金槍魚魚肉雙向電泳蛋白質(zhì)圖譜的獲取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及了一種適用于金槍魚雙向電泳凝膠技術(shù)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該技術(shù) 可直接應(yīng)用于各類金槍魚蛋白質(zhì)組學(xué)的研宄。
【背景技術(shù)】
[0002] 金槍魚也稱鮪魚、吞拿魚，屬大洋性高度洄游魚類。常見的金槍魚類計有5個屬， 17個種，其中對漁業(yè)影響較大的主要品種是大眼金槍魚、黃鰭金槍魚、長鰭金槍魚和鰹魚4 個種類，這4種金槍魚產(chǎn)量從1998的382. 6萬噸增加到2008的430萬噸。金槍魚肉質(zhì)柔 嫩鮮美，富含多種蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)，是不可多得的健康美食，被世界營養(yǎng)學(xué) 會推薦為三大營養(yǎng)魚之一。
[0003] 金槍魚種類繁多，且價值差異較大，因此常有低值金槍魚冒充高值金槍魚的事 件發(fā)生。利用基于雙向電泳的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，可以通過不同品種潛在的特征性蛋白點 (Target)來區(qū)別魚種，從而對魚種高效準(zhǔn)確的鑒別，保證水產(chǎn)品質(zhì)和安全。此外金槍魚魚肉 品質(zhì)影響著產(chǎn)品營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值，魚肉鮮度是衡量金槍魚品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)。蛋白 質(zhì)是水產(chǎn)品肌肉中最重要的組分，在冷藏過程中魚肉蛋白質(zhì)降解引起水產(chǎn)品鮮度下降，尤 其與魚肉質(zhì)構(gòu)特性變化具有密切相關(guān)，是導(dǎo)致魚肉品質(zhì)變化最主要因素。利用差異蛋白質(zhì) 組學(xué)技術(shù)體系研宄冷藏過程中金槍魚肉鮮度變化機制，能夠為控制魚肉品質(zhì)變化提供了一 個新思路。目前利用雙向電泳獲得蛋白圖譜的方法在水產(chǎn)品領(lǐng)域有一定程度的應(yīng)用。而在 金槍魚應(yīng)用方面幾乎空白。
[0004] 現(xiàn)有報道的"水產(chǎn)品雙向電泳獲得蛋白圖譜的方法"主要為大黃魚雙向電泳方法 建立，其主要步驟為用液氮研磨，加入裂解液裂解，離心后直接水化上樣，然后依次進行等 電聚焦和SDS-PAGE電泳，最后染色得到圖譜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種金槍魚魚肉雙向電泳蛋白質(zhì)圖譜的獲取方 法，本發(fā)明是一種適用于金槍魚的雙向電泳凝膠技術(shù)，是針對金槍魚魚肉蛋白采用雙向電 泳技術(shù)制備，能獲得較高質(zhì)量的雙向電泳圖譜。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種金槍魚魚肉雙向電泳蛋白質(zhì)圖譜的獲取 方法，依次進行以下步驟：
[0007] 1)、金槍魚魚肉蛋白質(zhì)提取及純化；得蛋白提取液；
[0008] 2)、一向等電聚焦；
[0009] 取步驟1)所得的蛋白提取液，按上樣量150 y g用水化液稀釋至460 y L的上樣體 積，得樣品液；
[0010]將樣品液加入等電聚焦盤中，再將pH4-7、24cm的IPG膠條膠面向下放入盤中，除 去膠面與樣品液之間的氣泡，加入6ml礦物油，覆蓋膠條，進行一向等電聚焦；
[0011] 設(shè)定參數(shù)如下：
【主權(quán)項】
1. 金槍魚魚肉雙向電泳蛋白質(zhì)圖譜的獲取方法，其特征是依次進行w下步驟： 1) 、金槍魚魚肉蛋白質(zhì)提取及純化；得蛋白提取液； 2)、一向等電聚焦； 取步驟1)所得的蛋白提取液，按上樣量150yg用水化液稀釋至460yL的上樣體積， 得樣品液； 將樣品液加入等電聚焦盤中，再將pH4-7、24cm的IPG膠條膠面向下放入盤中，除去膠 面與樣品液之間的氣泡，加入6ml礦物油，覆蓋膠條，進行一向等電聚焦； 設(shè)定參數(shù)如下：
上述水化液的配方為：在1ml的蛋白質(zhì)裂解液中加入0.Olg的二硫蘇糖醇和10yL的IPGBuffer加4-7); 3) 、二向SDS-PAGE電泳，包括W下步驟： ① 膠條平衡；向步驟2)所得的聚焦好后的膠條加入平衡液I，平衡12~17min，倒凈平 衡液I后加入平衡液II，避光平衡12~17min; 平衡緩沖液母液為；在500ml的Tris-HCl緩沖液化05mol/l，抑8. 8)中加入3mol的 尿素、lOg十二烷基橫酸鋼、150ml的甘油、0.Olg的漠酪藍； 平衡液I;在平衡緩沖液母液加入lOOmM的二硫蘇糖醇； 平衡液II;在平衡緩沖液母液加入250mM的艦己酷胺； ②SDS-PAGE電泳；將步驟①所得的平衡好的膠條置于12. 5%的SDS-PAGE凝膠上，用 瓊脂糖封頂液封膠，加入電泳緩沖液進行二向電泳，設(shè)定參數(shù)如下： 先用2w/膠，比；再用17w/膠直至漠酪藍跑出膠面； 4) 、染色及圖像分析。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的金槍魚魚肉雙向電泳蛋白質(zhì)圖譜的獲取方法，其特征是： 所述步驟4)為： 將步驟3)所得的膠片進行銀染或考馬斯亮藍顯色后通過UMAX公司的PowerLook2100化-USB掃描分析儀獲取圖像，采用PD-Quest軟件進行處理從而得金槍魚雙 向電泳凝膠圖譜。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的金槍魚魚肉雙向電泳蛋白質(zhì)圖譜的獲取方法，其特征 是： 所述蛋白質(zhì)裂解液為：在每10ml水中加入70mmol的尿素、20mmol的硫脈、0. 4g的 3-[(3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙橫酸、O.Olmmol的苯甲基橫酷氣。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的金槍魚魚肉雙向電泳蛋白質(zhì)圖譜的獲取方法，其特征是： 所述步驟1)包括w下步驟： ① 、取干冰運輸?shù)慕饦岕~魚肉，置于-70~-90°C保存； ② 、稱取步驟①所得的0.Ig魚肉作為樣品放入液氮預(yù)冷后的研鉢中，加液氮研磨成粉 末狀； ⑨、在步驟②所得的粉末中加入750~850yL蛋白質(zhì)裂解液，充分溶解粉末后離屯、，收 集上清液I; ④、對步驟⑨所得的上清液I進行超聲處理，從而破碎核酸；離屯、，收集上清液II，在上 清液II中加入3. 5~4. 5體積倍的丙酬后，于-18~-22°C沉淀10~14小時；然后離屯、， 對去除上清液后的沉淀物干燥，得純化的蛋白質(zhì)團塊； ⑥、在步驟④所得的蛋白質(zhì)團塊中加入500~700yL蛋白質(zhì)裂解液，超聲助溶直至蛋 白質(zhì)團塊溶解，離屯、，得蛋白提取液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的金槍魚魚肉雙向電泳蛋白質(zhì)圖譜的獲取方法，其特征是： 所述步驟3)的步驟②中： 12. 5%的SDS-PAGE凝膠為：在180ml的超純水中加入220ml的30%丙締酷胺儲液、 125ml的Tris-Hcl緩沖液（1. 5mol/L，p服.8)、5. 3ml的10%十二烷基橫酸鋼水溶液、2. 1血 的10%過硫酸錠水溶液、138yL的N，N，N'，N' -四甲基己二胺； 上述30%丙締酷胺儲液為：在1000ml水中加入290g丙締酷胺和lOgN，N' -甲叉雙丙 締酷胺。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的金槍魚魚肉雙向電泳蛋白質(zhì)圖譜的獲取方法，其特征是： 所述步驟3)的步驟②中： 瓊脂糖封膠液為；在每100ml水中加入0. 8g低烙點瓊脂糖、0. 002g漠酪藍； 電泳緩沖液為：在1L水中加入IgSDS、0. 192mol的甘氨酸、25mmol的Tris-base。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種金槍魚魚肉雙向電泳蛋白質(zhì)圖譜的獲取方法，依次進行以下步驟：1)、金槍魚魚肉蛋白質(zhì)提取及純化，得蛋白提取液；2)、一向等電聚焦；3)、二向SDS-PAGE電泳；4)、染色及圖像分析。采用本發(fā)明方法對金槍魚魚肉蛋白進行分離，能獲得較多的蛋白質(zhì)點，重復(fù)性好，背景清晰，無橫縱條紋現(xiàn)象，結(jié)果穩(wěn)定。此發(fā)明適用于各種金槍魚魚肉蛋白雙向電泳凝膠方法，為進一步對金槍魚蛋白組學(xué)和分子生物學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。
【IPC分類】G01N27-447
【公開號】CN104849339
【申請?zhí)枴緾N201510254601
【發(fā)明人】戴志遠, 周聃, 趙巧靈, 鄭振霄, 馮俊麗, 金仁耀, 徐坤華
【申請人】浙江工商大學(xué)
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年5月18日