一種百兩金藥材或其提取物的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及中藥材的質(zhì)量控制，具體是百兩金藥材或其提取 物的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 百兩金（Ardisia crispa(Thunb. )DC. A.)是紫金?？疲∕yrsinaceae)紫金牛屬 (Ardisia Sw.)常綠灌木植物，分布于四川、貴州、湖南、湖北、江西、浙江、福建、廣東和廣 西等地。以全株入藥，具有清咽利喉、散淤消腫和舒筋活血的功效，并具有清熱解毒、活血 舒筋、祛痰止咳和提膿生肌之功，我國(guó)民間多用于治療咽喉痛、扁桃體炎、腎炎水腫、跌打損 傷、風(fēng)濕疼痛、白濁、骨結(jié)核、勞傷咳血、癰疔和毒蛇咬傷等。現(xiàn)代藥理研宄表明，本藥材具有 細(xì)胞毒活性和抗腫瘤作用，同時(shí)具有抗炎、抑菌、收縮子宮、抗氧化等活性作用。百兩金皂苷 B(ardisiacrispin B)是該藥材主要活性成分之一，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
[0003]
[0004]目前對(duì)該屬植物的研宄熱點(diǎn)主要集中在化學(xué)成分、藥理作用和臨床應(yīng)用等方 面，也有人建立了百兩金藥材中巖白菜素和百兩金皂苷A含量測(cè)定的方法（侯金玲 等.HPLC-ESLD測(cè)定瑤藥竹葉風(fēng)中巖白菜素和百兩金皂苷A含量的方法研宄[J]廣西醫(yī)科 大學(xué)學(xué)報(bào)2014, 31(1) :50-54)，但未見(jiàn)百兩金阜苷B的定量分析方法。由于巖白菜素和百 兩金皂苷A在百兩金藥材中的含量水平較低（前者含量在0.08%~0.30% ;后者含量在 0. 25%~0. 31% )，增加含量水平更高的百兩金皂苷B的檢測(cè)方法，能更好的控制該藥材的 內(nèi)在質(zhì)量。故我們從該藥材中提取分離得到百兩金皂苷B單體，并按照對(duì)照品研宄技術(shù)指 導(dǎo)原則進(jìn)行了純化及結(jié)構(gòu)鑒定，最終建立起百兩金藥材或其提取物中百兩金皂苷B的高效 液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)（HPLC-ELSD)的快速分析方法，提高了該藥材或其提取物的質(zhì) 量控制水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于：提供一種使用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法 (HPLC-ELSD)測(cè)定百兩金藥材或其提取物中百兩金皂苷B含量的檢測(cè)方法，其特征在于以 十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；體積比為60 : 40~68 : 32的甲醇-水為流動(dòng)相；蒸發(fā) 光散射檢測(cè)器檢測(cè)；理論板數(shù)按百兩金皂苷B計(jì)算不得低于5000 ;其主要步驟還包括對(duì)照 品和樣品溶液制備、進(jìn)樣分析測(cè)定并計(jì)算。
[0006] 根據(jù)前述的檢測(cè)方法，其中，將紅毛走馬胎粉碎，用50%~80%的乙醇提取，將提 取液減壓濃縮，上大孔吸附樹(shù)脂，用水和30%乙醇沖洗除雜，再用80%乙醇洗脫，洗脫液減 壓濃縮干燥，上硅膠柱層析，以體積比為70 : 30的乙酸乙酯-甲醇洗脫，合并富含百兩金 皂苷B的流份，除去溶劑，甲醇重結(jié)晶，用相應(yīng)流動(dòng)相溶解結(jié)晶物后注入制備型高效液相色 譜儀分離純化；色譜條件：C18柱；流動(dòng)相：體積比為60 : 40~68 : 32的甲醇-水；檢測(cè) 波長(zhǎng)：205nm，收集目標(biāo)峰流出液，濃縮、干燥，鑒定結(jié)構(gòu)并檢測(cè)純度，即得。
[0007] 根據(jù)前述的檢測(cè)方法，其中，所述蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的漂移管溫度為80°C~ 110°C ;氣體流速為 L 6 ~2. 4L · mirT1。
[0008] 根據(jù)前述的檢測(cè)方法，其中，所述百兩金藥材或其提取物的供試品溶液是用 50 %~70 %的甲醇或乙醇水溶液提取制備，優(yōu)選為50 %乙醇。
[0009] 5.根據(jù)前述的檢測(cè)方法，其中，所述采用HPLC-ELSD法測(cè)定百兩金皂苷B含量包括 如下步驟及優(yōu)化條件：
[0010] 照高效液相色譜法（中國(guó)藥典2010年版一部附錄VI D)測(cè)定：
[0011] 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-水 (65 : 35)為流動(dòng)相；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，理論板數(shù)按百兩金皂苷B計(jì)算不得低于 5000 〇
[0012] 對(duì)照品溶液制備取百兩金皂苷B對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1ml 含0. 3mg的百兩金皂苷B對(duì)照品溶液，即得。
[0013] 供試品溶液制備取百兩金藥材粉末（過(guò)三號(hào)篩）〇.4g，精密稱定，置具塞錐型瓶 中，精密加入50 %乙醇50mL，密塞，稱定重量，超聲（功率300W，頻率40kHz)處理60分鐘， 放冷，再稱定重量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾或離心，取續(xù)濾液或上清液，即 得。
[0014] 測(cè)定方法分別精密吸取對(duì)照品溶液5 μ L、20 μ L ;供試品溶液5~10 μ L ;注入液 相色譜儀，測(cè)定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算，即得。
[0015] 本發(fā)明所提供的百兩金藥材或其提取物中百兩金皂苷B含量的HPLC-ELSD檢測(cè)方 法具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0016] (1)本發(fā)明提供的方法首次引入了百兩金藥材或其提取物中有效成分百兩金皂苷 B的含量測(cè)定，從而使百兩金的質(zhì)量控制方法更加科學(xué)合理；
[0017] (2)本發(fā)明所提供的的百兩金藥材或其提取物的分析方法首次將HPLC-ELSD法用 于百兩金藥材或其提取物中活性成分百兩金皂苷B的含量測(cè)定，具有良好的線性關(guān)系、精 密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、耐受性和回收率，測(cè)定簡(jiǎn)便快速。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為百兩金皂苷B對(duì)照品溶液的HPLC-ELSD色譜圖；
[0019] 圖2為百兩金藥材的HPLC-ELSD色譜圖；
[0020] 圖3為百兩金提取物的HPLC-ELSD色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 1儀器、試藥與樣品
[0022] 高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 515系列）；Alltech ELSD 2000型蒸發(fā)光散射檢 測(cè)器；制備型高效液相色譜儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特BECHMAN 125P型），包含SYSTEM GOLD I25PSolvent Module 和 I66P Detector 等；Milli-Q超純水器（美國(guó) Milipore 公司）； Microfuge 18臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）；KQ-500DE超聲清洗機(jī)（昆山 市超聲儀器有限公司，功率300W，頻率40kHz) ;BP-210D型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯， 十萬(wàn)分之一）；過(guò)濾裝置（Autoscience)及微孔濾膜（0. 45 μm)。色譜柱：Alltech Altimma C18 (250mmX 4. 5mm, 5 μ m) ；ffaters Symmetry C18 (150mmX 4. 5mm, 5 μ m) ；Phenomenex Gemini C18(150mmX4.5mm，5ym);制備色譜柱：BECHMAN UL TRAPREP C18(21.1mmX150mm，10ym); 保護(hù)柱：phenomnex C18〇
[0023] 百兩金皂苷B自制（熔點(diǎn)：263_265°C，薄層色譜多個(gè)展開(kāi)及顯色系統(tǒng)均顯示一個(gè) 斑點(diǎn)，采用HPLC-ELSD峰面積歸一化法計(jì)算其質(zhì)量濃度大于98%，符合定量分析用對(duì)照品 純度的質(zhì)量要求）；甲醇、乙腈為色譜純，水為高純水；其余試劑均為分析純。百兩金藥材購(gòu) 買于四川省某公司，經(jīng)發(fā)明人鑒定為百兩金（Ardisia crispa(Thunb.)DC.A.)。
[0024] 2百兩金皂苷B對(duì)照品制備
[0025] 將紅毛走馬胎粉碎，用50 %~80 %的乙醇提取，將提取液減壓濃縮，上大孔吸附 樹(shù)脂，用水和30 %乙醇沖洗除雜，再用80 %乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮干燥，上硅膠柱層 析，以體積比為70 : 30的乙酸乙酯-甲醇洗脫，合并富含百兩金皂苷B的流份，除去溶劑， 甲醇重結(jié)晶，用相應(yīng)流動(dòng)相溶解結(jié)晶物使成飽和溶液，上清液注入制備型高效液相色譜儀 分離純化；色譜條件：C18柱；流動(dòng)相：體積比為60 : 40~68 : 32的甲醇-水；檢測(cè)波長(zhǎng)： 205nm，收集目標(biāo)峰流出液，濃縮、干燥，即得。
[0026] 將制得的百兩金皂苷B對(duì)照品采用高分辨質(zhì)譜（HR-FAB-MS)給出精確分子量： m/zl097. 5432[M+Na]，對(duì)應(yīng)分子式為！C53H86O22Na(分子量計(jì)算值為：1097. 5509);其碳、 氫核磁共振信號(hào)根據(jù)gCOSY，HMQC，HMBC所顯示的相關(guān)關(guān)系得到了歸屬，結(jié)構(gòu)鑒定為西 克拉敏Α3-0_α-鼠李吡喃糖-(1 - 2)-f3_D-葡萄吡喃糖-(1 - 4)-[f3_D-葡萄吡喃 糖-(1 - 2)-]-a-L-阿拉伯吡喃糖苷。
[0027] 本發(fā)明制備的虎舌紅素 B經(jīng)高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法（HPLC-ELSD)純度 檢查，不同色譜柱和流動(dòng)相測(cè)定結(jié)果均為一個(gè)色譜峰，以HPLC-ELSD峰面積歸一化法測(cè)定， 其質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%，符合含量測(cè)定用中藥化學(xué)對(duì)照品的要求。
[0028] 3方法優(yōu)化
[0029] 3. 1蒸發(fā)光散射檢測(cè)器參數(shù)優(yōu)化
[0030] 其主要參數(shù)有漂移管溫度和氣體流速，以5°C為遞增值，考察漂移管溫度