一種金納米粒子探針的制備及其在快速免疫檢測中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫檢測分析領(lǐng)域，尤其涉及一種金納米粒子探針的制備及其在快速 免疫檢測中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)的快速、準(zhǔn)確分析是臨床診斷、蛋白質(zhì)組學(xué)、制藥以及生物學(xué)等領(lǐng)域的一門 主要學(xué)科。依賴于抗原-抗體相互作用的免疫測定被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分析。為了檢 測目標(biāo)分析物，各種各樣不同的標(biāo)記物被引入到這種免疫分析中，例如熒光團(tuán)、放射性同位 素、電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、拉曼標(biāo)記、DNA條形碼以及酶等。在這些信號傳感器中，酶聯(lián)免疫吸附 法（ELISA)作為臨床檢測的黃金標(biāo)準(zhǔn)，通過顏色的變化來檢測分析物的含量，這些顏色的 變化通過肉眼就可以識別，因此不需要借助于先進(jìn)的儀器來進(jìn)行分析。
[0003] 盡管在蛋白檢測中已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)步，但是基于ELISA檢測的諸多方法仍 然面臨很多的挑戰(zhàn)。首先，目標(biāo)蛋白的捕獲抗體在二維表面上是被隨機(jī)固定的，這常常會導(dǎo) 致待檢測物不能夠充分的被固定的抗體所捕獲，因而影響檢測的靈敏度。第二，所標(biāo)記酶的 活性對所處的環(huán)境條件非常敏感，使得ELISA試劑盒在運(yùn)輸、儲存和使用過程中造成不便。 第三，在典型的ELISA檢測中，多步的孵化和清洗是不可避免的，因此，整個ELISA通常需要 幾個小時到幾天的時間才能得到分析結(jié)果。這些缺點(diǎn)使得ELISA不適和作為及時診斷的方 法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種用于快速免疫檢測的金納 米粒子探針的制備及其在蛋白檢測方面的應(yīng)用。所述金納米粒子探針通過PEG-NHS將待測 物質(zhì)對應(yīng)的抗體與膠體金相結(jié)合，然后用于檢測蛋白等大分子物質(zhì)。本發(fā)明中利用控制金 納米粒子探針的生長來改變金納米顆粒之間的距離，從而產(chǎn)生顏色變化來進(jìn)行蛋白分析物 含量的測定。主要特點(diǎn)是整個檢測過程是一個不需洗滌、無酶標(biāo)記的均相檢測體系。
[0005] 為達(dá)到此發(fā)明的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0006] 一種用于快速免疫檢測的金納米粒子探針的制備，具體步驟如下：
[0007] 1)向檸檬酸根保護(hù)的膠體金（AuNPs)中加入PEG-NHS，室溫下反應(yīng)，PEG-NHS 會通過Au-S鍵固定到金的表面從而形成PEG保護(hù)的金納米粒子（PEG-AuNPs);得到的 PEG-AuNPs離心，將沉淀物重新分散到磷酸鹽緩沖液（PBS)中，如此重復(fù)兩次；
[0008] 2)將抗體（Ab)與PEG-AuNPs在低溫下孵化過夜，Ab會通過與金上的PEG反應(yīng)從 而與金相連接，得到Ab-AuNPs ;接下來，向反應(yīng)混合物中加入磷酸鹽緩沖液；將金上沒有與 抗體反應(yīng)的PEG失活；上述體系在室溫下反應(yīng)離心，將沉淀物分散在去離子水中，制備得到 用于快速免疫分析的金納米離子探針。
[0009] 步驟1)所述PEG-NHS具有如下結(jié)構(gòu)
[0010]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于快速免疫檢測的金納米粒子探針的制備，其特征在于，具體步驟如下： 1) 向檸檬酸根保護(hù)的膠體金（AuNPs)中加入PEG-NHS，室溫下反應(yīng)，PEG-NHS會通過 Au-S鍵固定到金的表面從而形成PEG保護(hù)的金納米粒子（PEG-AuNPs);得到的PEG-AuNPs 離心，將沉淀物重新分散到磷酸鹽緩沖液（PBS)中，如此重復(fù)兩次； 2) 將抗體（Ab)與PEG-AuNPs在低溫下孵化過夜，Ab會通過與金上的PEG反應(yīng)從而與 金相連接，得到Ab-AuNPs;接下來，向反應(yīng)混合物中加入磷酸鹽緩沖液；將金上沒有與抗體 反應(yīng)的PEG失活；上述體系在室溫下反應(yīng)離心，將沉淀物分散在去離子水中，制備得到用于 快速免疫分析的金納米離子探針。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)所述PEG-NHS具有如下結(jié)構(gòu)
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)所述的抗體是能夠特異性識別待檢 測抗原的抗體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于步驟1)所述膠體金與PEG-NHS的 摩爾比值為1:1-50000 ; 所述室溫下反應(yīng)時間為0. 5-10h; 所述離心的轉(zhuǎn)速為10000_14000r/min，離心時間為10_30min; 所述磷酸鹽緩沖液的濃度為〇. 01M，pH為7. 2-7. 4。
5. 根據(jù)權(quán)利1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于步驟2)所述抗體與PEG-AuNPs孵化溫 度為 2-10°C; 所述磷酸鹽緩沖液的濃度為〇. 01M，pH為8. 5,室溫下反應(yīng)時間為0. 25-5h; 所述離心的轉(zhuǎn)速為10000_14000r/min，離心時間為10_30min。
6. -種用于快速檢測蛋白的方法，其特征在于采用權(quán)利要求1所述方法制備的金納米 離子探針，包括如下步驟： 將權(quán)利要求1制備的金納米粒子探針（Ab-AuNPs)與已知濃度的抗原進(jìn)行孵化；將金的 生長液加入到上述孵化液中；然后，用微孔板讀數(shù)器讀取它們在525nm處相應(yīng)的吸光度值， 將抗原的濃度值與它們的_AA525做線性擬合，AA525=A-A。，其中A是向Ab-AuNPs溶液 中加入待檢測抗原和金的生長液后在525nm處的吸收，A。是只加入金的生長液后在525nm 處的吸收，根據(jù)所得直線方程得到未知濃度的待檢測抗原。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的快速檢測蛋白的方法，其特征在于Ab-AuNPs與已知濃度抗原 的摩爾比值為1:0-400 ; 加入待檢測蛋白后的孵化溫度為37°C，孵化時間為0. 5-2h; 金的生長液是終濃度分別為20mM的鹽酸羥胺和120yM的氯金酸溶液的混合液。
8. 權(quán)利要求1所述方法制備的金納米離子探針在檢測生物大分子中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種金納米粒子探針的制備以及該探針在快速免疫檢測中的應(yīng)用。所述金納米粒子探針是通過PEG-NHS將抗體與膠體金連接起來構(gòu)成。利用抗原-抗體的相互作用，將金納米粒子探針與待測抗原結(jié)合，然后向體系中加入金的生長液，引起膠體金溶液顏色的變化?；谀z體金顏色的改變來實(shí)現(xiàn)蛋白的定性與定量檢測。與傳統(tǒng)的ELISA相比免去了多次洗滌與孵化的步驟，具有快速、使用方便、成本低廉等特點(diǎn)，適合現(xiàn)場檢測。
【IPC分類】G01N33-68
【公開號】CN104777317
【申請?zhí)枴緾N201510209671
【發(fā)明人】劉定斌, 劉會俏
【申請人】南開大學(xué)
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年4月28日