專利名稱:用免疫測(cè)定技術(shù)鑒別和定量聚合物的方法
發(fā)明背景本發(fā)明涉及一種使用免疫測(cè)定技術(shù)鑒別和定量水溶液系統(tǒng)中的聚合物的方法。具體地講，單克隆抗體(Mab’s)的制備是針對(duì)于用于開始聚合過(guò)程的引發(fā)劑(或其片段)；用于在聚合過(guò)程中制備預(yù)測(cè)定聚合物的鏈轉(zhuǎn)移劑；或是一個(gè)能在隨后連接到鏈轉(zhuǎn)移劑上的功能基。本發(fā)明還涉及表達(dá)這些MAbs的新的雜交瘤(不死的細(xì)胞系)。本發(fā)明對(duì)于測(cè)定水處理應(yīng)用中的聚合物濃度特別有用。
水溶性聚合物被用于許多水溶液系統(tǒng)，例如作為礦物分散劑；作為鍋爐用水、冷凝塔、反滲透應(yīng)用、糖精制、紙生產(chǎn)、地?zé)徇^(guò)程、和油井的水處理添加劑；作為去污添加劑，起助洗劑、抗薄膜劑、分散劑、分離劑、包鞘抑制劑的作用。在這些類型的應(yīng)用中，多聚物與礦物質(zhì)或其它物質(zhì)形成配合物使它們從水中消除，以防止在水處理應(yīng)用中產(chǎn)生腐蝕和礦物質(zhì)沉淀(水垢)。一段時(shí)間后，隨著聚合物上配合位點(diǎn)的飽和，聚合物開始失活或分解，從而必須加入更多的活性聚合物。特別重要的是，在水處理應(yīng)用中，活性聚合物不足可導(dǎo)致溶解的礦物質(zhì)對(duì)水處理的破壞，引起嚴(yán)重的腐蝕或水垢沉淀；而維持高于所需的活性聚合物的濃度則昂貴而浪費(fèi)。因此，希望能夠方便地測(cè)定在不同時(shí)間下系統(tǒng)內(nèi)的聚合物濃度，以確定是否需要另外加入聚合物。
關(guān)于測(cè)定水溶液系統(tǒng)中的聚合物的問題之一在于，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法(例如比色或熒光分析)缺乏靈敏度，因?yàn)榫酆衔锿ǔＲ詷O低的水平存在，從百萬(wàn)分之(“ppm”)500至5以下。關(guān)于測(cè)定水溶液中的聚合物的另一個(gè)問題在于，檢測(cè)方法常常缺乏選則性，可能對(duì)水溶液系統(tǒng)中的非聚合物成分給出錯(cuò)誤的結(jié)果。
克服這些問題的嘗試包括，針對(duì)聚合物產(chǎn)物的鏈節(jié)制造MAbs、然后用這些MAbs通過(guò)免疫測(cè)定技術(shù)檢測(cè)聚合物產(chǎn)物的存在或濃度的方法。在例如EP 540314 A1(Wetegrove等)、EP 535347 A2(Wetegrove等)、和EP 59249 A1(Weatherby等)中公開和討論了這種方法。在所有這些方法中，MAbs結(jié)合于聚合物的選定位點(diǎn)上，但是，由于聚合物鏈內(nèi)有大量的重復(fù)單元，因而MAbs和具體的聚合物鏈之間不可能一一對(duì)應(yīng)；此外，由于聚合物具有變動(dòng)的鏈長(zhǎng)度，因而結(jié)合于各聚合物上的MAbs的數(shù)量會(huì)有變化。因此，關(guān)于MAbs和聚合物濃度的比例的測(cè)定是批次依賴性的(即該比例將依據(jù)所制備的聚合物的具體批次而變化)，并且這種測(cè)量的精確度的變化可能相對(duì)較大。
PCT US94/09264(Garner等)公開了一種標(biāo)記產(chǎn)品以用于隨后的鑒別的方法。該方法包括制備一種低分子量半抗原，將該半抗原共價(jià)結(jié)合于一個(gè)載體化合物上，然后將這種半抗原標(biāo)記的化合物與產(chǎn)物締合，這樣，半抗原作為標(biāo)記物可以在隨后用免疫測(cè)定技術(shù)測(cè)定。載體化合物可以是聚合物，這樣，可以將半抗原連接到已形成的聚合物上，或者將半抗原在聚合之前連接到單體上。如想用于該方法，半抗原標(biāo)記的化合物(“標(biāo)記物化合物”)應(yīng)對(duì)產(chǎn)物是無(wú)影響的，對(duì)產(chǎn)物而言是惰性的，并且事先沒有締合在產(chǎn)物上。通常通過(guò)將標(biāo)記物化合物與產(chǎn)物混合使其與產(chǎn)物締合，但它可以在包裝或標(biāo)記產(chǎn)物時(shí)存在。
盡管Garner等公開了“以與未標(biāo)記化合物固定的比例使用這種標(biāo)記的化合物可以示蹤標(biāo)記的化合物”，但他們的方法的性質(zhì)使其不可能快速而方便地測(cè)定聚合物產(chǎn)物的濃度。Garner等指出，可以將半抗原締合于已形成的聚合物上，或在聚合之前締合于單體上；然而，在所有情況下，由于各個(gè)聚合物的鏈長(zhǎng)度是不固定的，締合于個(gè)具體的聚合物鏈上的半抗原數(shù)量會(huì)隨之變動(dòng)，所以，不可能絕對(duì)地測(cè)定出半抗原聚合物的比例。因此，半抗原聚合物的比例是批次依賴性的，使聚合物的濃度難于測(cè)定對(duì)于各批的標(biāo)記聚合物均需作出標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線；加入系統(tǒng)中的聚合物不可能與先前加入的聚合物來(lái)自同一批次，可能會(huì)影響測(cè)定的校準(zhǔn)和精確度；系統(tǒng)中總的聚合物濃度可能由來(lái)自于不同批次而不是僅僅一個(gè)批次的聚合物組成，也可能影響測(cè)定的校準(zhǔn)和精確度。
發(fā)明陳述一種鑒別和定量水溶液系統(tǒng)中的聚合物的方法，其中至少有一部分聚合物含有選自于鏈轉(zhuǎn)移劑、引發(fā)劑或其片段、或連接于鏈轉(zhuǎn)移劑上的基團(tuán)的可檢測(cè)末端，該方法由以下步驟組成a)制備可檢測(cè)末端的單克隆或多克隆抗體；b)獲得要測(cè)定的水溶液系統(tǒng)的樣品，將該樣品與單克隆或多克隆抗體一起孵育；c)檢測(cè)和測(cè)量單克隆或多克隆抗體的結(jié)合程度以鑒別聚合物并測(cè)定水溶液系統(tǒng)中的聚合的濃度。
附圖簡(jiǎn)述
圖1是圖解聚合物的濃度(μg/ml)對(duì)反應(yīng)性(％抑制)的曲線，說(shuō)明不同聚合物在TNT-Tag免疫測(cè)定中的反應(yīng)性。曲線的圖標(biāo)如下-◆-＝TNT-CYS-PAA；-■-＝CYS-PAA；-▲-＝PAA-PAA；-X-＝Acusol445N。
發(fā)明詳述本說(shuō)明書中使用的下列術(shù)語(yǔ)具有以下定義，除非文中另有明確的指示?！爸旅庖呖乖被颉爸旅庖叻肿印敝敢环N物質(zhì)，當(dāng)將其引入到免疫系統(tǒng)具有功能的動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，可激發(fā)免疫反應(yīng)而導(dǎo)致免疫狀態(tài)?！翱乖瓫Q定蔟”或“表位”指致免疫分子上可被特異抗體鑒別的部分?！鞍肟乖笔且环N不能在體內(nèi)致免疫的低分子量分子，但它可以作為致免疫分子上的抗原決定簇的一部分；也就是說(shuō)，如果事先將這些半抗原偶聯(lián)于一個(gè)致免疫抗原，就可以形成抗配合物的不同部分的抗體，包括抗某些可特異性結(jié)合于半抗原的部分的抗體。“標(biāo)記”指聚合物鏈上已形成單克隆或多克隆抗體的可檢測(cè)末端，其中的可檢測(cè)末端選自鏈轉(zhuǎn)移劑、引發(fā)劑(或其片段)、或連接于鏈轉(zhuǎn)移劑上的基團(tuán)；“標(biāo)記的”指聚合物，用于表示所指的聚合物含有標(biāo)記。除非特別說(shuō)明，指定的范圍均包括端值。
在使用鏈轉(zhuǎn)移劑的自由基聚合過(guò)程中，聚合反應(yīng)由鏈轉(zhuǎn)移劑中止。由此產(chǎn)生的自由基成為新聚合物鏈的開端。當(dāng)僅有有限量的聚合分支時(shí)〔例如通常在低分子量(小于50000)聚合物中出現(xiàn)的情況-代表性的是anti-scalants〕，鏈轉(zhuǎn)移劑與聚合物鏈的比例大約是1∶1；因此，檢測(cè)標(biāo)記的聚合物濃度的方法將導(dǎo)致對(duì)系統(tǒng)內(nèi)聚合物的總濃度的直接測(cè)定。通過(guò)使用靈敏和選擇性的免疫測(cè)定技術(shù)對(duì)標(biāo)記進(jìn)行測(cè)定，本發(fā)明的方法提供了一種簡(jiǎn)便、有效的檢測(cè)聚合物的方法。
在水溶液系統(tǒng)內(nèi)使用的所有聚合物均可被標(biāo)記，或者是某一特定部分的聚合物可以被標(biāo)記。優(yōu)選僅標(biāo)記系統(tǒng)內(nèi)的一小部分聚合物。當(dāng)僅有一部分聚合物被標(biāo)記時(shí)，未標(biāo)記的聚合物無(wú)需與標(biāo)記的聚合物相同，但是優(yōu)選未標(biāo)記的聚合物和標(biāo)記的聚合物在系統(tǒng)內(nèi)的性質(zhì)相似，從而使標(biāo)記的聚合物的排除率能夠精確地反映整個(gè)系統(tǒng)的排除率。
本發(fā)明的標(biāo)記的聚合物可以是可與鏈轉(zhuǎn)移劑聚合的任何類型，一般是乙烯基聚合。在本申請(qǐng)的使用本發(fā)明的標(biāo)記聚合物來(lái)測(cè)定水處理聚合物的實(shí)施方案中，優(yōu)選使用多元羧酸的聚合物或共聚物，尤其是丙烯酸酯聚合物和其衍生物。特別有用的丙烯酸酯聚合物包括從下列單體制得的聚合物和共聚物，所述單體包括，每個(gè)分子含有3-5個(gè)碳原子的烯鍵不飽和的一元羧酸、每個(gè)分子含有4-8個(gè)碳原子的烯鍵不飽和的二元羧酸、以及它們的堿金屬和銨鹽、和順式二元羧酸的酸酐。一元羧酸的例子包括但不僅限于丙烯酸、甲基丙烯酸、乙烯基乙酸、巴豆酸、和丙烯氧基丙酸。其中的丙烯酸和甲基丙烯酸為優(yōu)選。適當(dāng)?shù)亩人岬睦影ǖ粌H限于馬來(lái)酸、衣康酸、甲基富馬酸、富馬酸、檸康酸、四氫化鄰苯二甲酸、四氫化鄰苯二甲酸酐、和馬來(lái)酸酐。在這些二元酸單體中，馬來(lái)酸酐為優(yōu)選。
起始聚合物還可以由最高為百分之70重量比(“wt％”)的不含酸的單烯鍵不飽和單體構(gòu)成，只要聚合物仍然是水溶性的。這些單體包括但不僅限于丙烯酸或甲基丙烯酸的烷基酯，例如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、和甲基丙烯酸異丁酯；丙烯酸或甲基丙烯酸的羥烷基酯，例如丙烯酸羥乙基酯、丙烯酸羥丙基酯、甲基丙烯酸羥乙基酯、和甲基丙烯酸羥丙基酯；其它類型的丙烯酸或甲基丙烯酸酯，例如(甲)丙烯酸2-硫代乙基酯、(甲)丙烯酸3-硫代丙基酯、(甲)丙烯酸2-硫酸根合乙基酯、丙烯酸二甲氨基乙酯和甲基丙烯酸二氧磷基乙基酯；丙烯酰胺和烷基取代的丙烯酰胺，例如甲基丙烯酰胺、叔丁基丙烯酰胺、N-叔丁基丙烯酰胺、N-甲基丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、和3-N，N，-二甲基氨基丙基丙烯酰胺；丙烯腈，例如甲基丙烯腈；烯丙醇；烯丙基磺酸；烯丙基膦酸；乙烯基膦酸；2-乙烯基吡啶；4-乙烯基吡啶；N-乙烯基吡咯烷酮；N-乙烯基甲酰胺；N-丙烯嗎啉；丙烯醛；乙二醇二丙烯酸酯；三羥甲基丙烷三丙烯酸酯；鄰苯二甲酸二烯丙基酯；乙酸乙烯酯；苯乙烯；乙烯基磺酸、對(duì)苯乙烯磺酸、和2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸；甲基丙烯基磺酸酯和1-丙烯氧基-2-羥丙基磺酸酯(COPS)；丙烯酰胺基乙二酸；以及上述化合物的鹽。
起始聚合物最為優(yōu)選多元丙烯酸，或丙烯酸和馬來(lái)酸和馬來(lái)酸酐的共聚物。此外，起始聚合物或共聚物的數(shù)均分子量(“Mn”)優(yōu)選在500-100000，更為優(yōu)選1000-50000，最為優(yōu)選2000-25000的范圍內(nèi)。
用于控制聚合物成分的分子量的鏈轉(zhuǎn)移劑均可以用作本發(fā)明的標(biāo)記物。這些鏈轉(zhuǎn)移劑包括但不僅限于硫醇、次膦酸酯(phosphinate)、膦酸酯、亞磺酸(例如苯基亞磺酸和對(duì)甲苯基亞磺酸)、和氨基硫醇。適當(dāng)?shù)拇戊⑺狨グ║.S.5294371(Clubley等)中所公開的分子式I(col.1)的化合物和U.S.5376731(Kerr等)中所公開的分子式III(col.4)的化合物，適當(dāng)?shù)陌被虼及║.S.5298585(McCallum等)中所公開的類型。再此引入這三篇專利用于參考他們描述這些類型的鏈轉(zhuǎn)移劑和制備它們的方法的范圍。優(yōu)選使用半胱氨酸(“CYS”)、氨基乙基硫醇(“AET”)、或苯基次膦酸(“PPA”)作為鏈轉(zhuǎn)移劑。
用于引發(fā)自由基加成聚合反應(yīng)的然后引發(fā)劑和引發(fā)劑的片段均可以用作本發(fā)明的標(biāo)記物。這些引發(fā)劑或引發(fā)劑的片段包括但不僅限于過(guò)氧酯，例如過(guò)氧苯甲酸叔丁酯和過(guò)氧苯甲酸叔戊酯；二烷基過(guò)氧化物，例如過(guò)氧化二枯基；二芳基過(guò)氧化物，例如過(guò)氧化苯甲酰、氫過(guò)氧化物，例如氫過(guò)氧化枯烯；偶氮化合物，例如2-苯基偶氮-4-甲氧基-2，4-二甲基戊腈、2，2’-偶氮二-2-甲基-N-苯基丙酰脒二鹽酸鹽、2，2’-偶氮二-2(N-(4-氯苯基)-2-甲基丙酰脒)二鹽酸鹽、2，2’-偶氮二-(2-(5-甲基-2-咪唑啉-2-基)丙烷)二鹽酸鹽、和2，2’-偶氮二(2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷)二鹽酸鹽。
當(dāng)標(biāo)記物是連接到鏈轉(zhuǎn)移劑上的基團(tuán)時(shí)，可選則的鏈轉(zhuǎn)移劑是氨基硫醇，尤其是CYS或AET?？蛇B接到這些鏈轉(zhuǎn)移劑上的基團(tuán)是那些可以與所需基團(tuán)發(fā)生特異性的反應(yīng)、而不與聚合物的其它鏈節(jié)反應(yīng)的基團(tuán)。當(dāng)鏈轉(zhuǎn)移劑含有胺的側(cè)基時(shí)，優(yōu)選在它們上連接可與胺反應(yīng)的基團(tuán)作為標(biāo)記物。優(yōu)選的可與胺反應(yīng)的基團(tuán)包括但不僅限于1-(二甲胺氨基)-5-萘磺酸和其鹵化物(“丹?；?；4-二甲胺基偶氮苯-4-磺酸和其鹵化物(“dabsyl”)；2，4，6-三硝基苯磺酸和其鹽(“TNT”)；3-苯甲?；?2-甲醛；3-(2-呋喃甲?；?furfoyl))喹啉-2-甲醛；2，4-二硝基氟苯(Sanger's試劑)；和茚三酮。特別優(yōu)選的基團(tuán)包括丹酰基、dabsyl、和TNT。
本發(fā)明的單克隆或多克隆抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的技術(shù)進(jìn)行制備。有許多制備多克隆抗體的技術(shù)，包括由B.A.L.Hurn和S.M.Chantler記載的技術(shù)，“試劑抗體的制備”，酶學(xué)方法，70104-142(1980)。制備MAbs的技術(shù)首先由G.Kohler和C.Milstein記載，Nature，265495(1975)。在本發(fā)明的免疫測(cè)定技術(shù)中優(yōu)選使用MAbs。
為了制備抗特殊標(biāo)記物的MAbs，首先在接種結(jié)合物的小鼠體內(nèi)制備標(biāo)記物的致免疫結(jié)合物和致免疫載體。在1到300天或更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行多次接種。接種可以通過(guò)許多途徑中的任意一種進(jìn)行，包括腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下注射，每次注射劑量為5-50微克(“μg”)結(jié)合物。結(jié)合物可以單獨(dú)注射，或與其它物質(zhì)結(jié)合以增強(qiáng)其致免疫性。在免疫作用期結(jié)束時(shí)，收集來(lái)自脾臟的淋巴細(xì)胞，將其與骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤。然后將這些雜交瘤分離、培養(yǎng)并測(cè)試，以測(cè)定哪種雜交瘤對(duì)標(biāo)記物具有所需的特異性和親和性。然后，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的技術(shù)讓來(lái)自于這些選定的雜交瘤的MAbs在體外和體內(nèi)生長(zhǎng)。
本發(fā)明的雜交瘤包括所謂的Hybrid 1、Hybrid 2、Hybrid 3，通過(guò)瑞士或Balb/c小鼠的免疫作用獲得。通過(guò)這些雜交瘤加工的MAbs，可與PPA本身、與2-羧基丙基(苯基)膦酸(本質(zhì)上，PPA加一單位的AA)、或與標(biāo)記的聚合物(PPA-PAA)在低至1ppm的濃度下反應(yīng)，但是對(duì)未標(biāo)記的聚合物(PAA)僅有少量親和力或沒有親和力。這些MAbs適用于本發(fā)明的免疫測(cè)定測(cè)定方法中，包括直接夾層、間接夾層和競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)定。優(yōu)選使用直接夾層ELISA。
在競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中，首先將抗原吸入到塑料載體上，然后加入游離的(未結(jié)合)抗原(通常來(lái)自于標(biāo)準(zhǔn)溶液)，隨后加入抗體，然后孵育溶液。在孵育期結(jié)束時(shí)，洗去溶液，僅留下附著于結(jié)合抗原上的抗體并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。剩余抗體的濃度與樣品中的半抗原的濃度成反比。
對(duì)于非競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定，使用兩個(gè)不同的抗體，每一個(gè)針對(duì)抗原上的不同表位，一個(gè)抗體將抗原結(jié)合于固體基質(zhì)，第二個(gè)用于檢測(cè)抗原并測(cè)定其濃度。在直接夾層中，可檢測(cè)的標(biāo)記被直接附著于第二個(gè)抗體；而在間接夾層中，使用標(biāo)記的抗-免疫球蛋白測(cè)定第二個(gè)抗體本身。
由雜交瘤細(xì)胞表達(dá)并且對(duì)標(biāo)記物具有所需的特異性和選擇性的MAbs(“抗-標(biāo)記MAbs”)可用于本發(fā)明的免疫檢測(cè)測(cè)定方法中。一般地，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的技術(shù)對(duì)適當(dāng)?shù)碾s交瘤系進(jìn)行選擇、使用這些雜交瘤系所表達(dá)的MAbs作為具體的免疫測(cè)定中的反應(yīng)物并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。
在以下的實(shí)施例中使用如下縮寫。L＝升；mL＝毫升；μL＝微升；g＝克，μg＝微克；M＝摩爾；mM＝亳摩爾；rpm＝轉(zhuǎn)/分；nm＝納米。KLH＝鑰孔槭血藍(lán)素；BSA＝牛血清白蛋白；OVA＝卵白蛋白；AP＝堿性磷酸酶。CFA＝完全弗氏佐劑；IFA＝“不完全”弗氏佐劑。另外，在以下的實(shí)施例中使用如下試劑。PBS13.8mMNaCl+2.7mMKCl，pH7.4。10倍PBS(10L)138mMNaCl(800g)+2.7mMKCl(20g)+4.28mMNaPO4，二堿的(dibasic)7H2O(115g)+1.46mMKPO4(20g)，pH7.2。PT(20L)10倍PBS(2L)+5％吐溫20(200ml)+水(足量)。PCT(1L)PBS(990ml)+酪蛋白(10g)+5％吐溫20(10ml)，pH7.2，組織培養(yǎng)液(1L)小牛血清(10％)+L-谷氨酰胺(1％)+2-mercapthanol(6％)+Iscove’s修飾的Dulbecco’s培養(yǎng)液(痕量)。TMB3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(0.4g/L)在酸性緩沖液中的溶液。本段中所有的％均指體積。
實(shí)施例1免疫結(jié)合物的制備A.TNT-酶結(jié)合物(DNP-AP)的制備TNT-酶結(jié)合物通過(guò)將TNT衍生物(二硝基苯磺酸)以各種(w/w)比例加入到堿性磷酸酶中進(jìn)行制備。
B.PAP-PAA-蛋白結(jié)合物的制備將苯膦酸(PAA)修飾的聚合物(其中PAA用作鏈轉(zhuǎn)移劑)的丙烯酸部分用各種摩爾比的碳二亞胺激活，然后將這些激活的聚合物以各種(w/w)比例加入到載體蛋白(選于KLH，BSA，OVA或AP)中，產(chǎn)生適當(dāng)?shù)腜PA-PAA-蛋白結(jié)合物。未反應(yīng)的半抗原通過(guò)用PBS充分透析去除。為了進(jìn)行比較，用類似方法制備PPA-蛋白結(jié)合物。
實(shí)施例2Mabs的制備根據(jù)如下的免疫作用方法，對(duì)于各組的5只小鼠用3個(gè)月的時(shí)期注射一種實(shí)施例1B的免疫結(jié)合物。
在出生大約2個(gè)月后，將5只瑞士小鼠放血(尾靜脈放血)，合并血液測(cè)定血清。大約2周后，將0.1ml抗原(免疫結(jié)合物)在0.1mlCFA的鹽水溶液中乳化的混合物注射入各小鼠的腹腔內(nèi)。隨后以2周為間隔，將0.1ml抗原的鹽水溶液用0.1mlIFA乳化并注射入小鼠的腹腔內(nèi)，共進(jìn)行大約3個(gè)月。以1個(gè)月的間隔、以及在免疫作用期結(jié)束時(shí)取血樣，以監(jiān)測(cè)抗體水平。
到免疫作用期結(jié)束時(shí)，從脾臟獲得致敏的淋巴細(xì)胞并將其與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤細(xì)胞?？墒褂萌魏我环N大量的骨髓瘤細(xì)胞系，但是優(yōu)選的細(xì)胞系為P3×63Ag8.653。這些融合方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的；例如，Kearney等所記載的J.Immunol.，1231548(1979)。簡(jiǎn)單地講，將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在聚乙二醇的存在下結(jié)合一段時(shí)間、培養(yǎng)、檢測(cè)對(duì)抗原各部分的特異性。
實(shí)施例3檢測(cè)Mab特性使用以各種末端基團(tuán)標(biāo)記的聚合物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定。
TNT-CYS-聚合物(標(biāo)記的聚合物)通過(guò)將半胱氨酸修飾的聚合物的氨基末端與TNBS反應(yīng)進(jìn)行制備。未反應(yīng)的TNBS通過(guò)用Amicron微型濃縮器過(guò)濾除去。這種半胱氨酸修飾的聚合物(其中的半胱氨酸用作鏈轉(zhuǎn)移劑)由McCallum等記載，參見前。
將Immulon-2培養(yǎng)皿用純化的抗TNT MAb在0.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中的5μg/mL的溶液包被，每孔100μL，將培養(yǎng)皿在4℃下孵育過(guò)夜或在37℃下孵育1小時(shí)。孵育后，將培養(yǎng)皿用PT沖洗3次，旋轉(zhuǎn)180°，再用PT沖洗3次。此刻，加入125μL/孔PCT，于室溫下將培養(yǎng)皿在設(shè)置在120rpm的培養(yǎng)皿搖動(dòng)器上孵育1小時(shí)。孵育后，將培養(yǎng)皿用PT沖洗3次，旋轉(zhuǎn)180°，再用PT沖洗3次。制備TNT-CYS-聚合物、CYS-PAA、PPA-PAA、和Acusol的不同濃度的抑制溶液，將各種抑制溶液和DNP-AP的1∶75的稀釋液同時(shí)加入孔中。然后于室溫下將培養(yǎng)皿在設(shè)置在120rpm的培養(yǎng)皿搖動(dòng)器上孵育1小時(shí)。孵育后，將培養(yǎng)皿用PT沖洗3次，旋轉(zhuǎn)180°，再用PT沖洗3次。然后向各孔中加入100μL對(duì)硝基苯基磷酸鹽(PNPP)的硫酸二乙醇胺緩沖液的稀釋液。然后于室溫下將培養(yǎng)皿在設(shè)置在120rpm的培養(yǎng)皿搖動(dòng)器上另外孵育15分鐘。最后，將培養(yǎng)皿在設(shè)置在405nm的熒光計(jì)上讀數(shù)。
圖1顯示該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖解數(shù)據(jù)清楚地證明TNT-CYS-PAA在0.1到10μg/ml的濃度范圍下易于檢測(cè)，而相同濃度下的CYSPAA、PPA-PAA、和Acusol445N反應(yīng)微小。而且，圖1的數(shù)據(jù)顯示，至少在檢測(cè)的濃度范圍內(nèi)，在反應(yīng)性和聚合物濃度之間存在著線性關(guān)系。
權(quán)利要求
1.一種鑒別和定量水溶液系統(tǒng)中的聚合物的方法，其中所述聚合物通過(guò)鏈聚合生產(chǎn)，且其中所述方法包括以下步驟a)獲得所述水溶液系統(tǒng)的樣品，其中所述系統(tǒng)中至少一定百分?jǐn)?shù)的所述全部聚合物為可檢測(cè)聚合物，所述各種可檢測(cè)聚合物具有單一的可檢測(cè)末端，所述末端選自由鏈轉(zhuǎn)移劑、鏈引發(fā)劑、鏈引發(fā)劑片段和連接于鏈轉(zhuǎn)移劑的基團(tuán)組成的組，b)將該樣品與特異性結(jié)合到所述可檢測(cè)末端的抗體一起孵育；并且c)檢測(cè)并測(cè)量所述抗體與所述系統(tǒng)中可檢測(cè)末端的結(jié)合程度，其中所述結(jié)合表示所述可檢測(cè)聚合物的濃度，并允許測(cè)量水溶液系統(tǒng)中各種聚合物的濃度，其中所述鏈轉(zhuǎn)移劑選自硫醇、次膦酸、膦酸、亞磺酸、氨基硫醇、或其鹽。
2.權(quán)利要求
1的方法，進(jìn)一步包括制備適當(dāng)?shù)目箍蓹z測(cè)末端的單克隆或多克隆抗體的步驟。
3.權(quán)利要求
1的方法，其中的可檢測(cè)末端包括引發(fā)劑或引發(fā)劑片段，所述引發(fā)劑或引發(fā)劑片段選自過(guò)氧酯、二烷基過(guò)氧化物、二芳基過(guò)氧化物、氫過(guò)氧化物、和偶氮化合物。
4.權(quán)利要求
1的方法，其中的可檢測(cè)末端包括連接于鏈轉(zhuǎn)移劑上的可與胺反應(yīng)的基團(tuán)，且其中的鏈轉(zhuǎn)移劑包括氨基硫醇。
5.權(quán)利要求
4的方法，其中的可與胺反應(yīng)的基團(tuán)選自1-(二甲胺氨基)-5-萘磺酸和其鹵化物；4-二甲胺基偶氮苯-4-磺酸和其鹵化物；2，4，6-三硝基苯磺酸和其鹽；3-苯甲?；?2-甲醛；3-(2-呋喃甲酰基)喹啉-2-甲醛；2，4-二氟硝基苯；和茚三酮。
6.權(quán)利要求
1的方法，其中使用酶連免疫吸附測(cè)定來(lái)檢測(cè)并測(cè)量單克隆或多克隆抗體的結(jié)合程度。
專利摘要
公開了一種使用免疫測(cè)定技術(shù)定量鑒別水溶液系統(tǒng)中的聚合物的方法，其中至少有一部分聚合物含有可檢測(cè)末端。這對(duì)水處理系統(tǒng)特別有用。還公開了表達(dá)可特異性識(shí)別該可檢測(cè)末端的MAbs的新的雜交瘤細(xì)胞系。
文檔編號(hào)G01N33/53GKCN1144045SQ97102272
公開日2004年3月31日 申請(qǐng)日期1997年1月17日
發(fā)明者L·H·凱勒, B·溫斯坦, L H 凱勒, 固 申請(qǐng)人:羅姆和哈斯公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan