一種生物樣本中peg化藥物的定量測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物分析研宄技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種生物樣本中PEG化藥物的定量測 定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG)是優(yōu)良的水溶性高分子化合物，pH中性， 無毒，是經(jīng)FDA批準(zhǔn)的少數(shù)可以體內(nèi)注射的合成聚合物之一。小分子藥物尤其是抗腫瘤藥 物普遍存在水溶性差、半衰期短、生物組織分布靶向性差、毒性大等缺陷，極大地限制了其 臨床應(yīng)用。PEG親水性好，沒有免疫原性。PEG修飾藥物以后，可以明顯改善藥物分子的水溶 性，提高難溶性藥物的生物利用度。同時，由于PEG的空間位阻效應(yīng)，使藥物能夠緩慢的從 結(jié)合物的形式中釋放出來或者需要在一定的pH或酶存在的條件下才能釋放，具有很好的 緩釋控釋作用，因此改善了藥物的半衰期，延長了藥物在生物體內(nèi)的作用時間，為減少給藥 次數(shù)和保障用藥安全提供了一定的可能性。PEG化藥物研宄的關(guān)鍵問題在于：PEG化藥物引 起藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)是游離出來的小分子藥物。因此此類藥有兩種狀態(tài)：PEG化藥和游離藥。 對PEG化藥物的藥代動力學(xué)過程分析的主要方法是免疫法和放射性標(biāo)記法。由于PEG化的 藥物在體內(nèi)可能會代謝為游離的藥物分子和PEG基團，基于PEG化的抗體無法有效地對PEG 化藥物以及游離型藥物進行區(qū)分，而放射性標(biāo)記法有放射性污染和危害，不適用于人體，因 此，這些方法有著明顯的局限性。目前，尚沒有區(qū)分PEG化藥物的游離和鍵合狀態(tài)，并測定 其在血液、組織、細胞中準(zhǔn)確含量和動態(tài)變化的可信賴的方法。
[0003] 近年來，迅速發(fā)展的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS)憑借其在定量分析 方面的出色表現(xiàn)，為藥物的藥代動力學(xué)研宄提供了良好的解決方案。建立一種PEG化小分 子藥物的生物質(zhì)譜絕對定量方法，對PEG化藥物的藥代動力學(xué)和藥效、藥理研宄，有著非常 重要的意義。LC-MS/MS定量的流程是：色譜分離、離子、質(zhì)荷比（m/z)掃描、選擇特定m/z進 行定量。在眾多掃描方式中，三重四級桿質(zhì)量分析器的多重反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)選擇性好， 靈敏度高，已經(jīng)成為LC-MS/MS分析中最常用的定量方式。這種模式的定量思路是：離子化、 第一個四級桿（Q1):選擇一個特定的離子作為母離子，并只允許這一種離子通過、第二個四 級桿（Q2):母離子被碰撞能量打成碎片、第三個四級桿（Q3):從產(chǎn)生的碎片中選擇一個響應(yīng) 高且穩(wěn)定的碎片作為子離子、測定選擇的母子離子對的含量。所以這種模式必須在知道待 測化合物母離子和子離子的準(zhǔn)確m/z的前提下才能進行。
[0004] 而PEG是由一系列以乙二醇為基本單元組成的高分子混合物，其分子量不是唯一 的值，而是以某個聚合度的分子量平均值為中心呈正態(tài)分布，如：PEG 4000其實是以分子 量4000為中心呈正態(tài)分布的多種分子量PEG分子的混合物；PEG600、PEG4000、PEG6000、 PEG10000均為多種分子量PEG分子的混合物；因此這給以待測化合物目標(biāo)分子量為基礎(chǔ)的 LC-MS/MS定量分析帶來了挑戰(zhàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，建立一種可以同時測定PEG化藥物的游離藥物和鍵 合藥物的不依賴于分析物母離子分子質(zhì)量的非傳統(tǒng)生物質(zhì)譜絕對定量方法，該測定方法不 受PEG化藥物中PEG分子量不同的影響，簡便易行，準(zhǔn)確可靠。本發(fā)明的目的是通過以下技 術(shù)方案實現(xiàn)的。
[0006] -種生物樣本中PEG化藥物的定量測定方法，采用液相色譜-飛行時間質(zhì)譜進行 測定，測定步驟包括： A. 建立游離藥物測定標(biāo)準(zhǔn)曲線和PEG化藥物測定標(biāo)準(zhǔn)曲線； B. 使用液相色譜_飛行時間質(zhì)譜測定待測樣品，通過步驟A所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測 樣本中游離藥物濃度和PEG化藥物濃度； 步驟A和步驟B的色譜條件和質(zhì)譜條件相同，其中質(zhì)譜條件基于三重串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，步 驟A和步驟B質(zhì)譜部分的設(shè)定為：第一個質(zhì)量分析器Q1中不選擇母離子，帶電粒子全部通 過后進入第二個質(zhì)量分析器Q2;在第二個質(zhì)量分析器Q2中設(shè)置碰撞能量，將帶電粒子打碎 成碎片離子；在第三個質(zhì)量分析器離子阱或者飛行時間質(zhì)量分析器選取穩(wěn)定的PEG化藥物 特征碎片離子和游離藥物特征碎片離子，來定量PEG化藥物和游離藥物。
[0007] 進一步的，所述PEG化藥物特征碎片離子為3個乙二醇重復(fù)單元，PEG化藥物特征 碎片離子 m/z 為 133. 083~133. 086。
[0008] 進一步的，所述PEG化藥物特征碎片離子m/z為133. 08592。
[0009] 進一步的，所述質(zhì)譜操作部分第二個質(zhì)量分析器Q2中碰撞電壓為37eV。
[0010] 進一步的，所述質(zhì)譜操作部分第二個質(zhì)量分析器Q2中碰撞電壓為70eV。
[0011] 進一步的，步驟A和步驟B中所述質(zhì)譜條件為：離子源：ESI離子化源；正離子方式 檢測；離子噴射電壓4000 V ;溫度550°C ;源內(nèi)氣體1 :氮氣壓力40 psi ;氣體2 :氮氣壓力 40 psi ;氣簾氣體：氮氣壓力30 psi ;解簇電壓（DP電壓）：91 V ;掃描方式為TOF MS Scan 或者 EMS Scan。
[0012] 進一步的，步驟A和步驟B中所述色譜條件為：流動相：含體積百分?jǐn)?shù)占0. 1%甲酸 的水和含體積百分?jǐn)?shù)占〇. 1%甲酸的乙腈，梯度洗脫；柱溫30°C。
[0013] 進一步的，所述步驟A具體操作程序為： 1)制備梯度稀釋的不同濃度的游離藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液和PEG化藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液； 2 )將程序1)中所得游離藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液和PEG化藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣到高效液相色譜-飛 行時間質(zhì)譜中分析； 3)記錄色譜圖，以游離藥物和PEG化藥物濃度為橫坐標(biāo)，游離藥物和PEG化藥物峰面積 為縱坐標(biāo)，用加權(quán)W=l/x2最小二乘法進行回歸運算，求得的直線回歸方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0014] 進一步的，所述步驟B具體操作程序為： 1) 于抗吸附管中加入待測樣本溶液、內(nèi)標(biāo)溶液及預(yù)冷的乙腈后渦流混勻，離心后取上 清液進樣到高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜中分析； 2) 記錄色譜圖，將程序1)中獲取的游離藥物和PEG化藥物面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得游 離藥物和PEG化藥物濃度。
[0015] 本發(fā)明的優(yōu)勢在于： 1、PEG化藥物分子量不唯一，傳統(tǒng)的MRM模式不適合具有多個分子量的PEG化藥物的 分析，本技術(shù)針對不同分子量的PEG化藥物共有的特異性碎片，在Q2加入碰撞能量，運用串 聯(lián)質(zhì)譜的TOF MS Scan或者EMS模式對特異型性碎片進行測定，專屬性強，靈敏度高，適用 范圍廣。
[0016] 2、運用PEG化藥物的特異性碎片同時對PEG化藥物和游離藥物進行分析和定量。
[0017] 下面結(jié)合附圖及【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細說明。
【附圖說明】
[0018]圖1是本發(fā)明中對PEG化藥物特異性碎片進行掃描流程圖。
[0019] 圖2是大鼠尾靜脈給予PEG化阿霉素后阿霉素及PEG化阿霉素血藥濃度時間曲 線。
[0020] 圖3是阿霉素及PEG化阿霉素典型色譜圖。
[0021] 圖4是大鼠尾靜脈給予PEG化吉西他濱后吉西他濱及PEG化吉西他濱血藥濃度時 間曲線。
[0022] 圖5是吉西他濱及PEG化吉西他濱典型色譜圖。
【具體實施方式】
[0023] 實施例1 一種生物樣本中PEG化藥物的定量測定方法，采用液相色譜-飛行時間質(zhì)譜進行測定， 測定步驟包括： A. 建立游離藥物測定標(biāo)準(zhǔn)曲線和PEG化藥物測定標(biāo)準(zhǔn)曲線， B. 使用液相色譜_飛行時間質(zhì)譜測定待測樣品，通過步驟A所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測 樣本中游離藥物濃度和PEG化藥物濃度； 步驟A和步驟B的色譜條件和質(zhì)譜條件相同，其中質(zhì)譜條件基于三重串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，步 驟A和步驟B質(zhì)譜部分的設(shè)定為：第一個質(zhì)量分析器Q1中電壓設(shè)置為RF (射頻電壓）only， 不選擇母離子，帶電粒子全部通過后進入第二個質(zhì)量分析器Q2;在第二個質(zhì)量分析器Q2中 設(shè)置碰撞能量，將帶電粒子打碎成碎片離子；在第三個質(zhì)量分析器離子阱或者飛行時間質(zhì) 量分析器選取穩(wěn)定的PEG化藥物特征碎片離子和游離藥物特征碎片離子，來定量PEG化藥 物和游離藥物。
[0024] PEG化藥物特征碎片離子為3個乙二醇重復(fù)單元，PEG化藥物特征碎片離子m/z為 133. 083~133. 086,精確為 133. 08592。
[0025] 步驟A和步驟B中所述質(zhì)譜條件為：Q-Q-Tof/Trap型串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有ESI離子化 源和Analyst數(shù)據(jù)處理軟件；離子源：ESI離子化源；正離子方式檢測；離子噴射電壓4000 V ;溫度550°C ;源內(nèi)氣體1 :氮氣壓力40 psi ;氣體2 :氮氣壓力40 psi ;氣簾氣體：氮氣壓 力30 psi;解簇電壓（DP電壓）：91 V;掃描方式為TOF MS Scan或者EMS Scan。
[0026] 步驟A和步驟B中所述色譜條件為：高效液相液相色譜系統(tǒng)；色譜柱：流動相：含 體積百分?jǐn)?shù)占〇. 1%甲酸的水和含體積百分?jǐn)?shù)占〇. 1%甲酸的乙腈，梯度洗脫；柱溫30°C。
[0027] 所述步驟A具體操作程序為： 1) 制備梯度稀釋的不同濃度的游離藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液和PEG化藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液； 2) 將步程序1)中所得游離藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液和PEG化藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣到高效液相色 譜-飛行時間質(zhì)譜中分析； 3)記錄色譜圖，以游離藥物和PEG化藥物濃度為橫坐標(biāo)，游離藥物和PEG化藥物峰面積 為縱坐標(biāo)，用加權(quán)W=l/x2最小二乘法進行回歸運算，求得的直線回歸方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0028] 所述步驟B具體操作程序為： 1) 于抗吸附管中加入待測樣本溶液、內(nèi)標(biāo)溶液及預(yù)冷的乙腈后渦流混勻，離心后取上 清液進樣到高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜中分析； 2) 記錄色譜圖，將程序1)中獲取的游離藥物和PEG化藥物面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得游 離藥物和PEG化藥物濃度。
[0029] 基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-Q-Q-Tof/Trap MS)，PEG化藥物和游離藥物通過液 相色譜分離，在質(zhì)譜四級桿Q2處施加碰撞能量（CE)，分析物經(jīng)能量碰撞產(chǎn)生特異性碎片， 利用TOF MS Scan或者EMS Scan模式對特異性碎片進行掃描分析，建立PEG化藥物及游離 藥物穩(wěn)定、可靠的LC/MS/MS定量方法，具體流程如圖1所示。利用PEG化藥物作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 進行定量分析建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而實現(xiàn)特異性碎片的定量。選取PEG化阿霉素、PEG化阿吉 西他濱代表PEG化小分子藥物，對本方法進行驗證，配制不同濃度的PEG化阿霉素標(biāo)準(zhǔn)系列 溶液，尋找到PEG化阿霉素的特異性碎片m/z為133. 08592(來自于PEG)，m/z 361. 07068(來 自于阿霉素);PEG化吉西他濱的特異性碎片m/z為133. 08592 (來自于PEG)，m/z 112. 0486 (來自于吉西他濱)。對PEG化阿霉素及游離阿霉素，PEG化吉西他濱及游離吉西他濱進行定 量，并將其應(yīng)用于大鼠靜脈給予PEG化阿霉素之后的藥物代謝動力學(xué)研宄。
[0030] 實施例2 在實施例1的基礎(chǔ)上具體對血漿中PEG化阿霉素進行測定。
[0031] 一種生物樣本中PEG化阿霉素的定量測定方法， 將