X3X或其部分肽用作為抗原，使用上文制備的抗原對非人哺 乳動物（例如小鼠）進(jìn)行免疫，將獲得的抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤融合，從由此制備的雜交瘤 來制備抗體。
[0118] 本發(fā)明中，優(yōu)選用作為DDX3X部分肽的例如是下文描述的本發(fā)明的肽。
[0119] 可根據(jù)可獲得的氨基酸序列信息，使用常用的化學(xué)合成技術(shù)，來制造DDX3X或其 部分肽。此類技術(shù)包括普通的液相或固相肽合成技術(shù)。此類肽合成技術(shù)的例子包括Peptide Synthesis(Maruzen, 1975)和Peptide Synthesis, Interscience, New York, (1996)中描述 的技術(shù)。已知的化學(xué)合成設(shè)備，例如，肽合成儀（Applied Biosystems)，也可用于制造DDX3X 或其部分肽。
[0120] 還可使用表達(dá)載體、克隆載體等，使用常用的遺傳工程技術(shù)（包括，例如基于編碼 基因的堿基序列信息進(jìn)行的DNA克隆、質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主、轉(zhuǎn)染物培養(yǎng)和從培養(yǎng)的產(chǎn)物 收集蛋白質(zhì)等流程），來制造用作為抗原的DDX3X或由DDX3X的部分氨基酸序列構(gòu)成的肽。
[0121] 可通過將DDX3X或編碼其部分肽的多核苷酸并入合適的載體DNA來獲得重組載 體。
[0122] 可根據(jù)宿主的類型和期望的用途來合適地選擇載體DNA。載體DNA可以是天然存 在的DNA，或是除增殖所必需的區(qū)域之外的DNA部分被部分缺失的天然DNA。載體DNA的例 子包括源于染色體、游離體或病毒的載體。具體例子包括：細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、酵母 游離體、插入元件、酵母染色體元件、源于病毒（例如桿狀病毒、乳頭瘤病毒、SV40、痘病毒、 腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒）的載體和具有這些病毒的組合的載體、以及 源于質(zhì)粒和菌體的遺傳元件的載體（例如粘粒（cosmids)和粒（phagemids))。
[0123] 含有多核苷酸的重組載體可通過使用已知方法將多核苷酸插入進(jìn)載體DNA來獲 得。具體而言，例如，使用合適的限制性酶在特異性位點對DNA和載體DNA加以切割，將它 們混合并用連接酶重新連接?；蛘撸蓪⒑线m的接頭連接至多核苷酸，并插入進(jìn)適用于所期 望的目的的載體DNA的多克隆位點，以獲得重組載體。
[0124] 可通過使用已知方法，將含有多核苷酸的重組載體導(dǎo)入已知宿主，例如細(xì)菌，例如 大腸桿菌（例如K12)和桿菌屬細(xì)菌（例如MI114)，酵母（例如AH22)，昆蟲細(xì)胞（例如Sf 細(xì)胞）和動物細(xì)胞（例如C0S-7細(xì)胞、Vero細(xì)胞和CHO細(xì)胞），來獲得具有重組載體的轉(zhuǎn)染 體。
[0125] 考慮到基因穩(wěn)定性，優(yōu)選使用染色體整合作為基因?qū)敕椒?。為方便起見，可?用利用核外基因的自主復(fù)制系統(tǒng)。將載體DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過程可按照標(biāo)準(zhǔn)方法（例 如 Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook et al. , Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York, I989)中描述的方法）來進(jìn)行。具體 例子包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、顯微注射、陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿 孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、劃痕負(fù)載（scrape loading)和生物彈轟擊導(dǎo)入（ballistic introduction)。
[0126] DDX3X也可商業(yè)獲得。
[0127] 抗DDX3X抗體也可商業(yè)獲得。
[0128] 用于測量DDX3X的量的抗體可通過使用已知的標(biāo)記方法（例如酶標(biāo)記、放射性標(biāo) 記和熒光標(biāo)記）來標(biāo)記，或可用生物素等來修飾。
[0129] 在本發(fā)明的另一實施方式中，可通過測量DDX3X的mRNA的量來進(jìn)行對DDX3X表達(dá) 水平的測量。具體而言，例如，根據(jù)需要，通過使用常規(guī)方法從癌組織提取或制備mRNA，測量 DDX3X mRNA的量，這例如通過下文例示的方法來進(jìn)行。mRNA的提取或制備可使用例如市售 試劑盒來進(jìn)行。
[0130] 用于測量DDX3X mRNA的量的方法不受特別限制，只要其可測量特定mRNA的水平 即可。例如，可以使用利用了與DDX3X mRNA或?qū)?yīng)的cDNA特異性結(jié)合的多核苷酸探針或 引物的已知方法，包括，例如southern印跡雜交、原位雜交、比較基因組雜交（CGH)、定量 PCR(例如實時PCR)和Invader (來自H0L0GIC，USA的產(chǎn)品）方法。
[0131] 在微陣列方法中，例如，制備具有將與DDX3X mRNA特異性結(jié)合的探針的核酸陣列 (核酸芯片），將從癌組織提取、并用熒光或其它標(biāo)記標(biāo)記過的mRNA樣品應(yīng)用至核酸陣列。 然后對來自已經(jīng)與探針結(jié)合的、經(jīng)標(biāo)記的DDX3X mRNA的信號進(jìn)行測量和分析。
[0132] 在實時PCR中，例如，使用逆轉(zhuǎn)錄酶將從癌組織提取或制備的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cRNA。 通過使用cDNA作為模板，使用與DDX3X cDNA特異性結(jié)合的引物，通過PCR擴(kuò)增出預(yù)定區(qū)域， 在擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生期間對其實時監(jiān)測。
[0133] 用于測量mRNA的量的探針被設(shè)計為允許與DDX3X mRNA或cDNA特異性雜交。
[0134] 作為探針的多核苷酸優(yōu)選是選自下組的多核苷酸，所述組由DDX3X mRNA的完全堿 基序列或部分堿基序列、或它們的互補(bǔ)序列，以及通過對所述多核苷酸的一個至數(shù)個堿基 (例如1至10、1至5、1至3個）進(jìn)行缺失、取代或添加而形成的那些多核苷酸構(gòu)成。探針 多核苷酸典型地為15至500個堿基長，優(yōu)選為20至200個堿基長，更優(yōu)選為20至50個堿 基長。
[0135] 探針多核苷酸可包括標(biāo)記，例如熒光染料、酶、蛋白質(zhì)、放射性同位素以及化學(xué)發(fā) 光物質(zhì)，它們被適當(dāng)?shù)丶尤?，以使得對DDX3X mRNA量的測量得以實現(xiàn)。
[0136] 用于通過定量PCR等進(jìn)行mRNA的量的測量的引物被設(shè)計為允許與DDX3X mRNA或 cDNA特異性雜交。用于設(shè)計引物的方法不受特別限制，例如，可以以用于引物設(shè)計引用的算 法或軟件使用已知的方法來進(jìn)行。典型地，引物作為正向和反向引物組使用。
[0137] 優(yōu)選地，引物選自例如下組的多核苷酸，所述組由DDX3X mRNA的完全序列或部分 序列、或它們的互補(bǔ)序列，以及通過對所述多核苷酸的一個至數(shù)個堿基（例如1至1〇、1至 5、1至3個）進(jìn)行缺失、取代或添加而形成的那些多核苷酸構(gòu)成。引物多核苷酸典型地為 15至30個堿基長。
[0138] 引物多核苷酸可包括標(biāo)記，例如熒光染料、酶、蛋白質(zhì)、放射性同位素以及化學(xué)發(fā) 光物質(zhì)，它們被適當(dāng)?shù)丶尤?，以使得對DDX3X mRNA量的測量得以實現(xiàn)。
[0139] 可例如通過使用遺傳工程技術(shù)（例如Enzymology, 2005 ;392:24-35, 73-96, 173-185,405-419. ；Nucleic Acids Res. 1984 ； 12:9441 ；New Biochemical Experiment Course I, Gene Research Technique II,The Japanese Biochemical Society,p. 105(1986) 中描述的方法）、化學(xué)合成手段例如磷酸三酯法和亞磷酰胺法（J Am Chem Soc. 1967; 89(2):450-3. J Am Chem Soc. 1967 ;89 (26) :7146-7147.)和這些方法的組合來制造多核 苷酸。RNA合成也可按照亞磷酰胺法進(jìn)行，其中使用例如可商業(yè)獲得的高通量DNA合成儀 ABI3900 (Applied Biosystems)與 RNA 合成試劑。
[0140] 還可通過委托提供多核苷酸合成服務(wù)的公司或部門，來獲得多核苷酸。
[0141] 還可通過在癌組織中對表達(dá)DDX3X的細(xì)胞加以計數(shù)來進(jìn)行DDX3X表達(dá)水平測量。 對表達(dá)DDX3X的細(xì)胞的計數(shù)可通過在經(jīng)免疫組織染色的癌組織中對表達(dá)DDX3X的細(xì)胞加以 觀察來進(jìn)行，或通過使用例如流式細(xì)胞儀等技術(shù)，使用經(jīng)例如熒光染料、酶、蛋白質(zhì)或化學(xué) 發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記標(biāo)記的抗DDX3X抗體對癌組織中表達(dá)DDX3X的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)來進(jìn)行。
[0142] 在本發(fā)明的癌惡性程度評估方法中，當(dāng)測量到的DDX3X表達(dá)水平高時，癌組織被 評估為具有高惡性程度，當(dāng)測量到的DDX3X表達(dá)水平低時，被評估為低惡性程度。
[0143] 可使用統(tǒng)計學(xué)方法（例如學(xué)生t-檢驗和Kaplan-Meier方法），基于例如非癌組織 中、通過傳統(tǒng)評估鑒定為高惡性程度的癌組織和通過傳統(tǒng)評估鑒定為低惡性程度的癌組織 中的DDX3X表達(dá)水平，將DDX3X表達(dá)水平和癌組織惡性程度的水平關(guān)聯(lián)起來。
[0144] 本發(fā)明的癌惡性程度評估方法可與其它癌惡性程度評估方法一起進(jìn)行。
[0145] 癌惡件稈度評估試劑倉
[0146] 本發(fā)明的癌惡性程度評估試劑盒可用于本發(fā)明的癌惡性程度評估方法。
[0147] 本發(fā)明的癌惡性程度評估試劑盒包含針對DDX3X的抗體、或能與DDX3X mRNA或?qū)?應(yīng)的cDNA特異性結(jié)合的多核苷酸。
[0148] 在本發(fā)明的一種實施方式中，癌惡性程度評估試劑盒包括針對DDX3X的抗體。
[0149] 所述抗體用于測量蛋白質(zhì)DDX3X的量。
[0150] 與針對癌惡性程度評估方法描述的抗體相同的抗體可用作為癌惡性程度評估試 劑盒中的抗體。
[0151] 所述抗體可形成蛋白陣列（例如抗體陣列和抗體芯片）。蛋白陣列具有基底和抗 體，抗體被配置于基底上。對基底沒有特別限制，只要蛋白質(zhì)可被配置在其上即可。例子包 括玻璃板、尼龍膜、微珠粒、硅片和毛細(xì)管。蛋白陣列（抗體芯片）可通過使用常用于蛋白 陣列制造的方法（例如使用噴墨技術(shù)的方法）將抗體固定到基底上來制造。
[0152] 在本發(fā)明的另一實施方式中，本發(fā)明的癌惡性程度評估試劑盒包括能與DDX3X mRNA或?qū)?yīng)的cDNA特異性結(jié)合的多核苷酸。
[0153] 所述多核苷酸用于測量DDX3X mRNA的量。
[0154] 與針對癌惡性程度評估方法描述的多核苷酸相同的多核苷酸可用作為癌惡性程 度評估試劑盒中的多核苷酸。
[0155] 所述多核苷酸可形成核酸陣列。核酸陣列具有基底和多核苷酸，多核苷酸被配置 于基底上。多核苷酸可以是與針對癌惡性程度評估方法描述的多核苷酸相同的多核苷酸。 對基底沒有特別限制，只要蛋白質(zhì)可被配置在其上即可。例子包括玻璃板、尼龍膜、微珠粒、 硅片和毛細(xì)管。核酸陣列可通過使用常用于核酸陣列制造的方法（例如使用市售點樣儀的 方法和使用噴墨技術(shù)的方法）將多核苷酸固定到基底上來制造。
[0156] 本發(fā)明的癌惡性程度評估試劑盒可包括酶、緩沖劑、試劑或手冊，對它們可根據(jù)意 欲的用途或形式來選擇。
[0157] 癌預(yù)后評估方法
[0158] 本發(fā)明的癌預(yù)后評估方法包括：
[0159] 檢測癌患者的血液中DDX3X特異性T細(xì)胞的步驟；和
[0160] 通過使用檢測結(jié)果評估癌預(yù)后的步驟。
[0161] 在本文中使用時，"癌預(yù)后"表示癌有可能的進(jìn)展。
[0162] 優(yōu)選地，對癌患者血液中DDX3X特異性T細(xì)胞的檢測通過對從癌患者獲得的血液 樣品中的DDX3X特異性T細(xì)胞進(jìn)行檢測來進(jìn)行。
[0163] 血液樣品可使用常用方法獲得。
[0164] 對血液樣品中DDX3X特異性T細(xì)胞的檢測可通過常用的抗原特異性T細(xì)胞檢測方 法來進(jìn)行，所述方法包括例如，抗原依賴性增殖分析（例如 3H-胸苷摻入檢驗）、細(xì)胞毒性測 量（例如51Cr釋放檢驗）、MHC肽四聚體染色、酶聯(lián)免疫斑點（ELISP0T)檢驗和細(xì)胞外細(xì)胞 因子檢驗。
[0165] 用于這些檢測方法中的抗原可以是與針對癌惡性程度評估方法中所描述的抗原 相同的抗原。
[0166] 當(dāng)在癌患者的血液中檢測到DDX3X特異性T細(xì)胞時，預(yù)后被評估為良好，當(dāng)沒有檢 測到DDX3X特異性T細(xì)胞時，則被評估為不良。
[0167] 本發(fā)明的癌預(yù)后評估方法可以與其它癌預(yù)后評估方法一起進(jìn)行。
[0168] 癌預(yù)后評估試齊I丨倉
[0169] 本發(fā)明的癌預(yù)后評估試劑盒可用于本發(fā)明的癌預(yù)后評估方法。
[0170] 本發(fā)明的癌預(yù)后評估試劑盒包含DDX3X或其部分肽。
[0171] DDX3X或其部分肽用于檢測癌患者血液中的DDX3X特異性T細(xì)胞。