半抗原（實(shí)施例1制備得到）與卵清白蛋白偶聯(lián)得到唾蟲咐包被抗原， 將唾蟲咐包被抗原稀釋成0. 25yg/ml，100yL/孔在酶標(biāo)板上點(diǎn)樣，4, °C過夜；取出酶標(biāo)板 甩掉板內(nèi)液體，用10倍稀釋后的濃縮洗漆液300yL/孔洗板3次，30s/次；然后加入含5mg/ mlBSA的PBS溶液封閉，380yL/孔在上述酶標(biāo)板上點(diǎn)樣，37°C放置化，用10倍稀釋后的濃 縮洗漆液300yL/孔洗板3次，30s/次，拍干；將酶標(biāo)板真空密封后置4°C下保存；
[0071] 其中，將唾蟲咐半抗原與卵清白蛋白偶聯(lián)得到唾蟲咐包被抗原，具體步驟為：取 0. 2mmol唾蟲咐半抗原，溶于3血無水N,N-二甲基甲酯胺值MF)，加入46mgN-哲基了二酷 亞胺（N服）和78mg1-(3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亞胺鹽酸鹽巧DC) ?肥L。室溫避 光攬拌反應(yīng)過夜。取44mg卵清白蛋白（OVA)溶于15mL棚酸鹽緩沖液（0. 2mol/L，p服.7)。 然后在比內(nèi)將上述過夜活化的半抗原溶液加入OVA溶液中，使半抗原與OVA的摩爾比約為 30:1，室溫?cái)埌璺磻?yīng)化后，于4°C反應(yīng)過夜。用蒸饋水透析3d，每天換水3次，透析液冷凍 干燥即得唾蟲咐包被抗原Crac-OVA)。同樣的方法用BSA替換OVA可W制備唾蟲咐免疫原 (T肥-BSA)。
[0072] (2)唾蟲咐標(biāo)準(zhǔn)品的制備；
[007引稱取0. 0004g唾蟲咐標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸饋水定容至100血，得到濃度為4096ng/血的母 液，使用試劑盒時(shí)依次按二倍比稀釋，分別得到濃度為2048ng/mL、1024ng/mL、512ng/mL、 256ng/mL、128ng/mL、64ng/mL、32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、Ing/mL的標(biāo)準(zhǔn)品 溶液。
[0074] (3)唾蟲咐多克隆抗體工作液的制備；
[00巧]采用唾蟲咐人工抗原免疫兔制得唾蟲咐多克隆抗體，將唾蟲咐多克隆抗體用稀釋 液按體積比稀釋成1:3200的比例即得，所述的稀釋液為含5mg/mlBSA的PBS溶液；
[0076] 其中，采用唾蟲咐人工抗原免疫兔制得唾蟲咐多克隆抗體，具體步驟為：選用3月 齡健康大白兔，通過S次免疫，第1周給家兔注射卡介苗0. 2mL/只（約15mg)，采耳血，備 用。首次免疫用完全佐劑〇.5mL加抗原Img，充分混勻，背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射。2周后進(jìn)行加 強(qiáng)免疫，不完全佐劑0. 5mL加抗原0. 5mg，充分混勻，背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射。4周后進(jìn)行二次加 強(qiáng)免疫，不完全佐劑0. 5mL加抗原0. 5mg，充分混勻，背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射，每次免疫間隔4周； 首次免疫后第5、7、11周采耳血1次，血清鑒定，并于第11周靜脈取血，分離血清；用飽和 硫酸錠沉淀法純化抗體，50%和33%飽和硫酸錠依次沉淀3次。純化后的抗體用0.OlmL/L PBS(pH7. 4)4°C冰箱中透析，濃縮，分裝小瓶，冷凍干燥，放-20°C冰箱保存?zhèn)溆玫玫酵傧x咐 多克隆抗體。
[0077] (4)唾蟲咐酶標(biāo)二抗工作液的制備；
[0078] 將酶標(biāo)二抗用稀釋液按體積比稀釋成1:5000的比例，所述的稀釋液為含5mg/ml BSA的PBS溶液。
[0079] (5)底物液A和底物液B的制備；
[0080] 所述的底物液A為含有0. 5mmol/L的過氧化氨脈的巧樣酸-磯酸氨二鋼緩沖溶液 (P冊.0 ~5. 4);
[0081] 所述的底物液B為2mg/ml四甲基聯(lián)苯二胺的己醇溶液。
[0082] (6)終止液的制備；
[0083] 2mol/L的硫酸水溶液。
[0084] (7)濃縮洗漆液（10倍濃縮洗漆液）的制備：
[0085]0.Olmol/L的PBST(注；100血PBST中含 0. 5血吐溫-20)，抑7. 0-7. 5。
[0086] 使用本試劑盒時(shí)的注意事項(xiàng)：
[0087] (1)室溫低于20°C或試劑及樣本沒有回到室溫（20~25°C)會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的 0D值偏低；
[008引 似在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性 不好的現(xiàn)象。所W洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作；
[0089] (3)每加一種試劑前需將其搖勻；
[0090] (4)反應(yīng)終止液為2M鹽酸，避免接觸皮膚；
[0091] (5)不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何 試劑，滲雜使用過了有效期的試劑盒會(huì)引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號(hào)試劑盒 中的試劑；
[0092] (6)儲(chǔ)存條件；保存試劑盒于2~8°C，不要冷凍，將不用的酶標(biāo)板微孔板放進(jìn)自封 袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下；
[0093] (7)試劑變質(zhì)的跡象：發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的 吸光度（450/630nm)值小于0. 5(A450nm<0. 5)時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)，請勿使用；
[0094](8)該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25°C，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏 度發(fā)生變化。
[0095] 實(shí)施例3 ;檢測唾蟲咐的ELISA試劑盒（實(shí)施例2得到的）檢測±壤中唾蟲咐的 方法。
[0096] 具體檢測方法包括如下步驟；
[0097] 一、樣品處理；
[009引 訊配制浸提液；使用質(zhì)量比為2:1的濃硫酸（98%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)）和濃硝酸（69%， 質(zhì)量分?jǐn)?shù)）混合液調(diào)節(jié)蒸饋水的抑值為3. 20 + 0. 05 ;
[009引 （n)將待測試樣品研磨、破碎，過9. 5mm篩；
[0100] (III)稱取經(jīng)過步驟（II)處理后的樣品50~lOOg置于具蓋容器中，于105°C下 烘干，恒重至兩次稱量值的誤差小于±1%，計(jì)算樣品含水率；
[0101] (IV)稱取經(jīng)過步驟（III)處理后的樣品150~200g，置于化具旋蓋和內(nèi)蓋的廣 口瓶中，根據(jù)樣品的含水量，按液固比為10L: 1kg計(jì)算出所需浸提液的體積，加入浸提液， 蓋緊瓶蓋后固定在翻轉(zhuǎn)式振蕩裝置上，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為30 ±化/min,于23 ± 2°C下振蕩18 ±化， 振蕩過程中定時(shí)打開提取瓶，釋放過度的壓力；
[0102] (V)在壓力過濾器上裝好〇.45ym濾膜，用稀硝酸（10%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)）淋洗過濾器 和濾膜，棄去淋洗液，過濾并收集濾液；
[0103] (VI)用6mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)步驟（V)得到的濾液抑值至6. 0 + 0. 05,得到預(yù)處 理后的液體樣品，待測。
[0104] 二試劑盒檢測：
[0105] (a)將預(yù)處理后的液體樣品復(fù)溶于稀釋液中，所述的稀釋液為含5mg/mlBSA的 ros溶液；
[0106] 化）將試劑盒中的所有試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20~25°C)條件下平 衡30minW上，每種試劑使用前須搖勻；
[0107] (C)取用唾蟲咐包被抗原包被的酶標(biāo)板，加入預(yù)處理后的待測樣品或標(biāo)準(zhǔn)品和唾 蟲咐多克隆抗體工作液按體積比1:1的預(yù)混液，每孔100y以37°C保溫化，PBST洗漆3次， 拍干；
[010引 （d)向步驟（C)得到的酶標(biāo)板中加入唾蟲咐酶標(biāo)二抗工作液，每孔100yL，37°C保 溫lh，PBST洗漆3次，拍干；
[010引 （e)向步驟（d)得到的酶標(biāo)板中加入底物液A50yL/孔，底物液B50yL/孔，輕 輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)5min;
[0110] 訊向步驟（e)得到的酶標(biāo)板中加入終止液50化/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀 于450nm處或雙波長450/630nm檢測，測定每孔吸光度值，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)；
[0111] (g)W標(biāo)準(zhǔn)品測試的吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品的濃度對(duì)數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲 線計(jì)算樣品中唾蟲咐的含量。
[0112] S、分析結(jié)果
[0113] 用上述制備的試劑盒中的14個(gè)唾蟲咐標(biāo)準(zhǔn)品濃度0、1、2、4、8、16、32、64、128、 256、512