一步均相化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行小分子檢測(cè)的方法及所用微粒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于小分子檢測(cè)的一步法均相化學(xué)發(fā)光方法及所用微粒（包括 受體微粒和供體微粒）。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)代牧業(yè)的規(guī)模化和集成化生產(chǎn)日趨成熟，為保證畜禽快速健康地生長(zhǎng)，越來越 多的獸藥用于實(shí)際養(yǎng)殖中，但不合理的獸藥使用往往造成嚴(yán)重的獸藥殘留，對(duì)現(xiàn)代人的生 活品質(zhì)帶來深遠(yuǎn)的社會(huì)問題。根據(jù)WHO組織的規(guī)定，獸藥殘留指動(dòng)物產(chǎn)品的任何可食用部 分所包含的原獸藥及其代謝物和伴生的雜質(zhì)。據(jù)報(bào)道，目前獸藥殘留已超過120類之多，而 beta-興奮劑（beta-腎上腺素能受體阻斷劑）就是其中的一大類。
[0003] Beta-興奮劑是一類苯乙醇胺類衍生物，臨床上用來治療哮喘、支氣管痙攣等呼吸 系統(tǒng)疾病，20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)，此類藥物可減少脂肪積累，提高胴體肉脂比，促進(jìn)骨骼肌生 長(zhǎng)，故被國內(nèi)外很多養(yǎng)殖場(chǎng)用作食品添加劑，但人類食用含該類獸藥超標(biāo)的肉品后，易出現(xiàn) 食物中毒、心血管疾病、新生兒畸形、提升腫瘤爆發(fā)率等病癥，目前常被濫用的有克倫特羅、 萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林這幾種。
[0004] 克倫特羅（CBL)，CAS: 129138-58-5,是一種平喘藥，俗稱"瘦肉精"，是最早被發(fā)現(xiàn) 并濫用的beta類興奮劑，CBL脂溶性好，吸收快，但在動(dòng)物體內(nèi)半衰期長(zhǎng)，易殘留，人食用含 CBL的肉品危害甚大，現(xiàn)已禁止CBL用在動(dòng)物養(yǎng)殖中。取而代之的是萊克多巴胺和沙丁胺 醇等，它們?cè)趧?dòng)物體內(nèi)毒副作用小，清除時(shí)間短，而且增加瘦肉的效率非常高，一噸飼料中 加入萊克多巴胺不到二十克，就可以讓最后長(zhǎng)肉階段的豬增加24%的瘦肉，減少34%的脂 肪。FDA規(guī)定萊克多巴胺在豬肉中允許值是50ppb(50微克/公斤），牛肉中不得超過30ppb。 沙丁胺醇、特布他林等卻對(duì)人體健康危害過大，目前已在全球禁用。以下是這幾種化合物的 分子結(jié)構(gòu)。
[0006]目前針對(duì)該類藥物的檢測(cè)方法主要有色譜技術(shù)、免疫吸附試驗(yàn)等。色譜技術(shù)包括HPLC、LC/MS、GC/MS、GC/FTIR等，可從動(dòng)物的組織、毛發(fā)中檢測(cè)出殘留量，非常高效、敏感、準(zhǔn) 確，但設(shè)備費(fèi)用昂貴，樣品處理繁瑣，一次處理的樣本少，無法現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；免疫檢測(cè)技術(shù)，如 酶聯(lián)免疫ELISA技術(shù)，利用待檢測(cè)的樣品與酶標(biāo)物結(jié)合，產(chǎn)生0D值的變化，定量藥品的殘留 值，一次可以檢測(cè)多份樣品。但該技術(shù)對(duì)于操作步驟多，對(duì)專業(yè)程度要求高，操作易出現(xiàn)假 陽性結(jié)果，造成漏檢誤檢；膠體金免疫層析試紙條是也被用于獸藥殘留檢測(cè)，但是由于方法 學(xué)的原因，檢測(cè)靈敏度不高，穩(wěn)定性差，容易出現(xiàn)假陽性。應(yīng)國家食品檢驗(yàn)部門和實(shí)際應(yīng)用 要求，研制靈敏，快速，準(zhǔn)確的獸藥檢測(cè)方法，檢測(cè)畜禽的可食用組織及飼料中獸藥殘留，特 別是克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等幾種，有著重要意義。
[0007] AlphaScreen(AmplifiedLuminscentProximityHomogeneousAssayScreen)技 術(shù)是一種基于微粒與微粒之間靠近的效應(yīng)用于分析物的均相檢測(cè)方法，是由1994年發(fā)明 的LOCI(LuminescentOxygenChannelingAssay)這種技術(shù)的基礎(chǔ)上演化而來。供體含包 裹有酞菁分子，受特殊波長(zhǎng)680nm光激發(fā)，每秒可產(chǎn)生6萬個(gè)以上單線態(tài)氧分子，放大信號(hào)， 但單線態(tài)氧半衰期僅為4us，在有水介質(zhì)中衰減快，最遠(yuǎn)可傳輸200nm距離，如果受體能通 過一定方式，如抗體免疫吸附、親和素-鏈霉素識(shí)別等，接近供體，則受體中的熒光基團(tuán)可 迅速吸收單線態(tài)氧，以上轉(zhuǎn)換方式產(chǎn)生520-620nm光信號(hào)，為檢測(cè)器探測(cè)到。
[0008] 而Alphalisa則是在AlphaScreen技術(shù)的基礎(chǔ)上，與經(jīng)典的ELISA技術(shù)有相似之 處的均相檢測(cè)方法，我們稱之為均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)。因?yàn)檫@種方法不用洗滌，反應(yīng)在均相跟 中進(jìn)行，其過程其實(shí)是個(gè)化學(xué)發(fā)光的過程。已廣泛用于藥物篩選，其檢測(cè)原理如圖1所示。
[0009]AlphaLISA方法的核心是供體（感光微粒）和受體（發(fā)光微粒）這兩種直徑約為 200nm的微粒。在兩種微粒表面與生物分子（抗體或抗原蛋白）相偶聯(lián)，每個(gè)微粒表面可 以覆蓋成百上千個(gè)生物分子，可捕獲待測(cè)分子。當(dāng)微粒受到680nm的激光照射后，供體表 面的光敏劑就會(huì)將溶液（AlphaLISA反應(yīng)液）中的氧氣轉(zhuǎn)化為單線態(tài)氧。單線態(tài)氧在溶液 中的傳播距離約為200nm，如果供體和受體之間的距離小于200nm，單線態(tài)氧就能擴(kuò)散至受 體微粒，受體中的光敏化合物就能和單線態(tài)氧發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，其中Eu3+配合物就產(chǎn)生高能 級(jí)的發(fā)光。相反，如果發(fā)光微粒和感光微粒的距離大于200nm，單體氧無法擴(kuò)散至發(fā)光微 粒，就不會(huì)有光信號(hào)的產(chǎn)生。AlphaLISA均相反應(yīng)就是基于以上原理，如果包被在兩種微 粒表面的生物分子存在相互作用時(shí)，就拉近了兩種微粒之間的距離，產(chǎn)生光信號(hào)。通過對(duì) 光信號(hào)的強(qiáng)度檢測(cè)，來判斷實(shí)際檢測(cè)樣品中有無待測(cè)目標(biāo)物。基于AlphaLISA技術(shù)的原 理，分子復(fù)合物小于200nm的范圍內(nèi)都可被檢測(cè)到。而其他均相技術(shù)，例如時(shí)間分辨熒光 (TR-FRET)、熒光偏振（FP)，供體和受體之間的距離只能在為10nm內(nèi)，僅限于小分子的檢 測(cè)。AlphaLISA可以應(yīng)用于酶活性、受體配體反應(yīng)、DNA、RNA、蛋白、多肽、碳水化合物等檢測(cè)。
[0010] 均相化學(xué)發(fā)光檢測(cè)生物分子，可以不用洗滌，這是它的一大優(yōu)點(diǎn)。但是，這種方法 也有其不足之處：①靈敏度在檢測(cè)生物樣本時(shí)往往較低（靈敏度一般僅為lng/ml)。檢測(cè) 血液、尿液時(shí)，由于樣本的基質(zhì)效益及樣本中的物質(zhì)對(duì)發(fā)光微粒所發(fā)出的光有吸收作用，檢 測(cè)靈敏度沒有在PBS等反應(yīng)液中的高；②受體微粒中的物質(zhì)為噻吩和Eu3+配合物，這些物質(zhì) 都要包裹在200nm的聚苯乙烯微球中，還要有合適的比例，制備困難；③微粒中的物質(zhì)多， Eu3+配合物包裹量就少，這影響微粒的發(fā)光強(qiáng)度和量子產(chǎn)率，影響了靈敏度；④檢測(cè)儀器昂 貴，影響了該方法的推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種新的一步法均相化學(xué)發(fā)光技術(shù)，用于均相、 快速、高靈敏度的獸藥殘留檢測(cè)，以及用于飼料中常見的獸藥成分含量測(cè)試，如克倫特羅、 萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等。
[0012] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種用于獸藥小分子檢測(cè)的微粒，包括受體 微粒和供體微粒：
[0013] 一、受體微粒的制備方法為包括如下步驟：
[0014] ①、將獸藥小分子和載體蛋白偶聯(lián)，經(jīng)PBS透析，得到標(biāo)記有獸藥小分子的載體蛋 白；所述獸藥小分子與載體蛋白的摩爾比為10~50:1 ;
[0015] ②、按照每0. 05mmol的ATTA_Eu3+配用0. 9~1.lg(較佳為lg)聚苯乙稀微球的 用量比，在ATTA-Eu3+中加入聚苯乙烯微球溶液，超聲包裹；得到含均相化學(xué)發(fā)光受體微粒 的溶液；
[0016] ③、在均相化學(xué)發(fā)光受體微粒表面包被標(biāo)記有獸藥小分子的載體蛋白：
[0017] 將步驟②所得的含均相化學(xué)發(fā)光受體微粒的溶液進(jìn)行清洗，得清洗后均相化學(xué)發(fā) 光受體微粒；
[0018] 取清洗后均相化學(xué)發(fā)光受體微粒0. 2ml，加入0. 09~0.llmg(較佳為0.lmg)標(biāo)記 有獸藥小分子的載體蛋白，再加入9~1luL濃度為350~450mM的（較佳為10uL400mM) 氰基硼氫化鈉溶液，室溫旋轉(zhuǎn)（轉(zhuǎn)速為30~50rpm，例如為35rpm)反應(yīng)18~24hrs后終止 反應(yīng)；所得的反應(yīng)液經(jīng)后處理（包括分散、洗滌離心等），得標(biāo)記有獸藥小分子-載體蛋白 的均相化學(xué)發(fā)光受體微粒（AlphaLISAAcceptorBeads);
[0019] 二、供體微粒的制備方法為：將醛基化AlphaLISA供體微球與上述獸藥小分子相 對(duì)應(yīng)的抗體相偶聯(lián)；包括如下步驟：
[0020] 含有l(wèi)mg醛基化AlphaLISA供體微球的溶液經(jīng)離心和分散沉淀的處理后，加入 0. 09~0.llmg(較佳為0.lmg)與上述獸藥小分子相對(duì)應(yīng)的抗體和9~lluL濃度為350~ 450mM的（較佳為10uL400mM)氰基硼氫化鈉溶液，室溫旋轉(zhuǎn)（轉(zhuǎn)速為30~50rpm，例如為 35rpm)反應(yīng)18~24hrs后終止反應(yīng)；所得的反應(yīng)液經(jīng)后處理（包括分散、洗絳離心等），得 帶有獸藥小分子抗體的均相化學(xué)發(fā)光供體微粒（AlphaLISADonorBeads)。
[0021] 作為本發(fā)明的用于獸藥小分子檢測(cè)的微粒的改進(jìn)：
[0022] 所述步驟一的受體微粒的制備方法中：
[0023] 所述步驟②中：
[0024] 所述聚苯乙烯微球的粒徑為175nm;所述超聲包裹為200w超聲5s，停頓5s;如此 重復(fù)60次；
[0025] 所述步驟③中：
[0026] 含均相化學(xué)發(fā)光方法受體微粒的溶液進(jìn)行清洗的方法為：將10ml含均相化學(xué)發(fā) 光受體微粒的溶液離心，棄上清液后加入7~9ml(較佳為8ml)重懸液I重懸浮；重復(fù)上述 離心和重懸浮2~3次后再離心，得清洗后均相化學(xué)發(fā)光受體微粒；
[0027] 所述重懸液I為 8ml100mMH印es(pH7. 4)，1. 25uL10%Tween-20 ;
[0028] S卩，重懸液I的制備方法為：在8mllOOmMH印es(pH7.4)溶液（去離子水為溶 劑）中，加入1. 25uL10% (體積濃度）Tween-20溶液（去離子水為溶劑）。
[0029] 所述后處理為：將所得的反應(yīng)液離心，離心所得沉淀用重