L、100ng/mL、200ng/mL的回收率分別為86. 1%、 90. 4%、97. 0% ;RSD%分別為 3. 3、3. 5、2. 0。
[0145] 鉤吻素子添加濃度分別為50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分別為85. 6%、 89. 8%、94. 9% ;RSD%分別為 3. 7、3. 2、1. 3。
[0146] 鉤吻素甲和鉤吻素子在10~1000ng/mL濃度范圍內(nèi)均有著良好的線性關(guān)系。
[0147] 鉤吻素甲添加濃度分別為50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD% (日內(nèi)）分別為 1. 43、2. 96、2. 57, RSD% (日間）分別為 3. 31、2. 67、4. 01。
[0148] 鉤吻素子添加濃度分別為50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD% (日內(nèi)）分別為 1. 53、2. 70、2. 19, RSD% (日間）分別為 3. 40、2. 65、4. 00。
[0149] 以信噪比10/1計(jì)，該方法的最小定量限為0. 2ng/mL，以信噪比3/1計(jì)，該方法的最 小檢出限為0. 08ng/mL。
[0150] 實(shí)施例4利用新鮮血液對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)
[0151] 1、試劑，同實(shí)施例1。
[0152] 2、儀器和材料，同實(shí)施例2。
[0153] 3、樣品萃取
[0154] 分別取空白的新鮮血液1.OmL于具塞試管中；分別添加鉤吻素甲和鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn) 品制備成添加樣品，混勾。
[0155] 分別加入pH 5. 8磷酸鹽緩沖液5mL，充分混旋，超聲15min，8000r/min以上高速離 心20min，取上清液待過柱。取3CC HLB固相小柱依次以3mL甲醇、3mL水活化，將離心后的 上清液分別過柱，流速為1.OmL/min;再以3mL去離子水和3ml0. 5%甲醇水溶液先后淋洗小 柱；用2mL甲醇洗脫，收集洗脫液置于50°C快速濃縮儀上吹干，殘?jiān)?000 yL初始流動(dòng)相 定容，過0. 22 y m微孔有機(jī)濾膜，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。
[0156] 4、儀器檢測(cè)
[0157] 4. 1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀條件
[0158] 以下為參考條件，可根據(jù)不同品牌儀器和不同樣品等實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整：
[0159] 色譜柱：kinetexC18 (3. OmmX 50mm，2. 6 y m 柱或等效色譜柱；
[0160] 流動(dòng)相及梯度洗脫條件見表1 ;
[0161] 表1流動(dòng)相和梯度洗脫條件
[0162]
[0163]進(jìn)樣量：lyL ~10yL;
[0164] 掃描方式：正離子掃描（ESI+);
[0165] 檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM);
[0166] 電噴霧電壓：5500V;
[0167] 離子源溫度：650°C;
[0168] 霧化氣壓力：55psi ;
[0169] 氣簾氣壓力：50psi ;
[0170] 輔助氣壓力：50psi ;
[0171] 監(jiān)測(cè)離子對(duì)、去簇電壓、碰撞能參見表2。
[0172] 表2監(jiān)測(cè)離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能
[0173]
[0174] 鉤吻素甲添加濃度分別為50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分別為88. 3%、 93. 1%、98. 9% ;RSD%分別為 3. 0、3. 3、1. 0。
[0175] 鉤吻素子添加濃度分別為50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的回收率分別為87. 5%、 92. 8%、99. 0% ;RSD%分別為 3. 2、3. 0、1. 0。
[0176] 鉤吻素甲和鉤吻素子在10~1000ng/mL濃度范圍內(nèi)均有著良好的線性關(guān)系。
[0177] 鉤吻素甲添加濃度分別為50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD% (日內(nèi)）分別為 1. 30、2. 53、2. 12, RSD% (日間）分別為 3. 25、2. 43、4. 00。
[0178] 鉤吻素子添加濃度分別為50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的RSD% (日內(nèi)）分別為 1. 28、2. 63、2. 11，RSD% (日間）分別為 3. 30、2. 52、4. 01。
[0179] 以信噪比10/1計(jì)，該方法的最小定量限為0. 2ng/mL，以信噪比3/1計(jì)，該方法的最 小檢出限為0. 08ng/mL。
[0180] 實(shí)施例3和實(shí)施例4中，回收率的計(jì)算、線性關(guān)系的得出、以及日內(nèi)和日間精密度， 均采用現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)方法：以測(cè)得的添加各生物樣品中鉤吻素甲或鉤吻素子的峰面積 與相同濃度鉤吻素甲或鉤吻素子標(biāo)準(zhǔn)工作溶液峰面積的比值來計(jì)算回收率。用測(cè)得的鉤吻 素甲或鉤吻素子的峰面積（Y)對(duì)生物樣品待萃取標(biāo)準(zhǔn)液中鉤吻素甲或鉤吻素子濃度（X)求 得線性回歸，得到回歸方程，進(jìn)而得到線性關(guān)系。計(jì)算鉤吻素甲或鉤吻素子峰面積的相對(duì)標(biāo) 準(zhǔn)偏差，得到日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)三天，計(jì)算鉤吻素甲或鉤吻素子峰面積三天的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏 差，得到日間精密度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 生物檢材中鉤吻素甲和鉤吻素子的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，其特征在于，包 括如下步驟： a) 樣品前處理：取生物液體樣品或生物組織樣品剪碎于具塞試管中；上述樣品加一定 量的氫氧化鈉溶液調(diào)p!19~10,加入乙酸乙酯，振蕩lOmin，高速離心10min ;分離有機(jī)相 后，加有機(jī)溶劑進(jìn)行第二次提取，合并兩次有機(jī)相，置于50°C濃縮儀上揮干；殘?jiān)贸跏剂?動(dòng)相定容，過〇. 22 y m微孔有機(jī)濾膜，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析； b) 樣品分析： 色譜柱：kinetex C18 ;進(jìn)樣量：1 y L~10 y L ;流動(dòng)相：A為含0? 1 %甲酸的IOmM甲酸 銨，B 為甲醇；梯度洗脫：0? 2min，A 為 95%，B 為 5% ;3. Omin，A 為 5%，B 為 95% ;5. Omin，A 為5%，8為95%;5.11^11^為95%，8為5%;7.〇111111^為95%，8為5% ;流速為0.511117 min ； 離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描（ESI+);檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM); 電噴霧電壓：5500V ;離子源溫度：650°C ;霧化氣壓力：55psi ;氣簾氣壓力：50psi ;輔助氣 壓力：50psi。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其中a)樣品前處理還能夠替換為：取生物液體樣 品或生物組織樣品剪碎于具塞試管中；加入pH 5. 8磷酸鹽緩沖液，充分混旋，超聲15min， 8000r/min以上高速離心20min，取上清液待過柱；取3CC HLB固相小柱依次以3mL甲醇、 3mL水活化，將離心后的上清液分別過柱，流速為0. 5mL/min~1.0 mL/min ;再以3mL去離子 水和3ml0. 5%甲醇水溶液先后淋洗小柱；用2mL甲醇洗脫，收集洗脫液置于50°C快速濃縮 儀上吹干，殘?jiān)贸跏剂鲃?dòng)相定容，過0. 22 y m微孔有機(jī)濾膜，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 儀分析。3. 根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的檢測(cè)方法，其中液體樣品為血液、尿液、唾液；所述組織樣 品為肝臟、腎臟。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的檢測(cè)方法，其中C18柱為3. OmmX 50mm，2. 6 y m柱或等效色 譜柱。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的檢測(cè)方法，其中取生物液體樣品1.0 mL-2. OmL ;或者生物組 織樣品 1.0 g-2. Og。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的檢測(cè)方法，其中乙酸乙酯的加入量為5. OmL-IO. OmL。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的檢測(cè)方法，其中殘?jiān)?00 y L-1000 y L初始流動(dòng)相定容。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其中磷酸鹽緩沖液的加入量為3mL-5mL。9. 權(quán)利要求1-2所述的檢測(cè)方法的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于生物樣品中鉤吻素甲和 鉤吻素子的定性定量檢驗(yàn)，以及適用于體外樣品和可疑物證的檢驗(yàn)。10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中生物樣品為血、尿、肝、腎。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物檢材中鉤吻素甲和鉤吻素子的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，包括如下步驟：取生物液體樣品或生物組織樣品剪碎于具塞試管中；上述樣品加一定量的氫氧化鈉溶液調(diào)pH9～10，加入乙酸乙酯，振蕩10min，高速離心10min；分離有機(jī)相后，加有機(jī)溶劑進(jìn)行第二次提取，合并兩次有機(jī)相，置于50℃濃縮儀上揮干；殘?jiān)贸跏剂鲃?dòng)相定容,過0.22μm微孔有機(jī)濾膜，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單高效、快速靈敏、準(zhǔn)確度高，具有廣泛的實(shí)用性，能夠應(yīng)用于生物樣品中鉤吻素甲和鉤吻素子的定性定量檢驗(yàn)，以及適用于體外樣品和可疑物證的檢驗(yàn)。
【IPC分類】G01N30/06, G01N30/88
【公開號(hào)】CN104991019
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510370312
【發(fā)明人】王芳琳, 欒玉靜, 姚伊人, 應(yīng)劍波, 劉耀
【申請(qǐng)人】公安部物證鑒定中心
【公開日】2015年10月21日
【申請(qǐng)日】2015年6月29日