專利名稱：同時鑒定新型生物靶和用于藥物開發(fā)的引導(dǎo)結(jié)構(gòu)的方法
1．發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及同時具有重要治療和診斷意義的新型生物靶的發(fā)現(xiàn)和鑒定，更具體地說，本發(fā)明涉及同時發(fā)現(xiàn)和鑒定用于藥物開發(fā)的新型生物靶和引導(dǎo)結(jié)構(gòu)的方法。
2．發(fā)明背景最近，研究者們發(fā)現(xiàn)，在患有某些大病的病人血漿中存在獨特的染色體物質(zhì)循環(huán)(Umovitz等，Chronic Disease Syndromes Symposium，美國微生物學(xué)會，1997年5月)。類似地，最近，不同的表達技術(shù)被用來證明，正常細胞與贅生細胞相比，超過500種RNA轉(zhuǎn)錄子以明顯不同的水平表達(Zhang，L.等，正常和癌細胞中的基因表達圖譜，Science.276∶1268-72，1997)。這些發(fā)現(xiàn)說明，正常細胞和異常細胞間存在大量的分子差異。事實上，可以有理由地假定，存在著成百甚至上千的現(xiàn)有技術(shù)沒有檢測到的潛在生物受體。
目前使用的技術(shù)能為治療和診斷的靶提供有價值的信息，其基礎(chǔ)是鑒定正常和異常樣品間的單個差異。但是，這些技術(shù)不能有效地提供能鑒定相似樣品間觀察到的差異圖譜的信息。相似樣品間觀察到的差異的圖譜可以為更全面的確定特殊疾病亞型提供有價值的信息，它們不僅能幫助分類亞型，而且能幫助確定特殊亞型的合適治療方案。很清楚，新型生物靶的發(fā)現(xiàn)能獲得大量的信息，并且大量的這種靶仍沒有被檢測到，因此急需發(fā)現(xiàn)它們的有效方法。
人們早已認識到，化學(xué)文庫，不管是人工制備還是天然來源的，可用根據(jù)對已知生物受體如蛋白質(zhì)、酶等的親和性進行篩選。親和篩選可以用以下已知的技術(shù)來完成，例如熒光偏振、閃爍親近測定法、酶聯(lián)免疫吸附測定或其他。最近，一種多孔硅生物傳感器也得到了公開，該方法事實上可以檢測任何能以高親和性與另一種分子結(jié)合的分子。當(dāng)生物受體是一種有重要治療意義的靶時，顯示對該靶有高親和性和特異性的文庫成員在診斷和/或藥物開發(fā)中有很高的價值。組合化學(xué)的發(fā)展大大增加了可用于親和篩選的配體數(shù)目。
閃爍親近測定法(SPA)，例如美國專利4，568，649中介紹的方法，被用于在大的化學(xué)文庫中檢測對一種已知受體的親和性。在一個標(biāo)準(zhǔn)的SPA試驗中，受體用一種載有閃爍劑的珠子標(biāo)記，并在溶液中對放射標(biāo)記的配體進行篩選。如果標(biāo)記的配體對受體具有親和性，并被結(jié)合，結(jié)果放射標(biāo)記的配體與玻珠上的閃爍劑接近，導(dǎo)致閃爍劑被激活，并發(fā)光。如果標(biāo)記的配體對受體只有很少或沒有親和性，放射標(biāo)記將不能有效地在閃爍劑附近積累來從放射衰變轉(zhuǎn)移能量，因此幾乎檢測不到發(fā)光。SPA的一個明顯缺陷是系統(tǒng)中存在“噪聲”或背景放射活性，這是由標(biāo)記配體的非特異性吸附引起的。由于這個原因，通常將玻珠與一種封閉劑如白蛋白、去污劑或奶粉一起溫育，封閉引起這種非特異性吸附的位點。SPA的另一個問題是需要使用放射活性物質(zhì)，對健康造成了威脅，這種物質(zhì)很難消除，并且使用非常昂貴。
SPA試驗的修改型已被用于一種競爭型的篩選程序，其中受體被固定在一種載有閃爍劑的玻珠上，然后置于一種含有放射標(biāo)記的該受體底物的溶液中。然后將配體樣品加入到混合物中，能夠成功地與底物競爭固定受體的化合物將減少發(fā)光量。在Wang，P.“靶鑒定，試驗開發(fā)和藥物發(fā)現(xiàn)的高通量篩選”，Sino-American PharmaceuticalProfessionals Association(SPPA)，The 5thRegional Symposium onDrug Discovery and Development，1997，Kenilworth，NJ中介紹了SPA用于高通量篩選。
熒光偏振是另一種頻繁使用的、用于鑒定對一種特殊受體具有親和性的化合物的試驗系統(tǒng)。當(dāng)熒光分子附著于與配體連接的寡聚體的一端時，受體與配體的結(jié)合嚴重限制了熒光分子的旋轉(zhuǎn)。當(dāng)偏振光通過一種含有熒光團標(biāo)記的寡聚體、并且寡聚體上結(jié)合或吸附有一種受體的溶液時，其發(fā)出的光也被偏振。
另一種親和篩選技術(shù)最近由Lin，V_Motesharei，K_Dancil，K_Sailor，M_和Ghadiri，M.在“一種以多孔硅為基礎(chǔ)的光學(xué)干擾生物傳感器”(A porous silicon-based optical interferometricbiosensor)，Science 278，840-43(1997)中公開。簡單地說，該技術(shù)涉及一種薄硅片的使用，該硅片已被蝕刻而產(chǎn)生了一種多孔表面。當(dāng)光照射照射在多孔物質(zhì)上時，就產(chǎn)生了一種干涉圖譜，其位置在周圍介質(zhì)的折射率改變時移動。應(yīng)用已知的化學(xué)知識，將各種分子識別元件吸附于多孔表面，然后將其與一種來源的靶分子反應(yīng)。當(dāng)固定在多孔表面的探針分子與一種靶分子結(jié)合時，所產(chǎn)生的折射率改變在干涉圖譜中產(chǎn)生移動，這種移動可被一種電荷偶聯(lián)的儀器探頭檢測到。該傳感器能檢測非常微小(例如飛摩爾)濃度的DNA以及識別小的有機分子。傳感器的識別元件事實上可以基于任何大分子相互作用，例如核酸雜交、酶底物結(jié)合、凝集素-碳水化合物相互作用、抗體-抗原結(jié)合、宿主-寄生物復(fù)合等。
組合化學(xué)能制備含有成百上千化合物的文庫，這些化合物很多可能在結(jié)構(gòu)上相似。雖然高通量篩選程序能在這些大型文庫中針對已知靶進行親和篩選，但人們已發(fā)展了新的方法，這些方法能提供容量較小但化學(xué)多樣性最大的文庫(見Matter，H.“從結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中選擇最理想的變異化合物二維和三維分子描述的合理研究”，Journal ofMedicinal Chemistry，1997，40∶1219-1229)。
親和指紋檢測法早先被用于檢測小分子差異文庫對一組確定的蛋白的結(jié)合親和性。篩選所獲得的指紋被用于預(yù)測單個文庫成員對其他蛋白或所需受體的親和性。將指紋圖譜與用已知能與所需蛋白反應(yīng)的其他化合物獲得的指紋圖譜進行比較，來預(yù)測文庫化合物是否能進行相似的反應(yīng)。例如，不是在一個大的文庫中對每一種配體檢測其與一種與特殊藥學(xué)活性(例如，抗組胺或抗膽堿能活性)有關(guān)的已知受體的相互作用，而只是對那些具有與已知具有該活性的其他化合物相似的指紋的配體進行檢測。(見Kauvar，L.M.等，“通過親和指紋預(yù)測能結(jié)合蛋白的配體”，Chemistry and Biology，1995，2∶107-118；Kauvar，L.M_“親和指紋”，Pharmaceutical Manufacturing International.1995，8∶25-28；Kauvar，L.M.“農(nóng)業(yè)化學(xué)免疫試驗前沿中的圖譜識別毒性化學(xué)檢測”，D.Kurtz.L.Stanker and J.H.Skerritt.Editors，1995，AOACWashington，D.C_305-312)。
目前使用的技術(shù)和試驗對治療和診斷的已知靶和受體來說是有價值的，但它們在本質(zhì)上非常特殊，因而只能提供有限的信息。例如，差異表達的重點只在檢測mRNA表達的不同水平，它不能檢測序列差異的存在。而且，這種方法不能提供有關(guān)生物系統(tǒng)中其他改變?nèi)甾D(zhuǎn)錄后修飾的信息，后者不會導(dǎo)致表達水平改變，并且在多數(shù)場合不能提供鄰近細胞對異常細胞應(yīng)答的信息。
因此，我們需要一種能廣泛地檢測生物樣品之間的特殊差異和改變的檢測方法。這樣一種方法還能提供有助于鑒定用于診斷和藥物開發(fā)的生物靶和引導(dǎo)結(jié)構(gòu)的方法。
3．發(fā)明簡述本發(fā)明的組合篩選試驗和檢測方法使用高多樣性的化合物文庫對復(fù)雜的混合物進行探索和研究，來鑒別生物樣品間存在的特殊分子差異，后者可用作診斷或發(fā)展治療方法的靶。
本發(fā)明部分基于申請者設(shè)計的敏感、快速、均一的試驗系統(tǒng)，這種系統(tǒng)能使用復(fù)雜的、高多樣性的分子探針文庫對樣品進行評價、探索和分析。能夠以一種均一的方式進行高通量的試驗增加了篩選的敏感性。此外，均一方式還能使相互作用的分子維持它們的天然或活性構(gòu)象。而且，本發(fā)明的均一試驗系統(tǒng)使用了強有力的檢測系統(tǒng)，這種檢測系統(tǒng)不需要單獨的步驟來檢測反應(yīng)產(chǎn)物。在一個優(yōu)選實施方案中，熒光偏振被用來檢測樣品與文庫組分之間的相互作用。
在另一個實施方案中，試驗可以以一種非均一的方式進行，其中一個反應(yīng)組分(例如文庫或樣品組分)以可釋放的方式與固相支持物連接。樣品與文庫作用產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物釋放到液相中，使用強有力的檢測系統(tǒng)例如熒光偏振，反應(yīng)產(chǎn)物可以優(yōu)先被檢測。
本發(fā)明的試驗可用于診斷、藥物的篩選和發(fā)現(xiàn)、目標(biāo)驅(qū)動的藥物發(fā)現(xiàn)以及蛋白組學(xué)和基因組學(xué)領(lǐng)域，用來鑒定疾病標(biāo)記和藥物靶。
在一個實施方案中，本發(fā)明的高敏感性的組合篩選試驗和檢測方法將配體/受體相互作用用作一種發(fā)現(xiàn)工具來檢測復(fù)雜生物混合物中存在的、但迄今尚未檢測到的受體。本發(fā)明的組合篩選試驗和檢測方法評價多樣性的配體與生物樣品中潛在的上千的受體的結(jié)合相互作用，并鑒定該樣品獨特的或特征性的結(jié)合相互作用，后者可能是一種特定病理(包括但不限于疾病、紊亂和感染)的指標(biāo)。因此，本發(fā)明不僅鑒定新型的受體，還分析相同類型的正常和疾病細胞和/或組織之間出現(xiàn)的特殊差異。本發(fā)明的篩選試驗和檢測方法能比現(xiàn)有的靶發(fā)現(xiàn)方法如基因組學(xué)或重點在于檢測基因型改變和僅檢測DNA或RNA改變的差異表達技術(shù)提供更多的信息；而且，蛋白組學(xué)不檢測非蛋白配體，并因而只涉及由特殊序列編碼的蛋白。相反，本發(fā)明的方法檢測所有類型的配體/受體相互作用，受體可以是蛋白、碳水化合物、核酸或任何具有能發(fā)生結(jié)合相互作用的形狀的分子。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可以評價多樣性分子文庫對復(fù)雜的生物樣品中存在的上千的潛在結(jié)合位點的結(jié)合親和性，并產(chǎn)生一個由該樣品顯示的結(jié)合親和性圖譜，后者為該樣品提供一個獨特的指紋。
本發(fā)明使用多樣性的化合物文庫，為復(fù)雜的生物混合物例如血清提供指紋檢測的方法。由文庫成員與生物樣品中的分子之間產(chǎn)生的特異性結(jié)合相互作用為樣品提供了獨特的指紋。這種指紋能鑒定一種特殊樣品中產(chǎn)生的新型相互作用，當(dāng)樣品涉及一種特殊的病理過程時，這種指紋就能鑒定相同類型的正常和異?；蛴胁』驘o病細胞和/或組織之間存在的特殊表型差異。而且，一旦新型相互作用被鑒定，參與其的分子可用作引導(dǎo)結(jié)構(gòu)、受體或靶，用于診斷和/或藥物開發(fā)。
本發(fā)明的篩選試驗不僅包括鑒定個別的新型受體，更重要的是，還包括鑒定結(jié)合相互作用的圖譜，后者是一種病理過程或一類病理過程的特征。這種結(jié)合親和性圖譜可為更全面和更精確地確定和分類疾病亞型提供有價值的信息。準(zhǔn)確診斷不僅對疾病的檢測非常重要，而且對疾病的處理和治療也非常重要，它們都能產(chǎn)生可預(yù)測的臨床結(jié)果。
利用本發(fā)明的原則，可以從多個不同的個體收集樣品，并檢測其與一種確定的文庫的相互作用，所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可用來產(chǎn)生一個包括所有被鑒定的結(jié)合相互作用的數(shù)據(jù)庫。接著可將與從表現(xiàn)一種所研究病理過程或疾病的個體獲得的樣品有關(guān)的數(shù)據(jù)抽出進行分析，并與數(shù)據(jù)庫中保留的記錄進行比較，來鑒定能預(yù)測病理過程或疾病狀態(tài)的相互作用或相互作用圖譜。這樣鑒定的相互作用和圖譜不僅可用于分析和分類特殊的病理過程或疾病狀態(tài)，還可用來組織一種診斷檢測方法或發(fā)展一種治療或藥物。
4．附圖簡述

圖1-5分別是實施例4至7中編輯的數(shù)據(jù)的圖示。
圖6、探針對人和牛血清的差異結(jié)合。該圖描述了使用各種探針從人和牛血清獲得的熒光偏振值。
圖7、探針18對表7中列出的生物樣品的差異結(jié)合。用探針18從每個樣品獲得的熒光偏振值用圖進行了描述。
圖8、探針70對表7中列出的生物樣品的差異結(jié)合。用探針70從每個樣品獲得的熒光偏振值用圖進行了描述。
圖9、探針147的結(jié)構(gòu)和差異結(jié)合圖譜。(A)描述了探針147的結(jié)構(gòu)。(B)該圖描述了使用探針147從表7列出的每個樣品獲得的熒光偏振值。
圖10、探針129的結(jié)構(gòu)和差異結(jié)合圖譜。(A)描述了探針129的結(jié)構(gòu)。(B)該圖描述了使用探針129從表7列出的每個樣品獲得的熒光偏振值。
圖11、探針135的結(jié)構(gòu)和差異結(jié)合圖譜。(A)描述了探針135的結(jié)構(gòu)。(B)該圖描述了使用探針135從表7列出的每個樣品獲得的熒光偏振值。
圖12、探針D6的差異結(jié)合。使用熒光素標(biāo)記的探針D6測定了金黃色葡萄球菌(SA)、二甲氧基苯基青霉素抗性的金黃色葡萄球菌(MRSA)、大腸桿菌和未接種的心腦浸出培養(yǎng)基(BHI)的培養(yǎng)樣品的熒光偏振值。該圖描述了經(jīng)過各個培養(yǎng)溫育階段后從各細菌菌株和未接種的BHI培養(yǎng)基獲得的熒光偏振值。
圖13、以用探針D6獲得的熒光偏振值為基礎(chǔ)對細菌培養(yǎng)物進行分類。由12個未知培養(yǎng)物的熒光偏振試驗獲得的結(jié)果根據(jù)它們的熒光偏振值進行了分組。
圖14、探針對正常(Lot HS300)和糖尿病人血清的差異結(jié)合。該圖描述了使用各種探針從正常和糖尿病人血清獲得的熒光偏振值。
圖15、探針對脫脂的糖尿病和正常(Lot HS300)人血清的差異結(jié)合。該圖描述了使用各種探針從脫脂的正常和糖尿病人血清獲得的熒光偏振值。
5．發(fā)明詳述本發(fā)明涉及能以高親和性與靶分子結(jié)合的化合物的應(yīng)用，這種化合物不僅可能是發(fā)展藥物的引導(dǎo)化合物，而且還是一種信息分子。
在多樣性的化學(xué)組合文庫中，一種化合物與一種特殊的靶結(jié)合的頻率非常低(可能是0.0001％或更低)。但如果有大量的靶，這種頻率會急劇增加。例如，當(dāng)不是一個靶分子而是可能有1000個靶分子時，得到一次“擊中”的可能性就會提高到0.1％。復(fù)雜的生物系統(tǒng)含有成千上萬的不同分子，它們中多數(shù)在一種特殊的疾病狀態(tài)如前列腺癌或乳腺癌中可能改變；因此，在多樣性的有機分子組合文庫的成員和臨床樣品的信息組分之間獲得高親和性相互作用的的可能性比獲得“擊中”一個單個靶的可能性要高得多。在按照本發(fā)明對這些相互作用進行檢測和定量后，就可組成非常完整的樣品圖譜(依賴于進行評價的系統(tǒng)中文庫組分的數(shù)量和多樣性)。
本發(fā)明的組合篩選試驗和檢測方法包括高多樣性的化合物文庫，后者用作指紋來鑒定生物樣品間存在的特殊分子差異。用本發(fā)明的組合篩選試驗和檢測方法鑒定的特殊分子差異是診斷和發(fā)展治療方案的潛在的靶。要想成功地應(yīng)用本發(fā)明的組合篩選試驗和檢測方法，需要至少三個組成部分(1)一種多樣性分子文庫(探針)；(2)一種臨床樣品來源(對照和檢測樣品)；(3)一種檢測文庫成員與樣品組分間相互作用的敏感試驗。
因此，本發(fā)明的一個方面是分析一種病理過程的方法，所說的方法包括鑒定(a)病理過程有關(guān)的生物樣品中存在的受體或靶與(b)配體或探針文庫之間的結(jié)合相互作用的圖譜，其中結(jié)合相互作用的圖譜能提供該病理過程的獨特指紋。根據(jù)本發(fā)明，“受體”或“靶”是證明對一種配體或探針具有結(jié)合親和性或相互作用的生物分子。這種受體或靶的例子包括任何能被差異表達或修飾以及能與探針或配體相互作用的生物活性分子，但不限于蛋白，包括酶；脂類；核酸，包括DNA、RNA；碳水化合物；抗原；抗體等。配體或探針的例子包括天然或人工的任何分子，它可用于與受體或靶相互作用或結(jié)合來測量或指示所說的配體或探針在一種給定的生物樣品中的存在。
在一個特殊的實施方案中，本發(fā)明的組合篩選試驗和檢測方法可用于檢測或分析一種病理過程。根據(jù)該實施方案，被鑒定或分析的病理過程可包括但不限于一種轉(zhuǎn)化表型、遺傳缺陷、惡變、癌癥、腫瘤、遺傳紊亂、病毒感染、細菌感染、真菌感染或一種寄生蟲的存在。
脊椎動物特別是人在生理上非常復(fù)雜。正是這種復(fù)雜性使進行精確的診斷非常困難和消耗時間。例如，血漿含有成千上萬的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類和核酸。這些組分中的任何一個或多個的變化或改變都可能對特殊疾病狀態(tài)有很高的診斷意義或產(chǎn)生一種特殊的治療方法，但系統(tǒng)的高復(fù)雜性阻礙了這些改變的精確檢測和分析。在一個方面，本發(fā)明能對非常復(fù)雜的生物系統(tǒng)進行快速分析，例如血漿或血清、組織勻漿物、腦脊髓液、尿液、痰或其他任何臨床物質(zhì)，包括但不限于那些能以流體形式獲得或制備的的物質(zhì)。
本發(fā)明的一個實施方案是醫(yī)學(xué)診斷。本發(fā)明可以應(yīng)用的診斷領(lǐng)域包括但不限于各種癌癥的早期診斷、感染的檢測和鑒定、治療的毒性副作用的檢測以及其他疾病狀態(tài)和病理過程。對于任何給定的病理過程，在有機體的復(fù)雜生物系統(tǒng)中都有大量生理改變發(fā)生。有些改變是病理過程的直接結(jié)果，而其他是機體對該病理過程應(yīng)答產(chǎn)生的。任何或所有這些改變可以進行診斷。但不幸的是，對多數(shù)疾病來說，可診斷的改變是未知的，并且在本發(fā)明之前，還沒有敏感、快速的方法用于檢測這些可診斷的改變。在某些場合，以抗體為基礎(chǔ)的診斷被用來檢測與特殊病理過程有關(guān)的新抗原(例如與前列腺癌有關(guān)的PSA抗原)，但以抗體為基礎(chǔ)的診斷依賴于首先鑒定該抗原。而且，抗體生產(chǎn)既昂貴又耗時。在本發(fā)明中，大的、多樣性的化學(xué)文庫與生物樣品、血漿(例如來自具有特殊病理過程的個體)的結(jié)合相互作用與來自正常群體的樣品進行比較，并對差異進行分析。這種差異可以是定性的或定量的，并可是與任何分子結(jié)合的結(jié)果，這些分子的例子如蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物或核酸、酶、抗原等。該方法對其能檢測的分子的類型沒有傾向性。在進行研究或者一種獨特的圖譜可識別后，這種結(jié)合相互作用可導(dǎo)致能診斷該病理過程的單個或少量的結(jié)合相互作用被發(fā)現(xiàn)。兩種鑒定獨特結(jié)合相互作用的方法都可裝配成一種廉價的、快速的、以熒光偏振為基礎(chǔ)的試驗，這種試驗可在診所中或其他地方進行。
本發(fā)明的一個應(yīng)用是診斷和治療各種類型的癌癥，這些癌癥的例子如前列腺癌、宮頸癌、卵巢癌。目前，前列腺癌的診斷依賴于以抗體為基礎(chǔ)檢測PSA抗原。其他地方來源的最新證據(jù)表明，評價特定細胞因子的水平也可對這種疾病進行診斷。這兩個指標(biāo)可能不是已經(jīng)存在的前列腺癌的最早指標(biāo)，本發(fā)明提供了一種快速的方法，用于鑒定其他尚未知道的診斷指標(biāo)。因此，本發(fā)明能通過使用一個熒光探針文庫對諸如來自前列腺癌個體的血漿樣品進行檢測來發(fā)現(xiàn)新的診斷標(biāo)記。使用這種篩選試驗導(dǎo)致的發(fā)現(xiàn)接著可導(dǎo)致治療方法的發(fā)展。因此，本發(fā)明包括用于診斷試驗或試劑盒的探針或標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)以及它們隨后在藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用。
本發(fā)明還可用于Pap涂片樣品中的診斷標(biāo)記的檢測。根據(jù)本發(fā)明，從個體中獲得的正常和異常Pap涂片樣品可用一個標(biāo)記探針文庫進行篩選，對惡變或感染性疾病有診斷意義的結(jié)合相互作用可用于以熒光偏振為基礎(chǔ)的診斷。而且，與一種惡變或感染疾病有關(guān)的生物分子的發(fā)現(xiàn)可接著用于發(fā)展治療。
本發(fā)明可用于為卵巢癌篩選生物標(biāo)記，后者可用于為卵巢癌發(fā)展一種診斷試劑盒。最近，卵巢癌活化因子(OCAF)被認為是卵巢癌的一種生物標(biāo)記。目前，一種針對CH125的血清學(xué)試驗被用于檢測卵巢癌，CH125是卵巢癌的一種生物標(biāo)記。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明中介紹的熒光偏振試驗、DNA阻塞試驗和閃爍親近試驗(SPA)可用于臨床研究，來研究卵巢癌的已知生物標(biāo)記(OCAF和CA125)和鑒定卵巢癌的新型生物標(biāo)記。這些試驗系統(tǒng)將提供使用一種標(biāo)記探針或標(biāo)記探針文庫篩選臨床樣品的簡單、快速、敏感和精確的方法。
例如，熒光化合物與從患有卵巢癌的病人獲得的樣品(血液、血清、血漿或其他體液)相互作用的熒光偏振值可與由患有其他種類的婦科癌癥、非婦科癌癥或無癌癥的病人的臨床樣品獲得的熒光偏振值進行比較。患有卵巢癌的病人的樣品與其他樣品比較，其偏振值改變就表明一種試劑能差異性地與來自卵巢癌病人的樣品中存在的(一種)組分結(jié)合。這樣，這種試劑就可能是一種有用的生物標(biāo)記，來將卵巢癌樣品與非卵巢癌樣品區(qū)別開來。來自患有卵巢癌的病人的樣品的偏振值與其他樣品沒有明顯的差異，就說明該試劑不能用作一種生物標(biāo)記來將卵巢癌樣品與非卵巢癌樣品區(qū)別。被鑒定為能與不同類型的癌癥差異結(jié)合的試劑可以單獨使用或與其他試劑組合使用，用來檢測和診斷不同類型的癌癥。而且，被鑒定的試劑可用來發(fā)展治療癌癥的療法。
本發(fā)明還提供鑒定糖尿病發(fā)作的一種早期指標(biāo)的方法。目前用于檢測糖尿病的方法只在疾病完全發(fā)展并且很多損害已經(jīng)發(fā)生后才有用。確實，診斷只在主要癥狀存在后進行。用另一種方法表述，目前的診斷方法僅僅證實該疾病的存在。本發(fā)明介紹的方法為鑒定能作為糖尿病的早期指標(biāo)的試劑提供方法。例如，血液蛋白的糖基化是糖尿病的一個特征，它能產(chǎn)生獨特的結(jié)合位點，這些位點可用本發(fā)明介紹的方法使用來自一個標(biāo)記的多樣性的分子文庫的探針進行檢測。根據(jù)本發(fā)明那些被鑒定為糖尿病發(fā)病的早期指標(biāo)的探針可用于以熒光偏振為基礎(chǔ)的試驗。這種試驗可在診所或診斷實驗室用作診斷手段。
本發(fā)明進一步提供鑒定和區(qū)分感染性微生物以及它們引起的疾病的方法。感染性微生物在其宿主中可產(chǎn)生廣泛的、大多未進行分析的蛋白、碳水化合物和其他分子。而且，應(yīng)答于感染，宿主有機體產(chǎn)生獨特的蛋白質(zhì)如特異性抗體、特異性受體、趨化因子和細胞因子。所有這些獨特的分子都是探針結(jié)合的候選物并因而代表感染性疾病的新的診斷靶。本發(fā)明提供鑒定能區(qū)分感染性微生物和/或它們引起的疾病的結(jié)合候選物的方法。所鑒定的結(jié)合候選物可接著用于診斷感染性疾病，并可導(dǎo)致藥物治療的發(fā)展。實施例10介紹了從一個小的探針文庫中發(fā)現(xiàn)一種獨特的探針，該探針能將金黃色葡萄球菌與二甲氧基苯基青霉素抗性的金黃色葡萄球菌區(qū)分。
本發(fā)明不僅可用于感染性細菌的檢測，還可用于其他感染性物質(zhì)如真菌、寄生蟲、病毒和有可能甚至是阮病毒的檢測。例如，神經(jīng)氨酸酶抑制劑已被發(fā)展來抑制甲型和乙型流感病毒。這些藥物的有效應(yīng)用需要有快速的診斷試劑盒來鑒定流感病毒的存在。本發(fā)明提供發(fā)現(xiàn)對病毒神經(jīng)氨酸酶或某些其他病毒組分具有高親和力的標(biāo)記分子的方法。這些探針可隨后整合進一種快速診斷檢測方法來檢測流感病毒的存在。
上面的討論證明了使用本發(fā)明介紹的試驗系統(tǒng)檢測具有與臨床樣品差異結(jié)合能力的已知試劑和鑒定新試劑的某些優(yōu)點。那些被鑒定的試劑可單獨或與其他試劑組合使用，來檢測和診斷病理過程或疾病。一旦使用本發(fā)明的方法被鑒定，這種試劑可用作快速和廉價的診斷手段(例如，診斷試劑盒)來檢測和診斷各種病理過程和疾病。
本發(fā)明的另一個方面是鑒定有重要治療和診斷意義的生物靶和發(fā)展藥物的引導(dǎo)結(jié)構(gòu)的方法，包括將兩種生物樣品與兩種相同的探針文庫作用，其中一種生物樣品是對照，檢測每種探針與生物樣品的組分之間的結(jié)合相互作用，并鑒定是第二種(非對照)生物樣品的特征的結(jié)合相互作用。這樣鑒定的配體或靶是一種生物靶，并且對該生物組分具有親和性的探針是發(fā)展藥物的引導(dǎo)結(jié)構(gòu)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，第二種生物樣品包括來自疾病個體血清或患病的或其他與對照為相同類型的異常細胞或組織。因為診斷通常以一種可檢測的生物靶為基礎(chǔ)，因此該方法在發(fā)展與被篩選的細胞或組織有關(guān)的病理過程的診斷工具中有很高的價值。而且，因為每當(dāng)一種新的受體或靶被發(fā)現(xiàn)，對該受體有親和性的化合物也被發(fā)現(xiàn)，因此該方法是發(fā)展用于治療該病理過程的藥物的引導(dǎo)結(jié)構(gòu)的一種來源。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的原則可用于潛在藥物的毒理學(xué)篩選。本發(fā)明包括確定一種化合物的毒性特性的方法以及確定在一個個體中毒性化合物的存在的方法，這通過測定對毒性化合物的生物應(yīng)答來進行。許多藥物以及它們的代謝產(chǎn)物具有有害副作用或有毒。迫切需要能預(yù)測毒性損害的早期指標(biāo)而不是僅僅證明損害已經(jīng)發(fā)生。目前，毒性特性或副作用的預(yù)測在藥物發(fā)展的早期非常困難，因為它發(fā)生在臨床試驗之前。使用本發(fā)明的原則，毒性特性的存在或缺如可在比目前可能的早得多的發(fā)展階段進行預(yù)測。檢測這些早期警告信號的初步研究可使用細胞培養(yǎng)研究如利用肝細胞來完成。在這種方法中，肝細胞培養(yǎng)物可用已知毒素處理，一段時間后，取出樣品，用一個標(biāo)記化合物的多樣性文庫進行檢測。在處理培養(yǎng)物中出現(xiàn)而在對照中不出現(xiàn)的結(jié)合相互作用可能是細胞或組織損害的早期標(biāo)記。這些探針可隨后在動物模型中進行檢測。這樣本發(fā)明提供了檢測藥物或其他化合物造成的可能造成損害的預(yù)測性早期標(biāo)記的方法。
根據(jù)本發(fā)明的這個方面，培養(yǎng)的細胞或組織用已知有毒或無毒的化合物進行處理，然后從培養(yǎng)物中制備抽提物，并用一個標(biāo)記化合物文庫進行檢測。這種標(biāo)記化合物文庫檢測提供了能反映細胞或組織對有毒或無毒化合物應(yīng)答的“指紋”。分析與毒性特性有關(guān)的指紋圖譜的任何改變，并還可進一步分類。接著，已經(jīng)按上述方法建立了指紋圖譜的培養(yǎng)細胞或組織用具有未知毒性特性的待測化合物處理，從處理的培養(yǎng)物中制備抽提物，并用標(biāo)記化合物文庫進行檢測。然后將所產(chǎn)生的細胞或組織應(yīng)答的指紋或圖譜與用已知有毒或無毒的化合物在該細胞或組織上產(chǎn)生的參考圖譜進行比較，來預(yù)測待測化合物的本質(zhì)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的原則可用于分析一種表達蛋白的功能。基因組測序計劃包括人類基因組計劃產(chǎn)生了大量的基因序列數(shù)據(jù)，這些基因序列可被克隆，這些基因編碼的蛋白可被表達。不幸的是，已知一個基因的序列或從該序列表達一種蛋白通常不能揭示該蛋白的功能、它在疾病中的作用、或與該表達蛋白在生活細胞相互作用的其他分子。
認識到基因組在提供這類信息中的缺點，幾個公司已接受了“蛋白組學(xué)”方法。在蛋白組學(xué)中，二維(2-D)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)被用來根據(jù)電荷和質(zhì)量分離蛋白。然后將所產(chǎn)生的蛋白圖譜進行比較，并試圖根據(jù)獨特的圖譜將病人群體分類。這種方法的優(yōu)點是研究表型(是什么)而不是基因型(可能是什么)。眾所周知，2-D電泳不能檢測或解決非常復(fù)雜樣品中的大量蛋白。本發(fā)明的方法沒有這個難題，因為一種標(biāo)記探針與小的、中等的、大的靶都能給出清楚的分辨信號。而且，本發(fā)明是三維(3-D)的，除了靶分子非常小(小于幾個千道爾頓)外，每一個結(jié)合事件都能給出一個清晰的分辨信號。而且PAGE是被設(shè)計來檢測蛋白質(zhì)，而本發(fā)明是被設(shè)計來檢測一種標(biāo)記探針與任何大于幾千道爾頓的生物分子之間的結(jié)合相互作用。最后，進行和分析2-D凝膠非常耗時、費力和昂貴，而相反，本發(fā)明的方法非?？焖俸土畠r。在任何直接比較時，能夠產(chǎn)生預(yù)測的本發(fā)明的方法優(yōu)于蛋白組學(xué)或基因組學(xué)。
本發(fā)明提供一種查明表達蛋白的生物學(xué)功能的方法。當(dāng)表達蛋白用小的有機分子的標(biāo)記文庫進行檢測時，能發(fā)現(xiàn)一些數(shù)量的探針與這些蛋白的結(jié)合位點結(jié)合。這些探針本身是這些表達蛋白的潛在抑制劑。這些探針可加入到細胞培養(yǎng)物或其他系統(tǒng)中，來確定它們的生物影響，并因而可用于確定該蛋白的活性。此外，標(biāo)記探針可用作一種人工底物與未標(biāo)記的分子進行競爭性試驗來發(fā)現(xiàn)具有更高親和力的抑制劑。這些未標(biāo)記的分子可隨后在動物模型中檢測來確定這些激動劑或拮抗劑對細胞功能的影響。按這種方式，一種以前未知或未分析的表達蛋白的功能可使用本發(fā)明介紹的技術(shù)進行測定。
從細菌到人的有機體的基因組的測序基因正在被大規(guī)?？寺『捅磉_。本發(fā)明提供快速闡明這些蛋白的功能并同時發(fā)現(xiàn)開發(fā)新藥物的線索的方法。此外，本發(fā)明包括發(fā)現(xiàn)潛在的抑制劑或親和性配體的方法，它們可用于純化或分析這些酶學(xué)或結(jié)構(gòu)功能未知的蛋白。這種蛋白靶包括用基因組方法鑒定的蛋白靶。
本發(fā)明還提供這樣一類方法，它們可用于分出任何目的的群體。例如該技術(shù)可用于分出進行臨床試驗的組。而且，本發(fā)明允許對病理過程的早期檢測或各種疾病的分布圖譜進行大量而廉價的篩選。一旦信息探針已被發(fā)展，篩選的費用將非常低。篩選只需要廉價的熒光偏振儀器和探針。探針不僅制備低廉，而且一次試驗只需要納摩爾級。
本發(fā)明的大量其他方面、特征和優(yōu)點在下面的優(yōu)選實施方案的詳述和所附的權(quán)利要求中非常明顯。但應(yīng)當(dāng)理解，本公開應(yīng)被認為是本發(fā)明的原則的舉例，并且不應(yīng)認為本發(fā)明被這里介紹的內(nèi)容所限制。
5．1 探針的多樣性配體文庫及其檢測根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，當(dāng)生物樣品如血液、血清、體液如尿液、腦脊髓液、羊水、唾液、粘液、組織樣品、細胞、病毒、微生物、或有機分子如RNA、DNA、肽和蛋白、以及小的有機分子與一組已知試劑接觸而產(chǎn)生一組反映結(jié)合相互作用圖譜的數(shù)值時，就建立了“指紋”。根據(jù)本發(fā)明，多樣性配體文庫包括能與受體或靶反應(yīng)或結(jié)合的已知試劑或探針組，它可用來指示受體或靶在一種給定生物樣品中的存在。本發(fā)明的配體或探針包括但不限于任何天然或合成的生物分子，并可包括但不限于核酸包括DNA或RNA、小的有機分子、肽、糖蛋白、蛋白、多糖、糖類或無機分子。
根據(jù)本發(fā)明，配體或探針文庫可用于產(chǎn)生差異結(jié)合圖譜來準(zhǔn)確地區(qū)分生物樣品。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，多樣性的配體文庫包括已知的分子，這些分子在與一種生物樣品接觸時能產(chǎn)生一組反映結(jié)合相互作用圖譜的數(shù)值。當(dāng)本發(fā)明的指紋被用于區(qū)分樣品如鑒定或區(qū)分一種特殊的微生物如病毒、細菌、寄生蟲或真菌的一個特殊菌株時，配體多樣性文庫應(yīng)包括已知能特異性或非特異性地與該微生物的一個組分相互作用的配體或探針。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，當(dāng)受體或靶是未知的時，待測生物樣品可與一種包含部分隨機選擇的分子的配體或探針文庫作用，這樣就可鑒定獨特的結(jié)合相互作用，后者可隨后用已知方法進行鑒定。被發(fā)現(xiàn)僅在待測樣品中存在或在待測樣品中以不同濃度存在的受體可用作與該待測樣品有關(guān)的特殊病理過程診斷或治療的潛在的靶。此外，被發(fā)現(xiàn)對該受體有高親和性和特異性的配體可提供藥物發(fā)展的引導(dǎo)結(jié)構(gòu)。
在一種生物樣品與一組特征性提供的配體作用時，對樣品中存在的一種受體具有高親和性的配體將與該分子結(jié)合，形成配體/受體結(jié)合物，后者可用各種試驗技術(shù)進行鑒定。正?；?qū)φ諛悠分邪l(fā)生的結(jié)合相互作用可與在包含與對照相同類型的異常細胞或組織的第二個樣品中發(fā)生的結(jié)合相互作用進行比較，來鑒定兩種樣品中的特殊差異。所介紹的試驗系統(tǒng)中使用的探針/配體可進行標(biāo)記、尾標(biāo)或接合，這樣當(dāng)生物樣品中的組分與探針結(jié)合時，就可產(chǎn)生一種可檢測的信號。探針/配體可用本領(lǐng)域已知的標(biāo)記物進行標(biāo)記，包括但不限于放射性同位素、熒光分子、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光化合物。
在用于液閃親近試驗時，分子優(yōu)選用一種放射性同位素標(biāo)記，包括但不限于32P、35S、125I或131I。放射性同位素可用γ計數(shù)器或液閃計數(shù)器進行檢測。
探針/配體還可用一種熒光分子如熒光素(FL)、羅丹明、4-4-difluoro-5，7-dimethyl-4-bora-3a，4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid(BO或BODIPY)、異硫花菁、花菁或其他熒光染料進行標(biāo)記。熒光標(biāo)記的探針/配體與生物樣品的組分之間的相互作用可用熒光分光光度計或優(yōu)選通過分析混合物的熒光偏振來檢測。
探針與生物樣品的組分之間的結(jié)合相互作用還可用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)進行檢測。探針可標(biāo)記或接合到這樣的分子如生物素、鏈親和素或地高辛上。用這些分子標(biāo)記的探針可用該標(biāo)記特異的酶聯(lián)抗體進行檢測。此外，探針可用一種抗體進行標(biāo)記，該抗體可以接合或不接合一種酶。不接合酶的抗體可用接合了一種酶的第二抗體進行檢測。酶聯(lián)抗體將以這樣一種方式與一種合適的底物反應(yīng)，它可產(chǎn)生一種可檢測的例如使用分光光度計、熒光光度計或肉眼方法的化學(xué)半分子。可以用來檢測性標(biāo)記抗體的酶包括但不限于蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、Δ5-類固醇異構(gòu)酶、酵母乙醇脫氫酶、α-磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬氨酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。
本發(fā)明的方法可使用按照本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的任何技術(shù)合成的配體文庫。它們優(yōu)選通過使用傳統(tǒng)的液相反應(yīng)或固相合成技術(shù)來制備。所感興趣的有機分子如含有第一個或第二個氨基基團、或羥基基團或硫基團或醛基或酮基、或羧酸的生物活性化合物可直接用合適的熒光分子(染料)在溶液中進行標(biāo)記，來制備相應(yīng)的熒光標(biāo)記的配體。這些方法和染料在Haugland，R.P.“熒光探針和研究化合物手冊”，6thED_1996中介紹。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，液相合成在一種合適的極性有機溶劑或溶劑混合物如DMF、DMSO、THF中進行，使用略微過量的染料以保證完全標(biāo)記。所產(chǎn)生的熒光標(biāo)記的探針用有機合成的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如使用酸或堿的液相-液相抽提、結(jié)晶和色譜(薄層或柱)進行純化。也可以按下面實施例中的介紹使用其他的純化方法如使用聚合物結(jié)合的清除劑的液相-固相抽提并接著簡單過濾以去除未反應(yīng)的染料(見Obrecht，D.和Villalgordo，J.M_“小分子量化合物文庫的固相支持的組合和平行合成”，Pergamon，1998，第3章)。 方案Ⅰ液相反應(yīng)(產(chǎn)物用清除劑樹脂純化)在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的文庫使用傳統(tǒng)的固相技術(shù)制備。見諸如Bodanszky，“肽合成的原則”(Springer-Verlag1984)；Bodanszky等，“肽合成實踐”(Springer-Verlag1984)；Barany和Merrifield，“肽分析、合成和生物學(xué)”，2卷，1章(Academic Press1980)；Atherton等，Bioorg.Chem.Vol．8(1979)。這是因為固相合成比更傳統(tǒng)合成方法具有幾種優(yōu)越性。例如，可以使用大大過量的反應(yīng)劑或起始物質(zhì)來驅(qū)動單個的反應(yīng)至完成，并且純化和分離可通過簡單地過濾和洗滌來進行，因為產(chǎn)物被吸附在固相支持物上。而且，樹脂結(jié)合種類的相關(guān)位點分離可抑制多種類型的分子間副反應(yīng)。
下面介紹一種被發(fā)現(xiàn)特別適合于合成本發(fā)明的文庫的固相合成方法。這種方法能快速而有效地組成熒光標(biāo)記的配體多樣性文庫，它包括兩個通用步驟。在第一步中，一種熒光染料被共價連接到一種固相支持物上。在第二步中，固化的染料與一種化合物或化合物的混合物反應(yīng)，來形成所需的配體混合物，這一步在需要時可重復(fù)多次。本發(fā)明包括使用粘附到它們被合成的固相支持物上的文庫或粘附到不同固相支持物上的文庫的試驗。但配體混合物優(yōu)選在第三個步驟中從支持物上切割下來。這個可選用的第三步驟包含在示于方案Ⅱ的本發(fā)明的合成方法的優(yōu)選實施方案中 方案Ⅱ其中，＆＃60A＆＃62、＆＃60B＆＃62、＆＃60C＆＃62、＆＃60D＆＃62和＆＃60E＆＃62代表適合于通式(b)-(g)表示的所需產(chǎn)物或中間物形成的反應(yīng)條件，框號(即[])表示可選用的平行和順序反應(yīng)、反應(yīng)劑和/或產(chǎn)物。
根據(jù)方案Ⅱ，通式(a)的一種染料分子選自
X-D-Y通式(a)其中D是一種熒光半分子，X和Y是獨立選自鹵素、醇基、硝基、硫羥基、醚、酯、羧酸、α-鹵代羧酸衍生物、胺、酰胺及其保護或非保護衍生物的官能團。通式(a)的染料分子的例子包括但不限于熒光素衍生物如dichlorotriazylaminofluorescein(DTAF)、dichlorosulfofluorescein(DCSF)和硝基熒光素、色氨酸衍生物、香豆素衍生物、萘衍生物、雙吡啶衍生物(bpy)、三吡啶衍生物、花菁、羅丹明和有機金屬復(fù)合物如Ru(bpy)3及其衍生物。染料分子的選擇依賴于多種因素，包括諸如大小、溶解性、對固相反應(yīng)條件下降解的敏感性、吸收和發(fā)射波長、量子產(chǎn)生、以及量子產(chǎn)生和發(fā)射波長對周圍化學(xué)環(huán)境的敏感性。這些因素中的多數(shù)以及這些和其他合適化合物的合成可從文獻中方便地確定。見諸如Haugland，R.P_“熒光探針和研究化合物手冊”(6thed_1996)。
同樣，根據(jù)方案Ⅱ，通式(b)的一種反應(yīng)底物選自樹脂-L-E通式(b)其中樹脂代表適合于固相合成的任何固相支持物，L是附著在固相支持上的一種接頭，E是結(jié)合在L上的一種游離基團。合適的固相支持包括諸如聚苯乙烯-二乙烯苯(PS-DVB)共聚物和聚乙烯甘油-PEG-PS-DYB共聚物。帶有或沒有合適接頭的Wang(聚合物結(jié)合的4-芐氧基芐基醇)和rink樹脂可從Aldrich Chemical Co_Milwaukee，WI；Novabiochem，San Diego，CA；和Advanced Chemtech，Louisville，KY.獲得。
接頭L-E按下面的要求進行選擇，即它與固相支持的結(jié)合可在方案Ⅱ中＆＃60E＆＃62所示的反應(yīng)條件下方便地切割。合適的接頭對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是熟知的，包括諸如鹵素、硫羥、醇、醚、酯、醛、酮、羧酸、硝基、胺、酰胺、硅烷、以及它們的保護或非保護的衍生物。這種接頭與固相支持物的連接可使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法來完成。見諸如Bunin，B.A_“組合物索引”，Academic Press，1998。
除了上面介紹的準(zhǔn)則，接頭L-E還可按如下要求進行選擇，即它將與通式(a)的染料分子的熒光半分子D在反應(yīng)條件＆＃60A＆＃62下形成一種共價鍵，產(chǎn)生一種通式(c)的固化染料
樹脂-L-D-Y通式(c)合適的反應(yīng)條件＆＃60A＆＃62依賴于樹脂、L、E和X，它為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知或可方便地測定。一般來說，它們包括使用一種能使樹脂膨脹并與X反應(yīng)的溶劑。合適的溶劑包括諸如二甲基甲酰胺(DMF)、1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、四氫呋喃(DHF)、CH2Cl2及其混合物。反應(yīng)條件＆＃60A＆＃62還可包括一種堿例如二異丙基乙胺(DEPEA)、三乙胺、二甲氨基吡啶(DMAP)、或N-methylmorphaline(NMM)來中和反應(yīng)中產(chǎn)生的酸。
通式(c)的固化染料用作形成配體文庫(方案Ⅱ中通式(g)表示)的基礎(chǔ)。但如果反應(yīng)半分子Y是被保護的，它就必須在其他反應(yīng)前去保護。這個可選用的、形成脫保護半分子Y’的去保護過程在方案Ⅱ中＆＃60B＆＃62表示的反應(yīng)條件下進行。這些條件依保護的基團而不同，它們對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是熟知的。見Greene，T.W.和Wuts，P.G.M_“有機化學(xué)中的保護基團”(2nded_1991)。
然后，固化的染料在反應(yīng)條件＆＃60C＆＃62下與一種通式E1R1G1的化合物反應(yīng)，產(chǎn)生一種通式(d)的化合物樹脂-L-D-R1-G1通式(d)其中E1和G1可以相同或不同，E1是一種離去基團或保護基團，G1或者是R1的末端或者是一種離去基團或保護基團，R1代表具有如下特征的任何化學(xué)片段，它至少含有一個保護性或非保護性反應(yīng)半分子，后者能在合適的催化和/或去保護條件下使R1添加到熒光半分子D上。合適的反應(yīng)半分子包括但不限于鹵素、硫羥、醇、醚、酯、醛、酮、羧酸、硝基、胺、酰胺、硅烷及其保護性和非保護性衍生物。合適的反應(yīng)條件＆＃60C＆＃62包括那些已為固相組合化學(xué)發(fā)展的條件。見諸如Brown，R_“當(dāng)代有機合成”，216(1997)；Felder，E.R.和Poppinger，D_Adv.DrugRes_30∶111(1997)；Balkenhohl，F(xiàn).等，Angew.hem.Int.Ed.Engl.35∶2288(1996)；Hermkens，P.H.H.等，Tetrahedron 52∶4527(1996)；Hermkens，P.H.H.等，Tetrahedron 53∶5643(1997)；Thompson，L.A.等，Chem.Rev.96∶555(1996)；和Chem.Rev.97(2)(1997)。加成反應(yīng)的例子包括一個初始的胺與醛加成，形成一個亞胺，后者又可與多種不同的半分子反應(yīng)，包括諸如β-內(nèi)酰胺、吡咯烷、thiozolidinones和酰胺。酸性基團具有同樣的柔性，并可用來與諸如醛、胺和異腈在Ugi多組分濃縮條件下反應(yīng)，形成小的酰胺或雜環(huán)化合物。
如方案Ⅱ所示，通式(c)的固化染料分子也可與化合物的混合物反應(yīng)，這些化合物每種都不同但具有通式E1R1G1；即E1R1G1+(E1R1G1)’+(E1R1G1)”+…+(E1R1G1)i，其中i是混合物中化合物的數(shù)目，并且是一個小于約50的整數(shù)。在這種情況下，制備一種通式(d)化合物的混合物，每種化合物都具有不同的R1G1片段，即樹脂-L-D-R1G1+樹脂-L-D-(R1G1)’+樹脂-L-D-(R1G1)”+…+樹脂-L-D-(R1G1)i。但通式(c)的化合物優(yōu)選只與通式E1R1G1的一種化合物反應(yīng)。
因為許多藥物活性化合物含有反應(yīng)性的半分子如胺和羧酸，本發(fā)明認為這種化合物被通式E1R1G1所包括，在這種情況下，可以需要或不需要進一步的反應(yīng)。但如果通式(d)的化合物的R1片段是一個反應(yīng)性的半分子，那么n-1次順序加成反應(yīng)可在總體上參照方案Ⅱ的＆＃60D＆＃62中的條件下進行，其中n表示與熒光半分子D結(jié)合的半分子的數(shù)目，并且是一個優(yōu)選小于約100的整數(shù)。
如上所述，這些順序加成反應(yīng)的每一個都可使用通式EkRkGk的單種化合物或其混合物，其中k是介于2和n-1之間的一個整數(shù)，Rk是結(jié)合到固化的熒光半分子D上的第K個半分子(通過已經(jīng)與D結(jié)合的第k-1個半分子)，Ek和Gk可以相同或不同，Ek是一個離去基團或保護基團，Gk是Ek的末端或一個離去基團或保護基團，Rk表示具有如下特征的任何化學(xué)片段，即它至少含有一個能使Rk加成到固定化合物上的反應(yīng)性半分子。合適的反應(yīng)條件＆＃60C＆＃62包括催化劑、脫保護劑和其他能促進Rk加成到固化的染料化合物上的試劑的使用。
完成上面介紹的反應(yīng)可形成通式(f)的固化的化合物樹脂-L-D-Rn通式(f)或通式(f)的固化化合物的混合物，即樹脂-L-D-(R1R2R3…Rn)+樹脂-L-D-(R1R2R3…Rn)’+樹脂-L-D-(R1R2R3…Rn)”+…樹脂-L-D-(R1R2R3…Rn)n，其中m具有最大值I*n，而I等于含有最大數(shù)量化合物的EkRkGk混合物中的化合物的數(shù)量。為了簡便，Gn從通式(f)中忽略，因為配體的末端(例如Rn)不經(jīng)歷進一步的加成反應(yīng)。
在方案Ⅱ的最后步驟中，染料-配體化合物在反應(yīng)條件＆＃60E＆＃62下從固相支持上切割下來，產(chǎn)生通式(g)的化合物文庫P-D-Rn通式(g)其中應(yīng)當(dāng)理解，通式(g)包含由方案Ⅱ中所示的反應(yīng)產(chǎn)生的所有可能的化合物或化合物的混合物。合適的切割條件＆＃60E＆＃62對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是熟知的，并依賴于樹脂與L之間的鍵。切割可在酸性或堿性條件下完成，或可由光誘導(dǎo)。多種合適的切割方法已在文獻中報道。例如，方案Ⅲ中顯示了一些用三氟乙酸(TFA)在二氯甲烷中處理通式(f)的修飾樹脂來完成的切割反應(yīng) 方案Ⅲ其中(j)是一種Wang樹脂衍生物；(k)是一種Wang氨基甲酸酯樹脂衍生物；(m)是一種Rink樹脂衍生物；(n)是一種Rink氨基酸樹脂衍生物；(o)是一種三苯甲基或氯三苯甲胺(即X=NH)或醇(即X=0)樹脂衍生物；L1表示任何在固相反應(yīng)條件下穩(wěn)定的側(cè)鏈或間隔。合適的側(cè)鏈的例子包括但不限于被取代和未被取代的烷基、芳香基和芳烷基。
切割后，優(yōu)選除去溶劑來分離熒光文庫。文庫可隨后溶于一種適合在本發(fā)明的試驗中使用的溶劑如二甲基亞砜(DMSO)。
方案Ⅱ的方法的特殊實施方案示于方案Ⅳ-Ⅷ。為清楚起見，這些方案沒有顯示混合物的反應(yīng)和形成。但應(yīng)當(dāng)理解，所顯示的每個單獨反應(yīng)都表示大量平行反應(yīng)的可能性。
方案Ⅱ的通用方法的一個特別簡化的實施方案示于方案Ⅳ 方案Ⅳ其中L1是在所示的反應(yīng)條件下不會阻礙或抑制偶聯(lián)反應(yīng)的任何半分子；P表示L1從固相支持物上切割下來后的末端；R1和R2可以相同或不同，并可以是任何所需的為文庫提供優(yōu)選的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)特征的半分子。合適的半分子的例子包括但不限于被取代和未被取代的烷基、芳香基和aralkyl基團。
根據(jù)方案Ⅳ，使用二氨基甲酸酯Wang樹脂或氨基酸Rink樹脂或二氨基/氨基醇三苯甲基/氯三苯甲基樹脂將DTAF固化到所給的monochlorotriazylaminofluorescein樹脂的固相支持物上。該反應(yīng)優(yōu)選在環(huán)境溫度下進行。DTAF與一種大約0.5至大約3倍量堿如DIPEA、三乙基胺、DMAP或NMM一起溶解在一種合適的溶劑如DMF、NMP、THF、methylene chloride或其混合物中。使用過量的(優(yōu)選大約2至6倍量之間)、諸如DMF或NMP中的、對稱的二胺取代三嗪環(huán)上剩余的氯基，為進一步的合成提供新的反應(yīng)基團。這個過程可根據(jù)需要使用多種不同的反應(yīng)劑重復(fù)多次，然后將產(chǎn)生的熒光化合物或化合物的混合物從反應(yīng)支持物上切割下來。
方案Ⅱ的通用方法的另一個實施方案示于方案Ⅴ 方案Ⅴ其中DCSF通過用仲烷胺并優(yōu)選是一個環(huán)形的仲胺取代一個氯原子結(jié)合到樹脂上來附著在固相支持物上。這樣L1組成了環(huán)二胺的一部分。合適的環(huán)二胺包括諸如哌嗪、同型哌嗪、4，4’-三亞甲基雙哌嗪及其衍生物和異構(gòu)體。如圖所示，雖然HNR1NH可以被任何具有合適的反應(yīng)基團的化合物取代，R1也組成了環(huán)二胺的一部分。R2和R3表示任何適合于整合到本發(fā)明的熒光配體文庫中的半分子，并包括諸如天然氨基酸的側(cè)鏈、被取代和未被取代的烷基、芳香基和aralkyl基團等。
如方案Ⅳ所示，通過在標(biāo)準(zhǔn)酰胺形成條件下(即PyBrOP/DMAP/DMF)熒光化合物的游離氨基與Fmoc氨基酸的反應(yīng)，一種N-Fmoc保護的氨基酸被結(jié)合到熒光樹脂上。在DMF中用哌啶除去Fmoc基團后，氨基酸所提供的新的氨基可用諸如?；取⒙确禄虍惽杷徇M行衍生來產(chǎn)生多種熒光標(biāo)記的化合物。合適的異氰化物的非限制性的例子在方案Ⅵ中提供 方案Ⅵ對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說非常明顯，大量的含有反應(yīng)性半分子如氨基酸、酰基氯、氯仿和異氰酸的其他半分子(即R4、R5、…、Rn)可用來形成與DCSF結(jié)合的配體。與此類似，只要反應(yīng)條件適當(dāng)改變，方案Ⅳ的R2和R3基團所連接的化學(xué)片段可以被任何其他能使結(jié)合染料分子的鏈延長的化學(xué)片段取代。
方案Ⅱ的通用方法的最后一個實施方案示于方案Ⅶ 方案Ⅶ其中DTAF結(jié)合到一種Rink氨基酸樹脂上，并隨后用上面介紹的方法進行衍生。L1、R1和R2的定義如上。
除了上面的方法，熒光標(biāo)記配體文庫也可用通用的固相合成技術(shù)進行制備(Obrecht，D.和Villalgordo，J.M_“小分子量化合物文庫的固相支持的組合和平行合成”，Pergamon，1998；和Bunin，B.A_“組合物索引”，Academic Press，1998)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所需的化合物按文獻中介紹的方法在固相支持物上合成。在從固相支持物上切割下來前，固相支持物上的化合物用合適的染料處理來制備樹脂上的熒光標(biāo)記的配體。然后將配體從樹脂上切割下來，獲得熒光標(biāo)記的配體。
在一種方法中，配體通過固相支持的反應(yīng)性封閉物與不同的反應(yīng)性封閉物一步一步地反應(yīng)來以線性的方式合成。然后在切割前的最后一步加入染料，獲得方案Ⅷ所示的標(biāo)記配體。在此方案中，制備了熒光標(biāo)記的N-hydroxyquinzolinones。Quinzolinones是最常見的含有雜環(huán)的生物反應(yīng)性氮之一(見，Sinha，S.和Srivastava，M.“藥物研究進展”，1994，vol.43，143-238)。它們在人和動物中顯示廣譜的生物學(xué)和藥學(xué)活性。它們已被用作抗驚厥劑、抗細菌和抗糖尿病試劑。因此熒光標(biāo)記的quinzolinones對診斷應(yīng)用和藥物發(fā)現(xiàn)來說非常有用。 方案Ⅷ在另一種方法中，配體使用多組分濃縮反應(yīng)如Ugi濃縮以一種聚合的方法制備(Tempest，P.A.等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1996，vol.35，640-642)。使用這種方法，胺組分固定在固相支持物如Rink胺樹脂上，醛、Fmoc保護的氨基酸和異氰化物以過量的方式加入到在MeOH/DCM(1∶2 v/v)混合物中膨脹的樹脂中(方案Ⅸ)。通過組合使用不同的醛、酸和異氰化物，可以合成大量的配體。 方案Ⅸ5．2 生物樣品本發(fā)明提供對復(fù)雜的生物混合物或可從廣泛來源獲得的樣品進行“指紋”分析的方法。本發(fā)明的方法可用來鑒定在正?；虍惓?、健康或疾病、非轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化、非感染或感染的細胞和/或組織之間存在的特殊表型差異。本發(fā)明的方法還可用于鑒定或區(qū)分微生物、病毒、細菌、真菌或寄生蟲的種類。
本發(fā)明的方法可檢測所有類型的配體/受體相互作用，其中受體可以是蛋白質(zhì)、碳水化合物、核酸或任何具有一種能與探針或配體相互作用的形狀的分子。用于此處，“生物受體”、“受體”、“生物靶”、“靶”和“一種生物樣品的組分”用來包括在待測樣品如疾病或其他異常細胞和/或組織中諸如差異表達或差異修飾的任何生物分子、結(jié)合表面、結(jié)合位點等。任何一種這種受體都可用作診斷和/或發(fā)展?jié)撛谥委煼椒ǖ陌小?br> 因此，本發(fā)明的一個方面是分析病理過程的一種方法，所說的方法包括鑒定該病理過程有關(guān)的生物樣品中存在的受體或靶與一種配體或探針文庫之間的的結(jié)合相互作用的圖譜，其中該結(jié)合相互作用圖譜為該病理過程提供了一個獨特的指紋。
根據(jù)本發(fā)明，“受體”或“靶”是一種生物分子，在一種待測樣品中它被證明與配體或探針文庫有結(jié)合親和性或相互作用，這種結(jié)合親和性或相互作用在待測樣品和對照樣品中可以相同或不同。這種受體或靶的例子包括但不限于蛋白包括酶、抗原、抗體、脂、核酸包括DNA和RNA、碳水化合物包括凝集素、細胞表面蛋白或受體等等。
該方法中使用的生物樣品可以是任何生物分子來源的樣品，包括但不限于生物物質(zhì)例如體液如血漿、血清、尿液、腦脊髓液、羊水、唾液、粘液、組織樣品、細胞抽提物、體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)的產(chǎn)物(例如通過King等在美國專利5，654，150中提交的方法獲得)等。而且從含有細菌、酵母、真菌、病毒和原生動物等的液體獲得的抽提物也可以使用。在這些情況下，對病原體中的一種蛋白或其他受體顯示高親和性和特異性的配體可揭示新的靶，并可用來檢測其對該病原體的抑制影響。
能夠按照本發(fā)明的方法進行篩選的生物樣品可從廣泛不同的來源獲得。例如但不是為了限制，生物樣品或混合物可以從病人獲得，包括體液、血清、粘液包括口腔、直腸或小腸粘液、尿液、排泄物等。此外，生物樣品可包括組織樣品、尸檢組織、細胞樣品包括骨髓細胞、淋巴細胞、免疫細胞、從口腔、直腸或小腸粘膜獲得的粘膜細胞等。在另一個實施方案中，生物樣品或混合物可包括細胞裂解物或其部分、碳水化合物包括凝集素、蛋白包括糖蛋白、細胞表面受體、肽、核酸包括DNA或RNA等。在另一個實施方案中，生物樣品可以是或來自病毒、細菌、微生物或寄生蟲或含有這些生物樣品的液體，例如檢測供應(yīng)水中的微生物含量。
本發(fā)明的生物樣品可以獲自患有一種疾病、紊亂或感染了一種病毒、細菌或其他微生物的病理過程的病人。在另一個實施方案中，生物樣品可以通過將組織、培養(yǎng)的細胞、細胞抽提物暴露于一種毒素或致病試劑來制備，或者通過遺傳工程改造培養(yǎng)細胞的基因組，使之編碼已知與任何給定的病理過程或紊亂有關(guān)的突變、蛋白或肽。
用作臨床樣品來源的生物物質(zhì)收集物可從醫(yī)院或國立研究機構(gòu)獲得。
5．3 配體/受體相互作用的檢測試驗考慮到對于任何病理狀況，通常只能得到有限的臨床物質(zhì)，本發(fā)明的第三個要素－敏感的試驗系統(tǒng)就必須能檢測幾個微升樣品中發(fā)生的結(jié)合相互作用，此外，還必須能檢測低于最佳親和的結(jié)合相互作用。本發(fā)明的試驗系統(tǒng)消除了或大大降低了配體與樣品中存在的受體之間的非特異性結(jié)合。
因此，本發(fā)明的試驗的一個方面是提供一種檢測探針或配體與受體、靶或活性位點之間相互作用的手段。在一種這樣的實施方案中，均一的試驗被用來檢測一種生物樣品中存在的受體或靶。該試驗包括，在一個微滴定皿或其他孔型設(shè)備中用多樣性文庫與生物樣品作用，并檢測探針文庫的單個成員與系統(tǒng)組分的任何結(jié)合。探針文庫成員與樣品的結(jié)合圖譜提供了該樣品的分子指紋。在一個優(yōu)選的實施方案中，文庫成員與樣品組分的結(jié)合用熒光偏振進行檢測。
在另一個實施方案中，檢測生物樣品中存在的受體或靶的試驗包括，將探針和配體文庫連接到含有能被特殊催化劑切割的位點的結(jié)構(gòu)上，該結(jié)構(gòu)或支架的切割為檢測探針與受體之間的相互作用提供信號或手段。更具體地說，配體或探針文庫的成員連接在帶有能被特殊催化劑切割的位點的支架上，該位點的每一側(cè)都有一個標(biāo)記，從而提供一種配體/支架結(jié)構(gòu)，將配體/支架結(jié)構(gòu)與一種生物樣品作用，其中對樣品存在的一種受體具有親和性的配體就與該受體結(jié)合，并阻塞了支架的切割位點。當(dāng)配體/支架結(jié)構(gòu)與特殊催化劑作用時，不含一種被結(jié)合的受體的支架被切割，而完整的支架就被鑒定。
該試驗的一個優(yōu)選的實施方案進一步包括，將一種標(biāo)記如生物素連接到支架上與切割位點相同的一側(cè)，并將第二種標(biāo)記如地高辛連接到支架上相反的一側(cè)。將支架固定在一個表面，在加入催化劑后洗滌混合物以去除被切割的支架部分和包含第二種標(biāo)記的部分，這樣第二種標(biāo)記的存在就鑒定了完整的支架。
試驗中使用的支架可包含DNA、RNA、肽、肽類似物、寡糖或任何疏水性的或親水性的、合成或天然的聚合物包括嵌段共聚物。在一個優(yōu)選的實施方案中，支架是雙鏈DNA，結(jié)構(gòu)物包括一個第一條寡核苷酸、帶有一個與其相連的配體的一個互補的第二條寡核苷酸、和一個單一的限制酶切位點。在此實施方案中，特殊催化劑是對該限制位點特異的限制內(nèi)切酶。第一種標(biāo)記可以是諸如生物素，而配體結(jié)構(gòu)可以固化在鏈親和素或親和素包被的表面。地高辛是一種優(yōu)選的第二標(biāo)記，而抗地高辛－過氧化物酶被用來指示完整支架的存在。
檢測受體在一種生物樣品存在的另一個試驗包括，將配體文庫的成員連接在一種支架上，用一種支架特異的結(jié)合試劑和一種生物樣品處理該支架，并檢測配體與生物樣品中存在的受體之間的相互作用。該試驗中使用的支架可以包括DNA、RNA、肽、肽類似物、寡糖、或任何疏水性的或親水性的、合成的或天然的聚合物包括阻塞共聚物。在一個優(yōu)選的實施方案中，支架特異的結(jié)合試劑在配體與受體之間發(fā)生相互作用時不與該支架的區(qū)域結(jié)合。支架特異的結(jié)合試劑可以是一種藥物、肽、糖蛋白、蛋白、多糖、糖、或無機分子。在另一個實施方案中，支架包括一個標(biāo)記，該標(biāo)記在支架特異的結(jié)合試劑與支架結(jié)合時被阻塞，這樣標(biāo)記的進入就表明支架特異的結(jié)合試劑的不存在和配體/受體相互作用的存在。在一個優(yōu)選的實施方案中，支架包括雙鏈DNA，標(biāo)記是一種生物素化的核苷酸，在受體/配體相互作用發(fā)生時，它可用鏈親和素或親和素進行檢測。
在另一個實施方案中本發(fā)明的原則可用來對潛在的藥物進行毒理學(xué)篩選。目前，毒性或副作用的預(yù)測在發(fā)生在臨床試驗前的藥物發(fā)展早期非常困難，使用本發(fā)明的原則，毒性的存在或不存在可以在比目前可能的更早發(fā)展階段進行預(yù)測。
根據(jù)本發(fā)明的這個方面，用已知的毒性或非毒性化合物處理培養(yǎng)細胞或組織，然后從培養(yǎng)物中制備抽提物，用標(biāo)記化合物文庫進行檢測。這種用標(biāo)記化合物文庫檢測提供了一種“指紋”圖譜，該圖譜反映了細胞或組織對毒性或非毒性化合物的應(yīng)答。與毒性有關(guān)的指紋圖譜的任何改變都被記錄下來，并可進一步用統(tǒng)計學(xué)分析或使用人工智能途徑(神經(jīng)網(wǎng)絡(luò))分析來分類。接著，已按上面的方法建立了指紋圖譜的培養(yǎng)細胞或組織用具有未知毒性的待測化合物處理，從處理的培養(yǎng)物中制備抽提物，并用標(biāo)記化合物文庫進行檢測。然后將產(chǎn)生的細胞或組織應(yīng)答的指紋或圖譜與用已知毒性/非毒性化合物處理該細胞或組織產(chǎn)生的參考圖譜進行比較，來預(yù)測待測化合物的本質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，章節(jié)5．3．1至5．3．3介紹了可用于檢測探針對生物樣品的結(jié)合親和性差異從而產(chǎn)生結(jié)合親和性指紋或圖譜的試驗。
用本發(fā)明獲得的結(jié)果可幫助區(qū)分兩種樣品群體(例如正常和疾病)，它們可組成兩個類別。在第一個類別中，一種或兩種探針可用來區(qū)分群體，并且探針應(yīng)答在兩個群體間可很容易地區(qū)別(“Shiningpebbles”)。在第二個類別中，與兩個樣品群體結(jié)合的微小差別可使用大量的、與樣品群體的結(jié)合差異很小的探針來區(qū)分。這些探針的組合(一種診斷簇)對于為未知樣品中的可信差異提供統(tǒng)計學(xué)支持是必需的。為產(chǎn)生更有用的分析系統(tǒng)，需要大量的探針，因為全部結(jié)合圖譜不會受到因個別突變產(chǎn)生的波動的嚴重影響。在只使用一種或兩種探針的系統(tǒng)中，探針的個別突變會使診斷更困難。
分析大量探針與大量樣品的結(jié)合需要使用智能化的計算機算法。兩種類型的分析可用于數(shù)據(jù)。第一種分析的重點在于確定哪些探針可用于區(qū)分兩種樣品群體的成員。這種類型分析的算法可從統(tǒng)計學(xué)分析領(lǐng)域(區(qū)別功能分析)或從人工智能領(lǐng)域(受到監(jiān)督的、反饋增殖的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò))獲得?？梢允褂玫牡诙N類型的分析包括根據(jù)檢測結(jié)果將探針結(jié)合數(shù)據(jù)分類，然后在以相應(yīng)的探針為基礎(chǔ)的類別的歷史(例如醫(yī)學(xué))中查詢是否有任何的相似性。統(tǒng)計學(xué)分析(主要組分分析)和人工智能(非監(jiān)督的、kohonen神經(jīng)網(wǎng)絡(luò))中已有用于這些類型分析的算法。包含上述功能的數(shù)據(jù)分析程序或軟件包可從商業(yè)途徑獲得。例如，商業(yè)程序SPSS(SPSS，Inc_Chicago，Illinois)和SAS(SAS Institute，Inc_Cary，NC)能提供區(qū)別功能分析和主要組分分析。幾種軟件包如Neuroshell 2(Word Systems Group，Inc_Frederick，MD)或Stuttgart Neural Network Simulation(The University of Stuttgart，Stuttgart，Germany)能提供反饋增殖和Kohonen神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。
5．3．1 熒光偏振試驗在本發(fā)明中，熒光偏振試驗可用來鑒定配體與生物樣品中存在的受體之間的結(jié)合相互作用。
熒光偏振試驗被設(shè)計來測量熒光標(biāo)記的化合物與非標(biāo)記的生物分子的結(jié)合。熒光偏振試驗可以使用分子量高達10，000左右的熒光標(biāo)記的化合物來檢測其與生物分子的相互作用?？梢允褂玫臒晒鈽?biāo)記的化合物的類型包括但不限于小的有機分子、肽、小蛋白、核酸、脂類和多糖。熒光分子在用平偏振光激發(fā)時，只有在激發(fā)和發(fā)射之間的時間內(nèi)它們不旋轉(zhuǎn)時，才以一個固定的平面發(fā)射光。發(fā)射光去偏振的程度依賴于分子旋轉(zhuǎn)的數(shù)量，后者又依賴于分子的大小。在激發(fā)和發(fā)射熒光之間的時間內(nèi)，小分子比大分子旋轉(zhuǎn)的更多。該試驗的最佳條件為標(biāo)記化合物比與其結(jié)合的非標(biāo)記分子小得多時。未結(jié)合的小熒光標(biāo)記化合物旋轉(zhuǎn)迅速，并且發(fā)射光去偏振。生物分子與熒光分子的相互作用增加了熒光標(biāo)記化合物的有效大小，因而減少了該化合物的旋轉(zhuǎn)，后者導(dǎo)致發(fā)射光保持偏振。發(fā)射的偏振光的強度可通過在檢測器前面插入一個可移動的偏振濾鏡進行測量。強度在90°間隔的平面測量，并且多次指定水平和垂直強度。在一些儀器中，激發(fā)濾鏡是活動的而發(fā)射濾鏡是固定的。在某些其他的機器中，水平和垂直強度通過光學(xué)纖維同時測量。三個公司－Pan Vera、BMG Lab Technologies和LJLBiosystems出售研究級的熒光偏振設(shè)備，Abott提供臨床實驗室設(shè)備。熒光偏振值由下面的方程確定 熒光偏振值通常除以1000，并以微偏振單位(mP)表示。
在一種形式的這種試驗中，一種熒光分子如熒光素被連接到一個長度足以產(chǎn)生“推動效應(yīng)”的寡聚體上。然后將一個短接頭連接到熒光分子上，寡聚體上與熒光分子相對的末端連接到微滴定皿或其他適用于熒光偏振的孔型設(shè)備的壁上。然后用需要篩選的配體對短接頭的游離端進行修飾。每個孔中連接配體是已知的。然后將一種受體源加入到每個孔中并溫育。接著使用偏振光激發(fā)熒光分子，測量發(fā)射偏振光的偏振性。能與配體結(jié)合的受體將減少熒光分子的自由旋轉(zhuǎn)，從而能檢測到偏振性增加。在另一方面，如果沒有受體能結(jié)合配體，熒光分子就仍能自由旋轉(zhuǎn)，并且發(fā)射光將減少和不偏振。為得到任何結(jié)合受體對配體的親和性的近似值，從孔中除去抽提物，加入新鮮緩沖液，測量每個孔中發(fā)射的光的偏振值。具有較低親和性的受體將從受體上解離，發(fā)射光的偏振將會降低。重復(fù)這個過程就可鑒定具有最高親和性的配體/受體結(jié)合相互作用。
5．3．2 液閃親近試驗(SPA)
通常在SPA試驗中，受體與載有閃爍劑的玻珠結(jié)合，直接或競爭性地針對溶液中的配體進行篩選。但也可以反過來安排，將配體與玻珠結(jié)合，將受體置于溶液中。這種改變特別與組合化學(xué)適配，因為在多種合成方案中，文庫合成是在玻珠上進行的，它可接著按SPA試驗系統(tǒng)的需要用閃爍劑飽和。此外，在一個玻珠上可合成一個以上的配體。在這樣一種系統(tǒng)中，載有閃爍劑并包被有一種配體的玻珠浸入一種含有放射性標(biāo)記反應(yīng)劑的液相中。如果標(biāo)記的反應(yīng)劑對一種標(biāo)記的配體具有親和性，兩者就會結(jié)合，所產(chǎn)生的放射性標(biāo)記反應(yīng)劑與玻珠上的閃爍劑的接近就導(dǎo)致閃爍劑被激發(fā)，并發(fā)光。如果標(biāo)記的反應(yīng)劑對一種配體只有很少或沒有親和性，放射性標(biāo)記將不足以在閃爍劑附近積累來將放射衰變后的能量轉(zhuǎn)移。因為SPA不需要洗滌步驟，因此它能檢測相對低親和性的配體/受體結(jié)合相互作用。
5．3．3 DNA限制酶切位點阻斷試驗本系統(tǒng)的原理的基礎(chǔ)是存在或不存在對一種DNA結(jié)構(gòu)物的限制內(nèi)切酶活性，該DNA結(jié)構(gòu)物被合成來包括一個單一的限制酶切位點和一個配體-受體系統(tǒng)。當(dāng)該結(jié)構(gòu)物與一種生物混合物作用時，配體/受體相互作用將阻斷限制酶進入限制酶切位點，從而阻斷結(jié)構(gòu)物在該位點被水解。可以分離保持完整的結(jié)構(gòu)物，并鑒定配體/受體相互作用。
這里提供一種DNA限制酶切位點試驗系統(tǒng)的說明。將一條在5’端含有生物素在3’端含有地高辛的單鏈DNA寡核苷酸與一條互補寡核苷酸退火，使所產(chǎn)生的退火的雙鏈寡核苷酸在中間含有一個單一的限制酶切位點?；パa寡核苷酸鏈被修飾來含有一個接頭，該接頭帶有一個末端氨基基團。使氨基基團的位置(在本試驗中，氨基基團的位置在5’端的第5個A和第6個T之間)不干擾限制內(nèi)切酶對該雙鏈寡核苷酸的活性。所產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)物示于如下其中序列GGATCC(SEQ ID--)是一個限制酶切位點。
CCTAGG 氨基基團用多樣性化學(xué)文庫的配體進行修飾，形成如下所示的結(jié)構(gòu) 氨基基團的衍生可在單鏈寡聚體合成的過程中當(dāng)它仍與CPG玻珠連接時完成，然后可以用堿切割將寡聚物從玻珠上釋放出來，接著可將其與互補的生物素-地高辛寡聚物退火。連接配體的另一種方法是，可以在合成互補寡核苷酸時將衍生堿基整合進去。
在按照本領(lǐng)域熟知的方法與對該限制酶切位點特異的限制性內(nèi)切酶一起溫育時，衍生結(jié)構(gòu)物在該酶切位點水解，產(chǎn)生如下所示的兩個部分 水解混合物與鏈親和素或親和素包被的表面反應(yīng)將導(dǎo)致生物素標(biāo)記的部分被固定，而地高辛標(biāo)記的部分被洗去。固定的混合物與抗地高辛-過氧化物酶抗體反應(yīng)將產(chǎn)生陰性結(jié)果，因為地高辛標(biāo)記的部分被限制內(nèi)切酶水解和隨后的洗滌而從混合物中除去。
完整的配體衍生結(jié)構(gòu)物可作為探針檢測樣品中潛在的受體，當(dāng)它與一種臨床樣品混合時，配體將俘獲任何對如下結(jié)構(gòu)有高親和性的受體 溫育一段時間后，反應(yīng)混合物用一種合適的緩沖液稀釋，并用限制內(nèi)切酶處理，然后與一種鏈親和素包被的表面溫育，來固定生物素分子。當(dāng)存在一種對結(jié)構(gòu)物上的配體有高親和性的生物分子時，該分子將阻斷酶進入限制酶切位點，并阻止DNA支架的水解，從而導(dǎo)致完整的雙鏈寡核苷酸被固定。另一種情況是，當(dāng)一種生物分子不能與結(jié)構(gòu)物上的配體結(jié)合時，限制性內(nèi)切酶將不被阻斷，造成如上所示的DNA支架水解，并導(dǎo)致一個被剪短的結(jié)構(gòu)物被固定，釋放出地高辛標(biāo)記的部分。一種使用地高辛過氧化物酶抗體的標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)可用來檢測地高辛在鏈親和素表面的存在。陽性的試驗表明，限制性內(nèi)切酶被阻斷，而這表明一個分子已結(jié)合到接頭上。這樣，該方法可用來檢測任何配體與任何具有足夠親和性和大小來阻斷限制性內(nèi)切酶進入其限制酶切位點的受體之間的相互作用。
在上面介紹的方法的一種修改形式中，一個“縫隙”(一個堿基刪除)被插入到雙鏈序列的一條鏈中，并且一個配體按如下所示連接到該縫隙附近 用一種內(nèi)切酶如綠豆核酸酶或核酸酶S1處理該結(jié)構(gòu)物將導(dǎo)致該結(jié)構(gòu)物在縫隙處水解。水解混合物與固定的親和素或鏈親和素反應(yīng)并接著洗滌將除去結(jié)構(gòu)物中含有地高辛的部分。如上所述，將該結(jié)構(gòu)物與對該配體具有高親和性的受體在加入核酸酶前一起溫育將防止該結(jié)構(gòu)物在縫隙處水解，并且在檢測地高辛存在的試驗中將獲得強陽性應(yīng)答。
在DNA限制酶切位點試驗的進一步的變化形式中，DNA支架可被一種由肽、肽類似物或任何在其中間有一個能被特殊的酶或其他機制切割的鍵、并且切割可被在該鍵附近發(fā)生的配體/受體相互作用阻斷的聚合物組成的骨架所取代。例如，可以使用一種商業(yè)化的聚(甘氨酸)或聚(賴氨酸)骨架，在其中間使用肽合成的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)已插入了一個含有苯丙氨酸殘基的鏈和一個附近的配體。酶如胰凝乳蛋白酶A4(EC3.4.21.1)可接著以類似上面介紹的核酸酶的方式進行使用。此外，可通過在合成結(jié)構(gòu)物上與生物素相對的部分時使用放射活性的堿基或配體并將鏈親和素連接到載有閃爍劑的玻珠上，來將該試驗修改成一種SPA試驗。
盡管這里介紹的任何試驗都適合于在本發(fā)明中使用，此系統(tǒng)能提供下面的優(yōu)點，例如，它不需要放射活性，盡管放射標(biāo)記的核苷酸可置于限制酶切位點的下游來將該試驗轉(zhuǎn)變成為一種SPA形式；此系統(tǒng)可以通過使用PCR方法作為檢測系統(tǒng)而變得超級敏感；整個試驗可在鏈親和素包被的微滴定皿中進行；只要不改變限制酶切位點，核酸類似物可用來保護DNA骨架不受樣品中的核酸酶活性的影響。
在本發(fā)明中，可將含有特殊反應(yīng)基團的膜(可從諸如PallCorporation，East Hills，NY獲得)置于一個孔型裝置如96孔點印跡裝置中。然后可在該設(shè)施中合成一個化合物文庫，其中在文庫合成中加入的一種特殊功能性基團與膜上的特殊反應(yīng)基團偶聯(lián)。例如，如果正在合成的文庫化合物含有一個氨基基團，該基團將通過一個酰胺鍵偶聯(lián)。膜上任何過量的基團將用一種合適的封閉試劑封閉。然后該配體結(jié)合的膜就可與事先已被衍生如用生物素或放射活性衍生的生物樣品反應(yīng)。接著可用一種合適的試驗來檢測配體/受體相互作用。
5．3．4 平衡干擾試驗雖然上面介紹的DNA限制酶切位點試驗也可被認為是一種平衡干擾試驗，但優(yōu)選的方法是監(jiān)測配體/分子相互作用對DNA結(jié)合蛋白與其識別序列之間的平衡的影響。例如，在篩選能與位于UL9識別序列下游的所選DNA待測序列結(jié)合的化合物時，可以使用病毒DNA結(jié)合蛋白UL9。該試驗的基礎(chǔ)是待測序列干擾結(jié)合蛋白不與其識別序列結(jié)合的平衡的能力。該試驗在美國專利No.5，306，619中介紹，該專利在此全文引入作為參考。
根據(jù)本發(fā)明的原理，位于UL9識別位點下游的待測序列可用作配體文庫的骨架，而不是像美國專利No.5，306，619一樣用作DNA結(jié)合蛋白的靶。一種支架結(jié)構(gòu)物可按如下組成，它含有UL9識別序列，其中一個特殊的核苷酸堿基已用諸如一種標(biāo)記物如生物素標(biāo)記，并含有一種配體衍生的寡核苷酸，其末端為地高辛。已知識別序列上生物素的存在不干擾UL9與識別序列的結(jié)合，并且當(dāng)UL9與生物素化的序列結(jié)合時，生物素分子被阻斷而不能被諸如親和素或鏈親和素固定。UL9可以與該結(jié)構(gòu)物反應(yīng)并溫育至UL9與生物素化的序列之間建立一種平衡。然后可將一種生物樣品引入反應(yīng)混合物，當(dāng)樣品中存在任何對支架上的配體有親和性的受體時，待測序列將與配體結(jié)合，干擾結(jié)合蛋白與生物素化的序列之間的平衡，從而使能夠與親和素或鏈親和素結(jié)合的游離生物素的數(shù)量改變。
在該試驗方法的一種變化形式中，在與化合物連接前，可以與篩選序列一起合成一種待測序列而不是第二個DNA序列。任何能允許配體連接的支架都可以使用。此外，配體可直接共價連接到篩選序列上而不需要另外的接頭或支架。
實施例為更全面地理解這里介紹的本發(fā)明，列出了下面的實施例。應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例僅僅是為了說明，而不是用來以任何方法限制本發(fā)明。
實施例1液閃親近試驗是檢測配體與受體之間相互作用的一種敏感方法下面的實施例證明了液閃親近試驗(“SPA”)的敏感性。本實施例使用SPA評價了2，5-二苯基惡唑(PPO)-飽和的對氨基苯-β-D-硫代半乳糖苷瓊脂糖珠與β-半乳糖苷酶之間的相互作用。
用β-半乳糖苷酶表達載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在37℃在補加或未補加H235SO4(0.1mCi/mL培養(yǎng)基)的M9CA培養(yǎng)基中生長。用1mM IPTG處理大腸桿菌培養(yǎng)物3小時誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶的表達。接著，離心沉淀大腸桿菌培養(yǎng)物，重懸于裂解緩沖液中，通過五輪凍融循環(huán)進行裂解。離心除去細胞殘渣，用硫酸銨沉淀從上清中分離β-半乳糖苷酶，接著用親和色譜產(chǎn)生80％的純化產(chǎn)物。
評價未標(biāo)記的或標(biāo)記的β-半乳糖苷酶與2，5-二苯基惡唑(PPO)-飽和的p-氨基苯-β-D-硫代半乳糖苷瓊脂糖珠(按Bertoglio-Matte在美國專利4，568，649中介紹的方法制備)之間的相互作用。PPO-飽和的p-氨基苯-β-D-硫代半乳糖苷瓊脂糖珠在含有10％奶粉的PBS(8.1mmNa2HPO4、1.5mM KH2PO4、137mM NaCl、2.7mM KCl、0.5mM MgCl2、0.9mM CaCl2)溶液中溫育過夜，封閉任何產(chǎn)生非特異應(yīng)答的位點。另外，可以用試劑諸如白蛋白、去污劑或甚至來自對照溶液的抽提物來封閉珠。接著，將20μL PPO-飽和的p-氨基苯-β-D-硫代半乳糖苷瓊脂糖珠與200μL的35S-β-半乳糖苷酶(在液閃混合物中的計數(shù)為2.1×105cpm)以及200μL的PBS或200μL的1mg/mL未標(biāo)記的β-半乳糖苷酶混合。在其他實驗中，相同cpm(6.5-7.7×105cpm)的35S標(biāo)記的大腸桿菌抽提物或H235SO4與20μLPPO-飽和的p-氨基苯-β-D-硫代半乳糖苷瓊脂糖珠混合。溶液混合10分鐘，然后轉(zhuǎn)入含有1mL 0.2％酪素的PBS的液閃小瓶。珠與β-半乳糖苷酶或H235SO4之間的相互作用通過用Beckman LS 6500液閃計數(shù)器評估放射活性來分析。
在含有35S-β-半乳糖苷酶和PPO-飽和的p-氨基苯-β-D-硫代半乳糖苷瓊脂糖珠的樣品中，檢測到了每分鐘487+/-52的計數(shù)(cpm；n=3)。相反，在同時含有標(biāo)記和未標(biāo)記的β-半乳糖苷酶與PPO-飽和的p-氨基苯-β-D-硫代半乳糖苷瓊脂糖珠的樣品中，檢測到了341+／-16 cpm(n=3)。這些結(jié)果證明，未標(biāo)記的β-半乳糖苷酶能競爭性地取代與珠結(jié)合的、標(biāo)記的β-半乳糖苷酶。而且，這些結(jié)果表明，SPA能用于檢測mM的相互作用。游離的氨基苯硫代半乳糖苷被測定具有僅為1.9 mM的Ki。此外，該結(jié)果表明，SPA能用于檢測相互之間具有較低親和性的受體和配體之間的相互作用。在此實施例中，使用PPO，珠對β-半乳糖苷酶的親和性降低了大約2.3倍。
在含有6.5-7.7×105cpm的35S標(biāo)記的大腸桿菌抽提物和PPO-飽和的p-氨基苯-β-D-硫代半乳糖苷瓊脂糖珠的樣品中，檢測到了大約3000 cpm。相反，在含有7.7×105cpm的H235SO4和PPO-飽和的p-氨基苯-β-D-硫代半乳糖苷瓊脂糖珠的樣品中，只檢測到了約670cpm。這些結(jié)果表明由珠與H235SO4之間的相互作用產(chǎn)生的背景非常低。因此，在含有35S標(biāo)記的大腸桿菌抽提物的樣品中檢測到的信號主要是由珠與標(biāo)記的大腸桿菌蛋白之間的相互作用產(chǎn)生的。在珠與35S標(biāo)記的大腸桿菌抽提物之間相互作用中檢測到的高cpm說明，沒有純化步驟，背景放射活性將掩蓋β-半乳糖苷酶與SPA珠的任何特異性吸附。
本實施例證明，液閃親近試驗(SPA)是檢測mM水平的配體與受體之間相互作用的一種敏感試驗。而且，SPA可用于檢測相互之間具有較低親和性的受體與配體之間的相互作用。
實施例2DNA阻斷試驗是評估受體和配體之間相互作用的一種敏感方法下面的實施例證明了DNA阻斷試驗評估受體與配體之間的相互作用的敏感性。
下面顯示的兩種寡聚體由Clontech，Palo Alto，CA合成(SEQ. ID_) Ⅰ5 ＇ BTT-TTT-TTT-TTT-TAT-ATA-GGA-TCC-TAT-ATA-TTT-TTT-TTT-TTT-TTD-3 ＇B=生物素 D=地高辛(SEQ. ID_)Ⅱ5 ＇AAA-AA-AAA-AAA-AAT-ATA-TAG-GAT-CCA-AAT-TAA-AAA-AAA-AAA-A-3 ＇設(shè)計寡聚體，使其在退火時形成一個位于中間的限制酶切位點。使用10∶1比例的Ⅱ∶Ⅰ在退火緩沖液(10mMTris-Cl[pH7.8]、0.1 M NaCl和1.0mM EDTA)中將混合物在65℃溫育1小時，接著在57℃溫育3小時，使寡聚體退火，然后貯存于-20℃。將兩個重復(fù)的32.8pmol的退火寡聚體樣品在退火緩沖液中稀釋，將每個梯度的重復(fù)稀釋物中的一個按照說明(New England BioLabs，Beverly，MA)用40單位的限制內(nèi)切酶在37℃水解過夜。對剩下的稀釋物進行相同的處理，除了從溫育混合物中略去限制內(nèi)切酶。過夜溫育后，將樣品加入至鏈親和素包被的微滴定皿中，使用HRP衍生的抗地高辛抗體和ABTS底物按照說明(Boheringer Mannheim GmbH，Mannheim，GER)進行分析。然后在405nm處讀出樣品的吸收值。
用酶處理的樣品相對于背景(溫育混合物中沒有寡聚體)不顯示吸收，而未用酶處理的樣品即使在低至3pmol的寡聚體濃度時也能顯示可清楚檢測到的吸收。這樣，該系統(tǒng)能檢測pmol水平的底物，而基本上沒有背景。
實施例3限制內(nèi)切酶切割DNA支架的能力受到其他試劑與支架的分子相互作用的影響本實施例說明了距限制酶切位點一定距離的分子相互作用能影響限制內(nèi)切酶活性。
為將DNA寡聚體固定在96孔微滴定板的孔壁上，將65.5pmol的退火DNA樣品加入到鏈親和素包被的孔中，其中該退火DNA在一個末端用生物素標(biāo)記，在另一端用地高辛標(biāo)記，并且含有一個位于中間的限制酶切位點。還建立一個沒有DNA的對照孔(表1，第1條)。然后用接合緩沖液中的抗地高辛-過氧化物酶(抗-dig-POD)抗體(Boerhinger Mannheim)處理4個孔。三個孔用沒有抗體的接合緩沖液處理。溫育1小時后，洗滌孔，三個孔用120單位的限制內(nèi)切酶在37℃處理1小時(表1，第3、5和7條)。其他孔用不含限制內(nèi)切酶的相同溶液處理。然后再次洗滌孔，用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA檢測完整(未水解的)寡聚體。樣品中完全的、退火DNA的數(shù)量用mOD/mm的Vmax表示。
本試驗的結(jié)果編輯在下表1中。在沒有DNA時，反應(yīng)的背景Vmax值是0.89。在沒有限制酶和沒有預(yù)處理時(表1，條帶2)，完全的、未水解的退火DNA的Vmax值是30.96。相反，當(dāng)未處理的、固定DNA用限制內(nèi)切酶處理時，Vmax值是2.52(表1，條帶3)。Vmax的降低表明，限制內(nèi)切酶水解了固定的寡聚體。
用抗dig-POD預(yù)處理固定的寡聚體不影響完整寡聚體試驗(表1，條帶4、6和8)，因為可以分別獲得34.96、45.33和53.71的值。但是，用抗-dig-POD預(yù)處理能夠影響限制內(nèi)切酶活性(表1，條帶5和7)，因為在加入限制內(nèi)切酶前預(yù)處理寡聚體時，寡聚體的水解降低。隨后用限制內(nèi)切酶處理的的預(yù)處理樣品(表1，條帶5和7)分別具有15.17和14.64的Vmax值，而沒有經(jīng)過預(yù)處理但進行限制酶切的寡聚體只有2.52的Vmax值。這樣，在加入限制內(nèi)切酶前用抗-dig-POD預(yù)處理寡聚體能使限制內(nèi)切酶的活性降低17倍，這說明抗-dig-POD與地高辛標(biāo)記的DNA寡聚體之間的相互作用能影響限制內(nèi)切酶切割寡聚體的活性。這些結(jié)果證明，在反應(yīng)混合物中加入能與寡聚體相互作用的試劑能影響限制內(nèi)切酶切割寡聚體的能力。
表1 本實施例證明，一種能與DNA骨架上連接的配體相互作用的“受體”能強烈地影響DNA骨架的限制性酶切。
實施例4-8證明了熒光偏振試驗的敏感性和生物樣品對不同探針的差異結(jié)合圖譜。這些實施例中使用的分子探針列于表Ⅱ。
實施例4熒光偏振試驗是一種檢測探針與生物樣品之間相互作用的敏感方法下面的實施例證明，各種探針與生物樣品的組分結(jié)合的能力隨該樣品中組分的濃度而改變。而且，本實施例還證明了探針與生物樣品中的組分的差異結(jié)合。
在PBS(pH 7.4)中制備混合的人血清(Sigma Lot#116H4661)的系列稀釋物，使樣品中的總蛋白的濃度為65.6mg/mL、13.1mg/mL、2.6mg/mL、0.52mg/mL和0.1mg/mL。然后在96孔微滴定板的A1-A6孔中加入150μL PBS和1.0μL含有濃度為1.0×10-3mg/mL的探針#5(表Ⅱ)的DMSO溶液。接著，在A1、A2、A3、A4和A5孔中分別加入10μL含有65.6mg/mL、13.1mg/mL、2.6mg/mL、0.52mg/mL和0.1mg/mL總蛋白的人血清溶液樣品?？譇6中不加入人血清溶液。按上述方法制備B1-B6孔作為A1-A6孔中檢測樣品的一個重復(fù)。
與上面的介紹類似，在C1-C6孔中加入150μLPBS和1.0μL含有濃度為1.0×10-3mg/mL的探針#18(表Ⅱ)的DMSO溶液。然后在C1、C2、C3、C4和C5孔中分別加入10μL含有65.6mg/mL、13.1mg/mL、2.6mg/mL、0.52mg/mL和0.1mg/mL總蛋白的人血清溶液樣品?？證6中不加入人血清溶液。按上述方法制備D1-D6孔作為C1-C6孔中檢測樣品的一個重復(fù)。
按上面的介紹對探針#20-24(表Ⅱ)進行類似的處理。然后在Fluorolite FPM-2熒光偏振微滴定系統(tǒng)中對96孔微滴定板進行讀數(shù)，所獲得的熒光偏振(mP)數(shù)據(jù)用實驗重復(fù)求取平均值，并對總蛋白作圖。結(jié)果如圖1所示，它證明不同的探針與人血清組分的結(jié)合各不相同。而且，人血清中存在的組分的濃度能影響mP值(探針結(jié)合的測量)。
實施例5探針#25對混合的人血清和對鏈親和素-HRP接合物的劑量應(yīng)答本實施例證明，探針可用來區(qū)別生物樣品。而且，本實施例還證明，探針與生物樣品的組分結(jié)合的能力依該組分濃度的不同而不同。為確定在存在血清蛋白時能否觀察到與一種探針的強結(jié)合相互作用，我們測定了探針#25(表Ⅱ)對混合人血清和對鏈親和素-HRP接合物的劑量應(yīng)答。在PBS(pH=7.4)中制備混合的人血清(Sigma Lot#116H4661)的系列稀釋物，使樣品中的總蛋白的濃度為65.6mg/mL、13.1mg/mL、2.6mg/mL、0.52mg/mL和0.1mg/mL。然后在96孔微滴定板的A1-A6孔中加入150μLPBS和1.0μL含有濃度為1.0×10-3mg/mL的探針#25的DMSO溶液。接著，在A1、A2、A3、A4和A5孔中分別加入10μL含有65.6mg/mL、13.1mg/mL、2.6mg/mL、0.52mg/mL和0.1mg/mL總蛋白的人血清溶液樣品。A6孔中不加入人血清溶液。按上述方法制備B1-B6和C1-C6孔作為A1-A6孔中檢測樣品的重復(fù)。
在PBS(pH=7.4)中制備鏈親和素-HRP接合物(Sigma 59420)的系列稀釋物，使樣品中的總蛋白的濃度為1.0mg/mL、0.1mg/mL、0.01mg/mL、0.001mg/mL、0.0001mg/mL、和0.00001mg/mL。然后在另一塊96孔微滴定板的A1-A7孔中加入150μL PBS和1.0μL含有濃度為1.0×10-3mg/mL的探針#25的DMSO溶液。接著，在A1-A6孔中加入10μL含有1.0mg/mL、0.1mg/mL、0.01mg/mL、0.001mg/mL、0.0001mg/mL、和0.00001mg/mL總蛋白的人血清溶液樣品?？譇7中不加入人血清溶液。。按上述方法制備B1-B7孔作為A1-A7孔中檢測樣品的一個重復(fù)。然后用Fluorolite FPM-2熒光偏振微滴定系統(tǒng)測定或測量兩塊96孔微滴定板中樣品的熒光偏振，所獲得的熒光偏振(mP)數(shù)據(jù)用實驗重復(fù)求取平均值，并對總蛋白的log作圖。
數(shù)據(jù)如圖2所示，這些數(shù)據(jù)說明，探針#25對血清蛋白的結(jié)合非常弱，在本實驗的條件下，觀察到探針的結(jié)合需要大約100μg的血清蛋白。相反，探針#25與鏈親和素-HRP接合物的結(jié)合在存在1.0μg的鏈親和素-HRP接合物時就能完成。因此，探針#25對鏈親和素-HRP比對人血清具有更高的親和性。
實施例6在混合的人和牛血清中使用探針#25檢測鏈親和素-HRP接合物下面的實施例證明，在混合的生物樣品中，對探針具有高親和性的組分能在低濃度時被檢測出來。
為確定少量的強結(jié)合蛋白(鏈親和素-HRP接合物)能否在存在血清蛋白時被檢測出來，在混合的人血清中加入鏈親和素-HRP接合物，并檢測對探針#25(表Ⅱ)的應(yīng)答。首先，在一塊96孔微滴定板的A1-A3孔中加入150μLPBS和10μL含有濃度為1.0×10-3mg/mL的探針#25的DMSO溶液。然后，在所有三個孔中加入10μL濃度為13.1mg/mL總蛋白的人血清溶液樣品(通過在PBS中按1∶5稀釋Sigma混合血清Lot#116H4661來獲得)。這樣，每個孔中人血清的總量為131μg。這三個孔代表測定131μg血清蛋白與探針#25結(jié)合的三個重復(fù)。
然后，在96孔微滴定板的B1-B3孔中加入150μL PBS和1.0μg含有濃度為1.0×10-3mg/mL的探針#25的DMSO溶液。在孔B1-B3中加入10μL濃度為13.1mg/mL總蛋白的人血清溶液樣品(通過在PBS中按1∶5稀釋Sigma混合血清Lot#116H4661來獲得)和10μL含有0.1mg/mL總蛋白的鏈親和素-HRP接合物溶液樣品。每個孔中人血清蛋白的總量為131μg，而鏈親和素-HRP接合物的總量是1.0μg。孔B1-B3代表在存在131μg血清蛋白時測定探針#25與1.0μg鏈親和素-HRP接合物蛋白結(jié)合的三個重復(fù)。
微滴定板中樣品的熒光偏振在Fluorolie FPM-2熒光偏振微滴定系統(tǒng)中讀取。所獲得的偏振(mP)數(shù)據(jù)用三次測定取平均值，設(shè)計一種條圖來顯示在存在鏈親和素-HRP接合物和血清蛋白時與只有血清蛋白時偏振(mP)發(fā)生的改變。結(jié)果如圖3所示，它表明探針#25與1.0μg鏈親和素-HRP接合物蛋白的結(jié)合在存在131μg血清蛋白時很容易檢測。這些結(jié)果表明，熒光偏振試驗是檢測探針與以μg/mL濃度存在的樣品成分之間的結(jié)合的敏感方法。
實施例7 使用探針#1-25為帶有或無鏈親和素-HRP接合物的血清構(gòu)建“指紋”下面的實施例證明，少量強結(jié)合組分的存在能改變生物樣品的指紋。
首先，在96孔微滴定板的A1-A12孔中加入150μLPBS和1.0μL的探針#1-12的DMSO溶液，每種探針的濃度均為1.0×10-3mg/mL。這使得孔A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11和A12分別含有1.0μL的探針#1、#2、#3、#4、#5、#6、#7、#8、#9、#10、#11和#12(表Ⅱ)的1.0×10-3mg/mL溶液以及150μL PBS。B1-B12孔用相同方式進行處理，作為探針1-12的重復(fù)試驗。
其次，在同一96孔微滴定板的C1-C12孔中加入150μLPBS和1.0μL的探針#13-24的DMSO溶液，每種探針的濃度均為1.0×10-3mg/mL。這使得孔C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11和C12分別含有1.0μL的探針#13、#14、#15、#16、#17、#18、#19、#20、#21、#22、#23和#24(表Ⅱ)的1.0×10-3mg/mL溶液以及150μL PBS。D1-D12孔用相同方式進行處理，作為探針13-24的重復(fù)試驗。然后，在孔E1和E2中加入150μLPBS和1.0μL探針#25的1.0×10-3mg/mL DMSO溶液。接著，在96孔板上的A1-A12、B1-B12、C1-C12、D1-D12和E1-E2孔中加入10μL按1∶10稀釋的混合人血清(Sigma Lot#116H4661)。10μL血清中的總蛋白含量是65.6μg。
然后，在Fluorolite FPM-2熒光偏振微滴定系統(tǒng)中讀取96孔板上每個孔的熒光偏振，所獲得的偏振(mP)值在條圖上作圖，用來顯示該血清樣品的“指紋”。結(jié)果示于圖4。
然后，在每個孔中加入10μL含有0.1mg/mL總蛋白的鏈親和素-HRP接合物溶液。加到每個孔中的總鏈親和素-HRP接合物蛋白為1.0μg。然后，板在Fluorolite FPM-2熒光偏振微滴定系統(tǒng)中讀數(shù)，所獲得的偏振(mP)值在示于圖5的條圖上作圖。該圖描述了加有鏈親和素-HRP接合物的血清樣品的“指紋”。該結(jié)果表明，在血清樣品中可以檢測到少量鏈親和素-HRP接合物蛋白的存在，而且這種蛋白能改變觀察到的血清指紋。這些結(jié)果說明，可以使用熒光偏振試驗篩選能區(qū)分生物樣品中正常和異常組分的探針。
實施例8-9證明，熒光偏振試驗可用來篩選能將復(fù)雜混合物彼此分開的探針文庫。
實施例8 能與人和牛血清差異結(jié)合的探針的鑒定使用熒光偏振測定表Ⅱ所列的4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-丙酸(BO)標(biāo)記的化合物1-19(分子探針，Eugene，OR)與胎牛血清或人血清之間的相互作用。人血清(Sigma Lot#116H4661)含有65.6mg/mL總蛋白，而胎牛血清(Sigma Lot#96H4615)含有47.3mg/mL總蛋白。為減小總蛋白濃度的影響，本實驗使用10μL的胎牛血清和47.3/65.6×10μL=7.2μL的人血清。
在96孔微滴定板的A1-A10、B1-B10、C1-C9、D1-D9、E1-E10、F1-F10、G1-G9和H1-H9孔中加入150μL的PBS。在孔A1-A10、B1-B10、C1-C9、D1-D9、E1-E10、F1-F10中加入1.0μL化合物1-10的二甲基亞砜(DMSO)溶液，每種化合物的濃度為1.0×10-3mg/mL。在這種方式中，孔A1、B1、E1和F1每個都含有150μL的PBS和1.0μL1.0×10-3mg/mL的化合物#1的DMSO溶液。與此類似，孔A2、B2、E2和F2都含有150μL的PBS和1.0μL1.0×10-3mg/mL的化合物#2的DMSO溶液，孔3-10也是如此。在孔C1-C9、D1-D9、G1-G9和H1-H9中，加入1.0μL化合物11-19的二甲基亞砜(DMSO)溶液，每種化合物的濃度為1.0×10-3mg/mL。在這種方式中，孔C1、D1、G1和H1每個都含有15μL的PBS和1.0μL1.0×10-3mg/mL的PBS和1.0μL1.0×10-3mg/mL的化合物#12的DMSO溶液。孔13-19也是如此。然后將此板在Fluorolite FPM-2熒光偏振微滴定系統(tǒng)中用485nm的激發(fā)濾鏡和530nm的發(fā)射濾鏡進行讀數(shù)。所獲得的偏振(mP)和強度數(shù)據(jù)代表空白讀數(shù)。
然后，在含有PBS和如上所述的探針的孔A1-A10、B1-B10、C1-C9、D1-D9中加入7.2μL人血清(Sigma Lot#116H4661)。這樣，A1-A10和B1-B10系列是化合物1-10在人血清中的重復(fù)試驗，系列C1-C9和D1-D9是化合物11-19在人血清中的重復(fù)試驗。與此類似，在含有PBS和如上所述的探針的孔E1-E10、F1-F10、G1-G9和H1-H9中加入10μL的胎牛血清(Sigma Lot#96H4615)。這樣，這樣，E1-E10和F1-F10系列是化合物1-10在胎牛血清中的重復(fù)試驗，系列G1-G9和H1-H9是化合物11-19在胎牛血清中的重復(fù)試驗。然后按上面的介紹在Fluorolite FPM-2熒光偏振微滴定系統(tǒng)中讀取數(shù)據(jù)。產(chǎn)生的偏振(mP)和強度數(shù)據(jù)示于圖6。對每種探針的mP值作條圖。前兩個條代表每種探針在人血清中重復(fù)試驗的值，后兩個條代表每種探針在胎牛血清中重復(fù)試驗的值。該mP數(shù)據(jù)代表從標(biāo)記發(fā)射偏振的程度。較高的讀數(shù)表明，標(biāo)記化合物與一個大分子結(jié)合，而較低的讀數(shù)表示標(biāo)記化合物結(jié)合的程度較低。我們可以看出，化合物#2和#18在人血清中與一種大分子結(jié)合的程度比在胎牛血清中高。
實施例9 能與來自不同哺乳動物種類的生物樣品差異結(jié)合的探針的鑒定下面的實施例證明了生物樣品可被彼此區(qū)分，包括區(qū)分種類與種類、疾病與非疾病，這種區(qū)分的基礎(chǔ)是當(dāng)它們用探針文庫篩選時產(chǎn)生的差異結(jié)合圖譜。
在96孔微滴定板中將1μL表3中列出的每種樣品與熒光標(biāo)記的分子組合，并使用Fluorolite FPM-2熒光偏振微滴定系統(tǒng)測量熒光偏振。在熒光偏振試驗中使用下面的熒光標(biāo)記探針終濃度約為0.18nM的BODIPY標(biāo)記的肌-肌醇-1-磷酸(探針18，Molecular Probes)、終濃度為10.5nM的熒光素標(biāo)記的phenytoin(探針70；Sigma)、終濃度約為0.096μg/mL的熒光素標(biāo)記的探針129(Sepracor)、終濃度約為0.078μg/mL的熒光素標(biāo)記的探針135(Sepracor)、終濃度約為0.09μg/mL的熒光素標(biāo)記的探針147(Sepracor)。測定每種探針與血漿或細胞抽提物之間相互作用的熒光偏振值。
表3試驗中使用的生物樣品名單 以熒光偏振值為基礎(chǔ)，BODIPY標(biāo)記的肌-肌醇-1-磷酸(探針18)證明了與來自不同種類的樣品的差異結(jié)合(圖7)。例如，使用探針18，混合的人血漿的熒光偏振值約比混合的牛血清或混合的胎牛血清的熒光偏振值高3倍。但是，在來自相同種類的樣品的熒光偏振值中幾乎沒有觀察到差異。例如，使用探針18，在混合的WKY大鼠血漿和混合的SHR大鼠血漿中沒有檢測到明顯的熒光偏振值的差異。這些結(jié)果表明，探針如肌-肌醇-1-磷酸可以用來獲得有關(guān)來自不同種類的信息。
熒光素化的phenytoin(探針70)的熒光偏振值表明，它也是一種能用來區(qū)分來自不同種類的血漿的探針(圖8)。例如，用探針70獲得的混合人血漿的熒光偏振值比其他樣品要高得多。此外，在混合的牛血清和混合的胎牛血清之間也檢測到熒光偏振值的明顯差異。這些結(jié)果說明，探針如熒光素化的phenytoin不僅可用于區(qū)分來自不同種類的樣品，還可用來區(qū)分來自同一種類但不同發(fā)育時期的樣品。
具有類似結(jié)構(gòu)的探針也可用于區(qū)分來自不同種類的樣品。探針147、129和135在結(jié)構(gòu)上相似(圖9A、10A和11A)，都使用固相化學(xué)舍成并在一個熒光素骨架上構(gòu)建，它們能為來自列于表3的6種靈長類動物的血液樣品的分類提供足夠的信息。探針147和129證明，與靈長類動物(人類和非人類)血漿溫育后的熒光偏振值比與非靈長類動物血漿(圖9B和10B)溫育后高。但是，探針129在與來自猴的血漿溫育后比與來自人的血漿溫育后顯示的偏振信號高(圖10B)。探針135與非洲綠猴血漿樣品溫育后觀察到的熒光偏振值比與來自其他猴或人的血漿溫育后高(圖11B)。因此，可對探針129、135和147與靈長類動物血漿樣品的差異結(jié)合進行編輯，從而可以使用這些信息來準(zhǔn)確地對彼此的樣品進行區(qū)別。
實施例10 能區(qū)分金黃色葡萄球菌和二甲氧基苯基青霉素抗性的金黃色葡萄球菌的探針的鑒定下面的試驗用來鑒定能用于區(qū)分金黃色葡萄球菌(S.aureus)、二甲氧基苯基青霉素抗性的金黃色葡萄球菌(MRSA)和大腸桿菌(E.coli)的探針。
將金黃色葡萄球菌(SA)、二甲氧基苯基青霉素抗性的金黃色葡萄球菌(MRS)和大腸桿菌(E.coli)接種于25ml或35ml體積的心腦浸出液培養(yǎng)基(BHI，Difco)中。培養(yǎng)物在37℃搖床上溫育至大腸桿菌、SA和MRSA的OD660nm值分別達到0.344、0.411和0.367。上述培養(yǎng)物OD660nm值的任何差異在表中說明。在本實驗中，在黑色的96孔熒光偏振微滴定板中將5ul培養(yǎng)樣品稀釋在100ul磷酸緩沖鹽(PBS)+0.1％牛γ球蛋白BGG中。接著，在細胞懸液中加入5ul稀釋的、終濃度約為10nm的、來自文庫的熒光標(biāo)記探針，將板在37℃溫育30分鐘或指示的溫育時間。溫育之后，使用Fluorolite FPM-2熒光偏振微滴定系統(tǒng)測定每個樣品中的熒光偏振數(shù)量。對每種探針進行重復(fù)的熒光偏振測定。
熒光偏振實驗中使用的熒光標(biāo)記探針從外面購買或在Sepracor合成。表4列出了探針名稱、使用的熒光標(biāo)記、探針來源和探針號。
表4 熒光標(biāo)記探針方庫 根據(jù)熒光偏振值，有四個探針(11A、10B、6D和10E)顯示與葡萄球菌菌株的結(jié)合對比與BHI培養(yǎng)基(未接種)或大腸桿菌樣品的結(jié)合有差異(表5)。使用探針10B、10E和6D重復(fù)熒光偏振試驗以確定它們能夠用來區(qū)分SA與MRSA。探針10B和10E不能顯示與金黃色葡萄球菌(SA)和二甲氧基苯基青霉素抗性的金黃色葡萄球菌(MRS)的差異結(jié)合。使用探針10B或10E，在SA、MRSA、大腸桿菌和未接種的BHI培養(yǎng)基樣品中沒有獲得明顯的熒光偏振值差異(表6)。因此，探針10B和10E不能用來區(qū)分SA與MRSA、大腸桿菌和未接種的BHI培養(yǎng)基。
表5用熒光標(biāo)記分子檢測的細菌培養(yǎng)物樣品的熒光偏振值 表6 探針10B和10E不能用于區(qū)分細菌菌株 由使用探針6D的熒光偏振試驗獲得的結(jié)果表明，該探針能用于區(qū)分SA與MRSA、大腸桿菌和未接種的BHI培養(yǎng)基(表7；圖2)。與甲氧基苯基青霉素抗性的金黃色葡萄球菌(MRS)、未接種的BHI培養(yǎng)基和大腸桿菌(E.coli)相比，從金黃色葡萄球菌(SA)可以獲得較高的熒光偏振值。這個熒光偏振值的差異只有當(dāng)細菌樣品來自溫育了5小時以上的培養(yǎng)物時才能檢測到(表7；圖12)。只有在培養(yǎng)物溫育時間是7.5小時或24小時時，SA樣品才顯示比MRSA樣品的熒光偏振值高。從BHI培養(yǎng)基獲得的熒光偏振值只有在培養(yǎng)物溫育時間是7.5小時或24小時時，才比從SA和MRSA獲得的熒光偏振值低。相反，大腸桿菌一直顯示最低的熒光偏振值。因此，探針6D與細菌樣品組分的結(jié)合能力隨細菌培養(yǎng)物溫育時間的增加而改變。
由探針6D獲得的熒光偏振水平在SA樣品中隨時間而增加，但在其他樣品中隨時間而減小。例如，大腸桿菌的熒光偏振值從由溫育1小時的培養(yǎng)物獲得的樣品的211.8+／-8.8mP減少到由溫育24小時的培養(yǎng)物獲得的樣品的173.4+/-3.1mP(表7)。相反，SA的熒光偏振值從由溫育1小時的培養(yǎng)物獲得的樣品的233.3+/-5.1mP增加到由溫育24小時的培養(yǎng)物獲得的樣品的279.0+/-3.3mP(表7)。這些結(jié)果說明，探針6D優(yōu)先與SA的某些未知組分結(jié)合，而隨著溫育時間的增加，這些組分的表達也增加。而且，這些結(jié)果還表明，探針6D可以用來區(qū)分SA與MRSA。
本實施例證明，該試驗系統(tǒng)可用于篩選能區(qū)分細菌菌株的探針。在本實施例中，從一個含80種熒光標(biāo)記探針的小文庫中發(fā)現(xiàn)了一個能用于區(qū)分上面介紹的實驗中所使用的三種細菌菌株的探針(6D)。
表7探針6D能用于區(qū)分細菌菌株 實施例11 探針6D從其他細菌菌株中區(qū)分金黃色葡萄球菌的能力下面的實驗用來確定探針6D是否能用于從其他細菌中區(qū)分金黃色葡萄球菌(SA)。
將5種不同細菌菌株的12個培養(yǎng)物接種于35ml體積的心腦浸出液培養(yǎng)基(BHI，Difco)中。雖然每種培養(yǎng)物的種類對實驗者來說是未知的，但已知4種培養(yǎng)物含有金黃色葡萄球菌(SA)，2種培養(yǎng)物含有甲氧基苯基青霉素抗性的金黃色葡萄球菌(MRSA)，2種含有喹啉抗性的金黃色葡萄球菌(QRSA)，2種含有萬古霉素抗性的屎腸球菌(VREF)。培養(yǎng)物在37℃搖床上溫育過夜。第2天，從12個培養(yǎng)物中每個取出7個5ul的樣品，并在黑色的96孔熒光偏振微滴定板中將其稀釋于100ul磷酸緩沖鹽(PBS)+0.1％牛γ球蛋白BGG中。接著，將5ul約10nM探針6D熒光素標(biāo)記的Sep0119288加入到細胞懸液中，并將板在37℃溫育30分鐘或指示的溫育時間。溫育后，使用FluoroliteFPM-2熒光偏振微滴定系統(tǒng)測定每個樣品中的熒光偏振數(shù)量。將12種未鑒定培養(yǎng)物每種的7個樣品的最高和最低偏振讀數(shù)除去，對剩下的5個值求平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。
對含有細菌細胞的細菌培養(yǎng)物樣品測定的熒光偏振值示于表8。根據(jù)熒光偏振值對12種培養(yǎng)物的熒光偏振試驗結(jié)果進行分組。這些分組示于圖13。每種分組都相當(dāng)于一個細菌菌株(表9)。SA培養(yǎng)物具有最高熒光偏振值，大腸桿菌具有最低的熒光偏振值(圖13)。因此，使用這種簡單的熒光探針，可以將12種未知的培養(yǎng)物準(zhǔn)確地分成5個菌株，并且可將SA從本研究使用的其他有機體中區(qū)分出來。
表8使用探針6D檢測的12種未確定培養(yǎng)物的熒光偏振值
表9.根據(jù)熒光偏振值將12種未鑒定的細菌培養(yǎng)物分成5個對應(yīng)于細菌菌株的組
本實施例證明，本發(fā)明提供了一種區(qū)分細菌菌株的方法。而且，本實施例表明，本發(fā)明的技術(shù)可用于檢測和診斷感染性微生物。
實施例12配體文庫的合成方法1熒光標(biāo)記的胺的液相合成伯胺和仲胺分別用FITC(1.2倍)在存在二甲基吡啶(DMAP)的情況下在DMF或DMSO中在室溫下分別用FITC(1.2倍)進行處理(如果使用胺鹽，加入等量的三乙基胺使胺游離)。大約24小時后，將2倍量的胺清除樹脂((tris-(2-aminoethyl)-amine polystryrene HL樹脂)加入到反應(yīng)混合物中。24-48小時后，過濾混合物除去樹脂，并進一步用DMSO將含有純化的熒光標(biāo)記配體的濾液稀釋到篩選所需的濃度。表10列出了按照方案Ⅰ使用液相合成的熒光標(biāo)記胺。
表10表10 熒光標(biāo)記胺的名單
方法2胺氨基甲酸Wang樹脂的合成將Wang樹脂(25g，20mmol，0.8mmol/g載量)和carbonyldiimidazole(CDI)(20g，120mmol)在干燥的THF(180ml)中在室溫振蕩2天。將混合物過濾，并用DMF、THF和CH2Cl2徹底洗滌樹脂，干燥樹脂，從而獲得imidazole carbonyl Wang樹脂(27g)。
然后在單獨的反應(yīng)管中用哌嗪(1.7g，20mmol)、同型哌嗪(2.0g，20mmol)或4，4’-trimethylenedipiperidine(4.2g，20mmol)在THF/DMF(1∶1，40ml)中在室溫下處理imidazole carbonyl Wang樹脂(5g，4mmol，0.8mmol/g載量)20分鐘。然后用DMF、THF和CH2Cl2徹底洗滌樹脂，真空干燥，分別獲得相應(yīng)胺氨基甲酸Wang樹脂。
方法3通過胺氨基甲酸接頭合成Wang樹脂上的DTAF將胺氨基甲酸Wang樹脂(1.0倍量)與DTAF鹽酸(2.5倍量)在DMF中在存在diisopropylethylamine(DIPEA)(4.0倍量)的情況下在室溫振蕩12-17小時。過濾樹脂，并用DMF、THF和CH2Cl2徹底洗滌樹脂，真空干燥，得到Wang樹脂上的monochlorotriazylfluorescein。
方法4通過胺接頭合成三苯甲基或氯三苯甲基樹脂上的DTAF將三苯甲基胺或2-氯三苯甲基胺樹脂(Novabiochem)(0.12mmol，1.0倍量)與DTAF(0.3mmol，2.5倍量)在DMF(ml)中在存在DIPEA(0.48mmol，4.0倍量)的情況下在室溫振蕩24-40小時。樹脂用DMF、THF和CH2Cl2徹底洗滌樹脂，真空干燥，產(chǎn)生三苯甲基樹脂上的monochlorotriazylfluorescein。
方法5合成RINK樹脂上的DTAF用DMF(5ml)中30％的哌啶溶液處理Rink酰胺樹脂(1g，0.8mmol，0.8mmol/g載量)2小時，所產(chǎn)生的Rink酰胺樹脂用DMF洗滌，接著用DCM洗滌，然后干燥。然后將Rink酰胺樹脂(0.8mmol)與5ml DMF中的DTAF(2.5倍量，2mmol)和DIPEA(4.0倍量，3.2mmol)振蕩24小時。用DMF/THF洗滌樹脂，然后用DCM洗滌，真空干燥，得到Rink樹脂上的monochlorotriazylfluorescein。
類似地，Rink樹脂上的Fmoc-氨基(在標(biāo)準(zhǔn)的肽合成條件下如DIC/DMAP/DCM由Rink胺樹脂和Fmoc-氨基酸制備)在DMF中用哌啶處理來除去Fmoc基團。然后用2.5倍量的DTAF和4.0倍量的DIPEA在DMF中在室溫下處理氨基酸Rink樹脂24小時。洗滌和干燥后，就得到Rink樹脂上的monochlorotriazylfluorescein。
方法6熒光接頭與一種二胺的反應(yīng)一種固相支持如Wang樹脂或三苯甲基樹脂上的monochlorotriazylfluorescein用4.0倍量的一種對稱二胺在DMF中在室溫下處理24-40小時，然后用DMF/MeOH洗滌樹脂，接著用DCM洗滌，真空干燥，得到一種固相支持上的氨基熒光素。
方法7制備一種熒光素標(biāo)記的脲化合物文庫三種氨基酸Rink樹脂(即方案Ⅰ中的L1為CH3、異丁基、芐基)(各500mg，0.4mmol，0.8mmol/g載量)在單獨的試管中按照上面方法5中的介紹分別用DTAF(2.5倍量)處理，得到樹脂上的三種不同的單氯熒光素衍生物。然后分別用哌嗪(各4.0倍量)和4，4’-trimethylenedipiperidine(4.0倍量)按照方法6處理這些樹脂(各250mg，0.2mmol)，得到6種氨基熒光素標(biāo)記的樹脂。然后將這6種氨基熒光素樹脂(各25mg，0.02mmol)分別與10種異氰化物(各3.0eq)在THF中以平行方式進行反應(yīng)，得到60種樹脂上的熒光標(biāo)記脲化合物。然后用30％的TFA/DCM切割樹脂，接著真空干燥，得到60種單獨標(biāo)記的熒光脲化合物(用HPLC/MS分析證實)，將它們?nèi)苡?ml的DMSO，用于生物篩選。
方法8通過胺接頭將DCSF連接到WANG樹脂或三苯甲基樹脂上將胺氨基甲酸Wang樹脂(4mmol，0.8mmol/g)與DCSF(2.0倍量，8mmol)在50ml干燥的DMF中在存在DIPEA(2.0倍量，8mmol)的情況下在室溫振蕩2-3小時。然后用DMF、MeOH、接著用DCM洗滌樹脂，干燥，得到Wang樹脂上的monochlorosulfofluorescein。
以相似的方式，用DCSF在存在DIPEA的情況下在DMF中處理一種哌嗪三苯甲基樹脂，得到三苯甲基樹脂上的monochlorosulfofluorescein。
方法9monochlorosulfofluorescein與環(huán)二胺的反應(yīng)來自方法8的Wang樹脂上的熒光素(1.33mmol，1.0倍量)用一種環(huán)二胺如哌嗪(4.0mmol，3.0倍量)在10ml的DMF中處理24小時。然后用DMF/MeOH洗滌樹脂，接著用DCM洗滌，真空干燥，得到Wang樹脂上的氨基sulfofluorescein。
方法10制備sulfofluorescein標(biāo)記的文庫含有不同的二胺接頭(例如哌嗪、同型哌嗪和4，4’-trimethylenedipiperidine的組合物)的氨基sulfofluorescein Wang樹脂以一種平行的方式用不同的有機酸(10倍量)在存在一種偶聯(lián)試劑如diisopropylcarbodiimide(DIC)(10倍量)和DMAP(5.0倍量)在DMF/DCM中在室溫下處理24-48小時。當(dāng)胺被完全?；?接著切下少量樹脂進行HPLC)，用DMF/MeOH洗滌樹脂，接著用DCM洗滌，真空干燥。然后使用30％的TFA/DCM切割樹脂，接著真空干燥，得到所需的熒光素標(biāo)記的化合物。
方法11熒光素標(biāo)記的QUINZALINONE的合成第1步，Wang樹脂結(jié)合的O-羥胺(參考文獻Floyd，C.D.等，Tetrahedron Lett.1996，vol.37，8045)(2.0g，1.6mmol，0.8mmol/g載量)用isatoic酐(6.4mmol，4.0倍量)在25ml的DMF中在存在DMAP(0.8mmol，0.5倍量)的情況下在65-70℃振蕩處理26小時。然后過濾所產(chǎn)生的樹脂混合物，并用DMF、MeOH和DCM徹底洗滌，干燥，得到樹脂上的N-羥胺。
第2步，N-羥胺樹脂(0.04mmol，50mg，0.8mmol/g載量)用商業(yè)渠道獲得的第一組Fmoc保護的α-氨基酸(0.2mmol，5.0倍量)、偶聯(lián)試劑PyBrOP(Bromo-tris-pyrrolidino-phosphoniumhexafluorophosphate，0.2mmol，5.0倍量)和DMAP(0.2mmol，5.0倍量)在二甲基乙胺(DMAC)溶劑(0.6ml)中在60-65℃振蕩處理20-24小時。將樹脂過濾，并用DMF、MeOH和DCM徹底洗滌，干燥，得到樹脂上的quinazolinone。然后將樹脂懸于DMF中的(0.6ml)的30％哌啶中，以從氨基基團上除去Fmoc保護基團，在過濾和洗滌后，得到游離的氨基quinazolinone樹脂，用于下一個反應(yīng)性模塊的連接。
第3步，樹脂上的氨基quinazolinone(50mg，0.04mmol)用第二組Fmoc保護的α-氨基酸(0.2mmol，5.0倍量)、偶聯(lián)試劑DIG(diisopropylcarbodiimide，0.2mmol，5.0倍量)和DMAP(0.2mmol，5.0倍量)在DMF(0.6ml)中在室溫下處理20-24小時。然后將樹脂過濾，并用DMF、MeOH和DCM徹底洗滌，干燥。然后將樹脂懸于DMF中(0.6ml)的30％哌啶中，以從氨基基團上除去Fmoc保護基團，在過濾和洗滌后，得到游離氨基樹脂，用于染料的連接。
第4步，氨基樹脂(0.04mmol)用DTAF-HCl染料(Dichlorotriazylamino fluorescein monohydropylethylamine，0.08mmol，2.0倍量)和DIPEA(diisopropylethylamine，0.16mmol，4.0倍量)在DMF(0.6ml)中在室溫下振蕩處理20-24小時。然后將樹脂過濾，并用DMF、MeOH和DCM徹底洗滌，干燥，得到熒光標(biāo)記的樹脂上的quinazolinone。
第5步，熒光標(biāo)記的樹脂(0.04mmol)用DCM中(1.0ml)的30％三氟乙酸(TFA)在室溫下振蕩處理1-2小時。將此混合物過濾，并用0.5ml的DCM洗滌樹脂。收集合并的濾液，真空蒸發(fā)進行干燥，得到所需的熒光標(biāo)記的quinazolinone配體，后者可溶于DMSO用于篩選。
使用不同的isatoic酐和Fmoc-保護的氨基酸以平行的方式進行上述反應(yīng)，就可制備上述熒光標(biāo)記的quinazolinone配體文庫。
方法12使用固相上的UGI偶聯(lián)合成配體Rink胺樹脂(1.0倍量)(用DMF中25％的哌啶處理商業(yè)化的Rink胺樹脂制備)在MeOH/DCM(1∶2，v/v)中膨脹。加入酐(10倍量)和Fmoc-保護的氨基酸(10倍量)?；旌衔镌谑覝叵抡袷?-2小時。然后加入異氰化物(10倍量)?；旌衔镌谑覝叵抡袷?0-24小時。然后將樹脂過濾，并用DMF、MeOH和DCM充分洗滌，并干燥。樹脂接著用DMF中的25％哌啶處理，得到含有一個游離氨基基團的樹脂。然后將該樹脂用DMF中的2.0-3.0倍量的DTAF和4-6倍量的DIPEA處理，在常規(guī)的過濾和洗滌后，得到樹脂上的熒光標(biāo)記的配體。然后用TFA/DCM從樹脂上切割并干燥，得到所需的熒光標(biāo)記的配體。
實施例13使用熒光偏振區(qū)分和鑒定人血清樣品下面的實施例說明使用本發(fā)明來區(qū)分和/或鑒定兩個或更多的人血清樣品。例如，當(dāng)樣品用一個探針文庫進行篩選時，根據(jù)所產(chǎn)生的結(jié)合圖譜的差異，正常和異常血清可相互區(qū)別。此外，使用合適的探針溶液，本發(fā)明可用來將糖尿病血清與正?；蚱渌翘悄虿⊙鍏^(qū)別。下面的討論說明了可用于區(qū)分人血清樣品的一般方法。
將來自三個不同文庫板(XN1192、XN1043-58、GY1175-96和板1)的熒光標(biāo)記探針與購自Western States Plasma Company(Fallbrook，CA)的血清樣品混合。血清樣品包含來自三個糖尿病病人(由參考實驗室證明是糖尿病)的混合的糖尿病血清和來自正常個體的混合血清(Lot HS300；SeraCare，Oceanside，California)。
首先，將2.5ul每種熒光標(biāo)記探針(1-10nM)與95ul緩沖液(PBS+O.03％十二烷基硫酸鋰)和5ul血清在96孔板中混合。然后將混合物在37℃溫育30分鐘。將指示的血清樣品在20，000xg離心3.5小時，并取5ul下層的、淡黃色的血清層，進行探針結(jié)合分析。使用FluoroliteFPM-2熒光偏振微滴定系統(tǒng)測定每種探針與每種樣品的熒光偏振。每種探針對每種樣品檢測三個重復(fù)，并求取平均的熒光偏振值(mP)。
在使用80種熒光素標(biāo)記的探針進行的初步篩選中，探針在從兩種血清樣品中獲得的熒光偏振值中顯示明顯的差異。表11中列出的和表12中描述的探針在從正常的混合血清(Lot HS300)和糖尿病血清獲得的熒光偏振值中顯示明顯的差異(圖14)。表11中列出的12種探針中有10種在糖尿病血清中獲得的熒光偏振值比在正常血清(LotHS300)中獲得的要高。這些結(jié)果顯示，探針58A2、58A3、58A6、58B6、58B7、58B11、58H8、96G3、54G3和P184優(yōu)先與糖尿病血清中的某些成分結(jié)合。 從正常(Lot HS300)和糖尿病血清樣品獲得的熒光偏振值有差異的一個可能的原因是，糖尿病血清中的脂類含量比正常血清中高。為確定糖尿病血清中的脂類含量是否影響所獲得的熒光偏振值，通過離心將血清樣品脫去脂類，并使用表11中列出的相同探針測定熒光偏振值．用這些探針獲得的熒光偏振值列于表12，并在圖15中用圖形的方式描述．使用探針58A2、58A3、58A6、58B6、58B7、58B11、58H8、96G3、54G3和P1B4在糖尿病血清和正常血清(Lot HS300)中獲得的熒光偏振值之間的差異程度在血清被脫去脂類時似乎更大。脫脂糖尿病血清的熒光偏振值比未脫脂的糖尿病血清高。這些結(jié)果說明，糖尿病血清中的脂類含量不能解釋為什么糖尿病血清比正常血清(Lot HS300)更優(yōu)先結(jié)合探針58A2、58A3、58A6、58B6、58B7、58B11、58H8、96G3、54G3和P184。而且，這些結(jié)果表明，糖尿病血清中存在的脂類能降低探針58A2、58A3、58A6、58B6、58B7、58B1l、58H8、96G3、54G3和P1B4與糖尿病血清中存在的另一種組分的結(jié)合親和性。 對于探針56C6和54E8，脫脂糖尿病血清和脫脂正常血清(LotHS300)之間的熒光偏振值差異與在兩種含有脂類的血清中觀察到的差異相比沒有改變。但是，除去血清中含有的脂類大大影響了使用探針54G3和P1B4從正常(Lot HS300)和糖尿病血清中獲得的熒光偏振值差異。在存在脂類時，使用這兩種探針在糖尿病血清中獲得的熒光偏振值明顯高于從正常血清(Lot HS300)獲得的值。但是，在脫脂血清中，使用探針54G3和P1B4從正常(Lot HS300)和糖尿病血清中獲得的熒光偏振值幾乎相同。這些結(jié)果說明探針54G3和P1B4與糖尿病血清中的一種脂類可溶性配體結(jié)合。脫脂對探針結(jié)合的影響說明，探針至少與三種或更多的靶的結(jié)合。
總的來說，上面介紹的結(jié)果證明，人血清樣品可使用本發(fā)明介紹的以熒光偏振為基礎(chǔ)的試驗彼此區(qū)分。而且，本實施例使用的方法可用于鑒定能區(qū)分正常和糖尿病血清的探針。
表Ⅱ?qū)嵤├?-8中的BO-和FL-標(biāo)記的化合物
表Ⅱ(續(xù))實施例4-8中的BO-和FL-標(biāo)記的化合物
表Ⅱ(續(xù))實施例4-8中的BO-和FL-標(biāo)記的化合物
表12本發(fā)明中使用的探針的結(jié)構(gòu)
本發(fā)明并不限于在這里介紹的特殊實施方案的范圍內(nèi)，這些實施方案只是用來說明本發(fā)明的各個方面。事實上，除了這里顯示和介紹的內(nèi)容，根據(jù)前面的介紹和附圖，本發(fā)明的各種修改對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說非常明顯。這些修改也在附錄的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
這里引用的所有參考文獻在用于所有目的時都在這里全文引入作為參考。
權(quán)利要求
1．分析由分子組分的混合物組成的樣品的方法，包括(a)將該樣品與一種分子探針文庫在允許分子探針與其特殊的結(jié)合伙伴結(jié)合的條件下作用；并(b)使用一種均一的試驗系統(tǒng)檢測分子探針文庫的單個成員與樣品中的分子組分的任何結(jié)合，其中文庫成員與樣品的結(jié)合圖譜為該樣品提供了一種分子指紋。
2．權(quán)利要求1的方法，其中分子探針文庫的成員是被標(biāo)記的。
3．權(quán)利要求2的方法，其中標(biāo)記是熒光。
4．權(quán)利要求3的方法，其中文庫成員與樣品組分的結(jié)合用熒光偏振來檢測。
5．權(quán)利要求2的方法，其中分子探針與一種光激活功能基團交聯(lián)。
6．權(quán)利要求5的方法，其中功能基團被活化，并且在探針與樣品的一種組分之間形成一種化學(xué)鍵。
7．權(quán)利要求2的方法，其中探針用一種閃爍劑標(biāo)記，樣品的組分用放射性標(biāo)記。
8．權(quán)利要求7的方法，其中探針與生物樣品的組分之間的相互作用導(dǎo)致光發(fā)射。
9．權(quán)利要求1或4的方法，其中文庫的成員是生物分子。
10．權(quán)利要求9的方法，其中文庫中的生物分子是糖蛋白、脂蛋白、蛋白、多肽、肽、肽類似物、氨基酸、多糖、寡糖、糖、多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核苷、DNA或一種衍生物、RNA或一種衍生物、脂、糖脂、脂多糖、有機分子或無機分子。
11．權(quán)利要求10的方法，其中文庫中的生物分子是受體、配體、抗體、抗原、表位、生長因子、細胞因子、或趨化因子。
12．權(quán)利要求1或4的方法，其中樣品是病人樣品或臨床樣品。
13．權(quán)利要求1或4的方法，其中樣品是體液、尿液、淋巴、全血、血清、血漿、紅細胞、白細胞、組織、細胞、細胞抽提物、體外轉(zhuǎn)錄或翻譯的產(chǎn)物、病毒、微生物、或病原有機體的抽提物。
14．權(quán)利要求13的方法，其中將使用分子探針文庫在樣品中產(chǎn)生的分子指紋與使用分子探針文庫在陰性對照樣品中產(chǎn)生的分子指紋進行比較。
15．權(quán)利要求14的方法，其中陰性對照樣品來自一個正常的供體。
16．權(quán)利要求13的方法，其中將使用分子探針文庫在樣品中產(chǎn)生的分子指紋與使用分子探針文庫在陽性對照樣品中產(chǎn)生的分子指紋進行比較。
17．權(quán)利要求16的方法，其中陽性對照樣品來自一個生病或受影響的供體。
18．權(quán)利要求1或4的方法，其中樣品中分子組分是糖蛋白、脂蛋白、蛋白、多肽、肽、肽類似物或氨基酸。
19．權(quán)利要求1或4的方法，其中樣品中的分子組分是多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核苷、DNA或一個衍生物、或RNA或一個衍生物。
20．權(quán)利要求1或4的方法，其中樣品中的分子組分是多糖、寡糖或糖。
21．權(quán)利要求1或4的方法，其中樣品中的分子組分是脂類、糖脂、脂多糖或脂蛋白。
22．權(quán)利要求1或4的方法，其中樣品中的分子組分是有機分子或無機分子。
23．權(quán)利要求1或4的方法，其中樣品中的分子組分是受體、配體、抗體、抗原、表位、生長因子、細胞因子或趨化因子。
24．一種分析生物樣品的試驗，包括(a)將生物樣品與熒光標(biāo)記的探針文庫作用；并(b)檢測每種熒光標(biāo)記探針與生物樣品的結(jié)合相互作用。
25．一種區(qū)分生物樣品的方法，包括(a)將生物樣品與相同的熒光標(biāo)記探針文庫作用；(b)檢測每種探針與每種生物樣品的結(jié)合相互作用，并(c)鑒定一種能將生物樣品彼此區(qū)分的結(jié)合相互作用圖譜。
26．一種鑒定有重要治療和診斷意義的生物靶和用于藥物發(fā)展的引導(dǎo)結(jié)構(gòu)的方法，包括(a)將兩種相同的探針文庫與兩種生物樣品作用，其中第一種生物樣品是對照；(b)使用均一的試驗系統(tǒng)檢測每種探針與生物樣品的一個組分之間的結(jié)合相互作用；并(c)鑒定第二種生物樣品特征性的探針/生物組分結(jié)合相互作用，其中這樣鑒定的組分是一種生物靶，而對該生物組分具有親和性的探針是發(fā)展藥物的一種引導(dǎo)結(jié)構(gòu)。
27．一種分析由分子組分混合物組成的樣品的試驗，所說的試驗包括(a)將分子探針文庫的成員連接到這樣的支架上，該支架帶有一個能被一種特殊的催化劑切割的位點，在位點的每一側(cè)各有一個標(biāo)記，從而提供分子探針/支架結(jié)構(gòu)物；(b)將分子探針/支架結(jié)構(gòu)物與樣品組合，其中對樣品中存在的一種分子組分具有親和性的分子探針與該樣品組分結(jié)合，形成一種能阻斷支架的切割位點的復(fù)合物；(c)在混合物中加入特殊催化劑，使不包含一個結(jié)合的樣品組分的支架被切割；并(d)檢測未結(jié)合的分子探針從支架上的釋放或復(fù)合物在支架上的保留；其中文庫成員與樣品的結(jié)合圖譜提供樣品的一種分子指紋。
28．權(quán)利要求21的試驗，其中支架包含DNA、肽、肽類似物或其他聚合物。
29．權(quán)利要求21的試驗，其中對生物樣品中存在的一種受體具有親和性的配體與該受體結(jié)合，并阻斷支架特異的試劑接近支架。
30．權(quán)利要求21的試驗，其中支架特異的結(jié)合試劑是一種藥物、肽、寡肽、多肽、蛋白、糖蛋白、脂蛋白、糖、寡糖、多糖、有機或無機分子。
31．權(quán)利要求21的試驗，其中支架特異的結(jié)合試劑不與配體和受體之間發(fā)生相互作用的支架區(qū)域結(jié)合。
32．權(quán)利要求21的試驗，其中支架包括一種標(biāo)記，該標(biāo)記在結(jié)合蛋白與篩選序列結(jié)合時被封閉，這樣接近該標(biāo)記就表明支架特異的結(jié)合試劑不存在以及配體/受體相互作用存在。
33．根據(jù)權(quán)利要求21的試驗，其中配體與第一個標(biāo)記連接在支架的同一側(cè)，并且試驗進一步包括在第一個標(biāo)記處將支架固定，加入催化劑后洗滌，來除去被切割的支架的未固定的部分，這種被切割的部分包括第二個標(biāo)記，其中完整的支架通過第二個標(biāo)記的存在來鑒定。
34．權(quán)利要求27的試驗，其中支架由雙鏈DNA組成，而標(biāo)記是一種生物素化的核苷酸。
35．一種區(qū)分相同類型的生物樣品的方法，包括(a)將相同的探針文庫的成員連接到含有一個切割位點并且在該位點兩側(cè)都有標(biāo)記的支架上；(b)將生物樣品與相同的探針文庫及相同的特異性催化劑作用；(c)檢測每種探針與每種生物樣品的結(jié)合相互作用；并(d)鑒定能使生物樣品彼此區(qū)分的結(jié)合相互作用的圖譜。
36．權(quán)利要求30的試驗，它進一步包括使用一種對照生物樣品和鑒定非對照生物樣品特征性的探針/生物樣品組分結(jié)合相互作用，其中這樣鑒定的組分是生物靶，對該生物組分具有親和性的探針是發(fā)展藥物的引導(dǎo)結(jié)構(gòu)。
37．合成標(biāo)記配體文庫的方法，包括(a)將一種熒光染料通過一種可切割的連接方式固定在一種固相支持物上，組成第一種產(chǎn)物混合物；(b)將所說的第一種產(chǎn)物混合物與一種或多種化合物或化合物的混合物在一定溫度下反應(yīng)足夠的時間，組成第二種產(chǎn)物混合物；并(c)將反應(yīng)混合物從固相支持物上切割下來，組成標(biāo)記配體文庫；其中熒光染料包括兩個反應(yīng)性半分子，它們獨立地選自鹵素、硫基、醇、醚、酯、醛、酮、羧酸、硝基、胺、酰胺、硅烷、以及它們的保護或非保護的衍生物。
38．權(quán)利要求37的方法，其中熒光染料是一種羅丹明衍生物、花菁衍生物、熒光素衍生物、色氨酸衍生物、香豆素衍生物、萘衍生物、雙吡啶衍生物、三吡啶衍生物、有機金屬復(fù)合物。
39．權(quán)利要求37的方法，其中固相支持物含有一個接頭，而接頭是一種鹵素、硫基、醇、醚、酯、醛、酮、羧酸、硝基、胺、酰胺、硅烷、以及它們的保護或非保護的衍生物。
40．合成標(biāo)記的配體文庫的方法，包括(a)通過一種可切割接頭將化合物固定在固相支持物上；(b)將一種熒光染料連接到固定的化合物上；并(c)從固相支持上切下分子－熒光染料反應(yīng)產(chǎn)物，產(chǎn)生熒光標(biāo)記的配體文庫。
41．一種分析待測試劑的毒性特征的方法，包括(a)將兩種相同的探針文庫與兩種生物樣品作用，其中第一種生物樣品是對照，而第二種生物樣品用待測試劑作用；(b)檢測每種探針與生物樣品之間的結(jié)合相互作用；并(c)鑒定第二種生物樣品特征性的探針/樣品結(jié)合相互作用。
42．在生物樣品中測定毒性試劑存在的方法，包括(a)將兩種相同的探針文庫與兩種生物樣品作用，其中第一種生物樣品是已用毒性試劑處理的陽性對照；(b)檢測每種探針與每種生物樣品之間的結(jié)合相互作用；并(c)在第二種生物樣品中鑒定作為陽性對照樣品的特征的探針/毒性試劑結(jié)合相互作用。
43．權(quán)利要求41或42的方法，其中探針與生物樣品之間的結(jié)合相互作用使用一種均一的試驗系統(tǒng)來檢測。
44．權(quán)利要求43的方法，其中探針文庫被熒光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。
45．分析樣品的蛋白組成的方法，包括使用權(quán)利要求1或26的方法制備樣品中糖蛋白、脂蛋白、蛋白質(zhì)、多肽、肽、肽類似物或氨基酸的分子指紋。
46．在病人中診斷疾病或疾患的方法，包括(a)使用權(quán)利要求45的方法制備從病人獲得的生物樣品的分子指紋；并(b)將病人樣品的分子指紋與陽性或陰性對照樣品的分子指紋進行比較。
47．在病人中預(yù)測藥物或治療效果的方法，包括(a)使用權(quán)利要求45的方法制備從病人獲得的生物樣品的分子指紋；并(b)將病人樣品的分子指紋與(ⅰ)對藥物或治療應(yīng)答以及對藥物或治療不應(yīng)答、(ⅱ)對藥物或治療產(chǎn)生有害反應(yīng)的病人的分子指紋進行比較。
48．在病人中監(jiān)測治療效果的方法，包括(a)在治療前和一段時間后，使用權(quán)利要求45的方法制備從病人獲得的生物樣品的分子指紋；并(b)將病人樣品產(chǎn)生的分子指紋與陽性或陰性對照樣品的分子指紋進行比較。
49．分析樣品的核苷酸組成的方法，包括使用權(quán)利要求1或26的方法制備樣品中多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核苷、DNA或一種衍生物、RNA或一種衍生物的分子指紋。
50．在病人中診斷疾病或疾患的方法，包括(a)使用權(quán)利要求49的方法制備從病人獲得的生物樣品的分子指紋；并(b)將病人樣品的分子指紋與陽性或陰性對照樣品的分子指紋進行比較。
51．在病人中診斷藥物或治療效果的方法，包括(a)使用權(quán)利要求49的方法制備從病人獲得的生物樣品的分子指紋；并(b)將病人樣品的分子指紋與(ⅰ)對藥物或治療應(yīng)答以及對藥物或治療不應(yīng)答、(ⅱ)對藥物或治療產(chǎn)生有害反應(yīng)的病人的分子指紋進行比較。
52．在病人中監(jiān)測治療效果的方法，包括(a)在治療前和一段時間后，使用權(quán)利要求49的方法制備從病人獲得的生物樣品的分子指紋；并(b)將病人樣品產(chǎn)生的分子指紋與陽性或陰性對照樣品的分子指紋進行比較。
53．一種分析樣品的分子組分的試劑盒，包括(a)一種分子探針文庫；和(b)一種檢測文庫成員與樣品中的分子組分結(jié)合的均一的或液相的手段。
54．根據(jù)權(quán)利要求53的試劑盒，其中探針文庫用一種熒光標(biāo)記，檢測手段是一種熒光偏振儀器。
55．權(quán)利要求54的試劑盒，它進一步包括為文庫的每個成員提供一種反應(yīng)容器工具，使之適合于進行均一的試驗。
56．權(quán)利要求54的試劑盒，它進一步包括一種支架，文庫的成員可釋放地與該支架連接。
57．權(quán)利要求54的試劑盒，其中分子探針文庫被選擇來與糖尿病、感染性疾病、炎癥疾病、心臟病、贅生性疾病、自身免疫疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的分子組分結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明的組合篩選試驗和檢測方法包括高多樣性的化合物文庫,這種高多樣性的化合物文庫能用作指紋,來鑒別生物樣品間存在的特異性分子差異。由本發(fā)明的組合篩選試驗和檢測方法鑒定的特異性分子差異是診斷和開發(fā)治療的潛在的靶。本發(fā)明的方法可用于診斷、藥物發(fā)現(xiàn)、以及基因組學(xué)和蛋白組學(xué)。圖1是本發(fā)明的方法的圖示,它顯示了表Ⅱ中介紹的分子探針與人血清樣品之間的相互作用。
文檔編號G01N33/532GK1285001SQ98813707
公開日2001年2月21日 申請日期1998年12月18日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月18日
發(fā)明者D·L·赫夫納, C·M·澤普, Y·高, S·W·瓊斯 申請人:塞普拉科有限公司