一種甲氧檗因測定的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于化學(xué)發(fā)光技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種甲氧檗因測定的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小分子甲氧檗因是一種新月形的平面生物堿，當(dāng)與富含A堿基的DNA作用時(shí)， 一個(gè)甲氧檗因分子可特異性的結(jié)合四個(gè)A堿基。目前，基于甲氧檗因與富含A堿基的 DNA的特異性結(jié)合，已經(jīng)建立了多種用于甲氧檗因的檢測方法。近年來甲氧檗因測定 方法主要有：基于納米銀顆粒的免標(biāo)記比色方法（LvZZ，WeiH，LiBL.Colorimetric recognitionofthecoralyne-poly(dA)interactionusingunmodifiedgold nanoparticleprobes,andfurtherdetectionofcoralynebaseduponthis recognitionsystem.Analyst. 2009, 134(8) : 1647-1651);基于納米銀顆粒的免標(biāo)記 比色方法對(duì)甲氧檗因的檢測方法（XuXW,WangJ,YangF.Label-freecolorimetric detectionofsmallmoleculesutilizingDNAoligonucleotidesandsilver nanoparticles.Small. 2009,5(23):2669-2672);光度法（HouT，LiCX，WangXZ，Zhao C,LiF.Label-freecolorimetricdetectionofcoralyneutilizingperoxidase-like splitG-quadruplexDNAzyme.AnalyticalMethods. 2013. 5 ;4671 _ 4674);雙偏振 干涉法(WangY,WangJ，YangF.Probingbiomolecularinteractionswithdual polarizationinterferometry:real-timeandlabel-freecoralynedetectionbyuse ofhomoadenineDNAoligonucleotide.AnalyticalChemisty. 2012,84(2):924_930)和 焚光法（ZhangP,WangY,LengF,XiongZH,HuangCZ.Highlyselectiveandsensitive detectionofcoralynebasedonthebindingchemistryofaptamerandgraphene oxide.Talanta. 2013. 15 ;112:117-22)等。但是，這些方法的各有其缺點(diǎn)，本發(fā)明利用MoS2 為載體，以異硫氰酸熒光素FITC為標(biāo)記物，實(shí)現(xiàn)了甲氧檗因的測定，具有方法簡單、成本 低、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的是提供一種測定甲氧檗因的方法，利用M〇S2為載體，以硫氰酸熒光素 FITC為標(biāo)記物，光二極管誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光為檢測方法，實(shí)現(xiàn)甲氧檗因的測定。
[0004] 技術(shù)方案
[0005] -種甲氧檗因測定的方法，其特征在于用M〇S2為載體，以硫氰酸熒光素FITC為標(biāo) 記物，光二極管誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光為檢測方法，實(shí)現(xiàn)甲氧檗因的測定，測定步驟如下：
[0006] (l)M〇S2的制備，制備、儲(chǔ)存M〇S2溶液所用的玻璃容器：容量瓶、棕色廣口瓶和圓 底燒瓶等用王水浸泡后，用二次蒸餾水洗滌干凈后，吹干備用。然后，將M〇S2粉體分散到二 甲基甲酰胺DMF中，得到MoS^DMF溶液。將該溶液在室溫下超聲。然后離心分離，離心 10min得到黑色沉淀。最后，收集沉淀物，經(jīng)過水洗滌，然后再分散于lmL水中。
[0007] (2)異硫氰酸熒光素標(biāo)記的探針DNA在MoS^面組裝，將100yL8ygmL1的MoS2 溶液與100yLlOnmol1的異硫氰酸熒光素標(biāo)記DNA探針溶液混合，室溫下反應(yīng)20分鐘；
[0008] (3)甲氧檗因的測定，取100yL含有甲氧檗因的樣品溶液加入到上述⑵的溶液 中，室溫下，反應(yīng)20分鐘。然后在12000轉(zhuǎn)/分鐘條件下，離心分離10分鐘。取上清液加 入到含有200iiLpH11.3的魯米諾溶液的小燒杯中，打開光二極管，15秒后關(guān)閉光二極 管，用化學(xué)發(fā)光儀檢測化學(xué)發(fā)光信號(hào)，根據(jù)化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度對(duì)目標(biāo)物甲氧檗因進(jìn)行定量 分析；
[0009] 本發(fā)明的化學(xué)試劑優(yōu)選分析純?cè)噭腥芤壕枚握麴s水配置。
[0010] 本發(fā)明的DNA序列為 5' -FITC-AAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'。
[0011] 本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光測定選用MPI-E型化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)（西安瑞邁分析儀器有限 公司）。
[0012] 本發(fā)明的離心機(jī)選用Anke-TGL_16C飛翁牌高速離心機(jī)（上海市安亭科學(xué)儀器 廠）。
[0013] 本發(fā)明的LED選用PHS-3D型酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）。
[0014] 本發(fā)明的顯著效果
[0015] 本發(fā)明研究了甲氧檗因與發(fā)光強(qiáng)度之間的關(guān)系，得到了檢測甲氧檗因的標(biāo)準(zhǔn)曲 線，線性范圍及線性方程。
[0016] 當(dāng)甲氧檗因的濃度在5nM-700nM之間時(shí)，隨著甲氧檗因濃度的變化，化學(xué)發(fā)光強(qiáng) 度有明顯變化，其線性回歸方程是Ia= 9. 9445X-70. 391(I是體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度；x是 甲氧檗因的濃度，nM;n= 12,n表示同一濃度測定次數(shù)，R2= 0. 9990)，檢測限是InM。
[0017] 該測定方法的精密度通過對(duì)濃度為30nM的甲氧檗因進(jìn)行11次平行測定而計(jì)算得 出，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4. 3%，表明本發(fā)明的測定方法有較好的重現(xiàn)性。
【附圖說明】
[0018] 圖1.硫氰酸熒光素標(biāo)記物DNA測定甲氧檗因的原理圖。
[0019] 圖2.甲氧檗因標(biāo)準(zhǔn)曲線。橫坐標(biāo)是甲氧檗因濃度C_，縱坐標(biāo)為化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度Ia。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 按照技術(shù)方案的步驟（1)至（3)得到甲氧檗因標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2);甲氧檗因購于 SigmaAldrich;M〇S2溶液均購于天津市博迪化工有限公司；魯米諾溶液購于上海晶純生化 科技股份有限公司；二甲基甲酰胺（DMF)購自上?；瘜W(xué)試劑廠；異硫氰酸熒光素標(biāo)記DNA 購自上海賽百盛基因技術(shù)有限公司。
[0021] 根據(jù)發(fā)明的方法對(duì)甲氧檗因含量進(jìn)行了測定，并采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)方法進(jìn)行了評(píng) 價(jià)，樣品測定回收率為96. 7 - 101. 5%，測定結(jié)果見表1，本發(fā)明的方法在甲氧檗因檢測中 具有精密度高的特點(diǎn)。
[0022] 表1.樣品分析測定結(jié)果
[0023]
[0024] a 7次測量結(jié)果
[0025] b單位：nM。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種甲氧檗因測定的方法，其特征是包括以下步驟： (1) 將100 y L 8 y g mL 1的MoS 2溶液與100 y L IOnmol噸1的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的 DNA探針混合，室溫下反應(yīng)20分鐘； (2) 取IOOiiL含有甲氧檗因的樣品溶液加入到上述（1)的溶液中，室溫下，反應(yīng)20分 鐘； (3) 然后，在12000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下，離心分離10分鐘，取上清液加入到含有200 y L pH 11. 3的魯米諾溶液的小燒杯中，打開光二極管，15秒后關(guān)閉光二極管，用化學(xué)發(fā)光儀檢 測化學(xué)發(fā)光信號(hào)，根據(jù)化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度對(duì)目標(biāo)物甲氧檗因進(jìn)行定量分析。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的一種甲氧檗因測定的方法，其特征在于所述的MoS 2溶液按如下方 法制備而成：將此&粉體分散到得到二甲基甲酰胺DMF中，得到Img ? mL 1溶液，將該溶液 在室溫下超聲4小時(shí)，然后在8000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下，離心10min得到黑色沉淀，最后，收 集沉淀物，經(jīng)過水洗滌，然后再分散于ImL水，形成0.1 mg ? mL 1的溶液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1的一種甲氧檗因測定的方法，其特征在于所述的魯米諾溶液按如下 方法配置而成：準(zhǔn)確稱取177mg魯米諾于燒杯中，并加入IOOmL 0.1 M的氫氧化鈉將其溶解， 配置好的溶液避光保存兩周后使用。4. 根據(jù)權(quán)利要求1的一種甲氧檗因測定的方法，其特征在于所述的DNA的部分序列為 5' -FITC-AAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'。
【專利摘要】一種甲氧檗因測定的方法，屬于化學(xué)發(fā)光技術(shù)領(lǐng)域，其特征是利用以硫氰酸熒光素FITC標(biāo)記DNA為信號(hào)探針，以MoS2為載體將探針吸附在其表面，當(dāng)含甲氧檗因的樣品溶液加入后，甲氧檗因與探針作用使得探針脫離MoS2載體表面，離心分離后上清液在光二極管照射下產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，根據(jù)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)弱實(shí)現(xiàn)了甲氧檗因的檢測。本發(fā)明方法簡單、成本低。
【IPC分類】G01N21/76
【公開號(hào)】CN105004713
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510325745
【發(fā)明人】混旭, 李庚
【申請(qǐng)人】青島科技大學(xué)
【公開日】2015年10月28日
【申請(qǐng)日】2015年6月12日