異性之和最大的P值作為最佳截點值。
[0016] 該聯(lián)合型代謝標志物用途：將肝細胞癌與肝硬化患者及正常人進行有效區(qū)分，適 用于腫瘤直徑小于3cm的小肝癌患者與肝硬化患者的區(qū)分，以及AFP陰性（<20ng/mL)肝癌 患者與肝硬化患者的區(qū)分。
[0017] 本發(fā)明原理如下：
[0018] (1)利用毛細管電泳-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用的代謝組學(xué)分析技術(shù)，對正常人、肝硬化 患者、肝細胞癌患者的血清樣本進行代謝輪廓分析，獲得代謝物定性定量分析結(jié)果。
[0019] (2)基于多種生物信息學(xué)數(shù)據(jù)處理方式結(jié)合的策略，進行標志物的發(fā)現(xiàn)。具體實施 方式為：
[0020] a)多變量分析：建立三組樣本的偏最小二乘判別分析模型，代謝物挑選條件：在 第一、二主成分上的重要性因子（VIP)值同時大于1 ;重要性因子的置信區(qū)間為正；在第一 或第二主成分上的協(xié)方差（P(Corr))絕對值大于0.3。
[0021] b)單變量分析：采用非參數(shù)檢驗法，挑選滿足肝癌組與正常對照組、肝癌組與硬 化組同時具有顯著性差異（P〈〇. 05)的代謝物。
[0022] c)以上兩種分析方法獲得交集代謝物，在z值圖中觀察他們在三組樣本中含量分 布，并驗證含量的置信區(qū)間。排除z值分布過大，含量置信區(qū)間為負的代謝物。
[0023] d)假陽性率（FDR)評價，只保留FDR值小于1. 5%的代謝物。
[0024] e)相關(guān)性分析，篩選與臨床腫瘤標志物甲胎蛋白（a-fetoprotein, AFP)的血清 含量相關(guān)性小的代謝物，作為獲選標志物。
[0025] (3)應(yīng)用另一批正常人、肝硬化和肝癌患者（含小肝癌）血清樣本對以上篩選出 的候選物進行驗證。同時結(jié)合Forward Stepwise(Wald)方法，優(yōu)選出色氨酸、谷氨酰胺和 2_羥基丁酸這一聯(lián)合標志物組合。
[0026] 本發(fā)明具有如下效果：
[0027] 血清中的色氨酸、谷氨酰胺、2-羥基丁酸構(gòu)成的聯(lián)合標志物其衍生的聯(lián)合標志物 變量P，能夠?qū)Ω渭毎┰\斷很好的識別，并與AFP具有較好的互補性。本發(fā)明涉及的檢測 試劑盒，對上述代謝物組合的檢測，具有簡便，快速重復(fù)性好的優(yōu)點，適于肝癌的早期篩查 和以及對傳統(tǒng)標志物及臨床診斷方法的輔助應(yīng)用。
【附圖說明】
[0028] 圖1.色氨酸、谷氨酰胺、2-羥基丁酸在發(fā)現(xiàn)集與驗證集各組樣本中的含量變化 (均值土標準偏差表示）。*表示與正常對照組具有顯著性差異，#表示與肝硬化組具 有顯著性差異，&表示小肝癌與一般肝癌組具有顯著性差異。*(或#，&):0.01〈P〈0.05， **(##):〇· 001〈ρ〈0· 01，***(###) :ρ〈〇· 001。
[0029] 圖2. (A)實例I (發(fā)現(xiàn)集）中聯(lián)合標志物用于診斷肝細胞癌與非癌（正常人與肝 硬化）的ROC曲線圖。（B)實例2(驗證集）中聯(lián)合標志物用于診斷所有肝細胞癌與非癌 (正常人與肝硬化）的ROC曲線圖。（C)實例2(驗證集）中聯(lián)合標志物和AFP用于診斷所 有肝細胞癌與肝硬化的ROC曲線圖。（D)實例2(驗證集）中聯(lián)合標志物和AFP用于診斷小 肝癌與肝硬化的ROC曲線圖。
[0030] 圖3.聯(lián)合標志物用于肝細胞癌的判別。截點值為0.424。
[0031] 圖4.聯(lián)合標志物與AFP用于判別假陽性與假陰性患者的比較。
【具體實施方式】
[0032] 實施例1
[0033] 1.血清樣品收集
[0034] 所有納入研究的志愿者在血清樣品采集前均簽署了知情同意書。
[0035] 在相同條件下收集30例正常人、確診的25例肝硬化和22例肝細胞癌患者的血 樣，采集后靜置60分鐘后直接取血清，儲存于_80°C的冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0036] 2.分析方法
[0037] 2. 1血清樣本預(yù)處理
[0038] 樣品在4°C條件下解凍，取50 μ L血清，加入450 μ L包含定量內(nèi)標的甲醇提取液 (包含10 μ M的蛋氨酸砜和10 μ M的D-樟腦-10-磺酸鈉鹽），渦旋振蕩30秒。繼續(xù)加入 500 μ L氯仿及200 μ L水，渦旋振蕩1分鐘。靜置5分鐘后，4°C 5000g條件下離心10分鐘， 取450 μ L上層溶液放置于5kDa的超濾管中進行超濾離心,條件為14000g, 4°C, 3小時。最 終將濾液凍干，采用純水復(fù)溶后上樣分析。
[0039] 2. 2毛細管電泳質(zhì)譜分析
[0040] (1)電泳條件：采用毛細管電泳系統(tǒng)（G7100A，A