本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種用于b型肉毒神經(jīng)毒素的檢測試劑盒和檢測方法。

背景技術(shù)：

1、許多地區(qū)都曾發(fā)生肉毒神經(jīng)毒素中毒的病例，從全球來看，食物和嬰兒肉毒神經(jīng)毒素中毒事件也常有報道，在已報道的病例中，以a型和b型肉毒神經(jīng)毒素中毒最多。隨著肉毒神經(jīng)毒素在藥物和美容應用方面的廣泛應用，因使用不當導致肉毒神經(jīng)毒素中毒的案例也逐漸發(fā)生。因此，開發(fā)能夠?qū)Ω黝愐伤迫舛旧窠?jīng)毒素中毒案例在短時間的定性檢測，從而為輔助醫(yī)生診斷，及時進行治療決策提供證據(jù)支持的檢測方法以及檢測產(chǎn)品具有重要意義。

2、此外，在肉毒神經(jīng)毒素制品研發(fā)、生產(chǎn)過程中也需要對肉毒神經(jīng)毒素進行一系列檢測以保證質(zhì)量控制，例如用總蛋白測定法檢測相關(guān)毒素蛋白含量、用小鼠體內(nèi)中和法進行血清型別鑒定（時長可能為若干天）等。但針對肉毒神經(jīng)毒素的這些檢測方法依然存在操作復雜、耗時長、靈敏度低等缺點。

3、因此，目前仍需開發(fā)一種快速有效的肉毒神經(jīng)毒素檢測抗體或其抗原結(jié)合片段、檢測試劑盒及檢測方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中的至少部分技術(shù)問題，本發(fā)明使用天然肉毒神經(jīng)毒素復合物為抗原，制備得到了一種抗b型肉毒神經(jīng)毒素的天然抗體，該抗體或其抗原結(jié)合片段具有良好的靈敏度、特異性、親和力和穩(wěn)定性。具體地，本發(fā)明包括以下內(nèi)容。

2、本發(fā)明的第一方面，提供一種用于b型肉毒神經(jīng)毒素的檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包含能夠與b型肉毒神經(jīng)毒素結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包括氨基酸序列分別如gfafssyd、issggsst和arqafytydgtamdy所示的重鏈cdr1-3，和/或氨基酸序列分別如qsivhnngdty、kvs和fqgshipwt所示的輕鏈cdr1-3。

3、本發(fā)明的第二方面，提供一種檢測b型肉毒神經(jīng)毒素的方法，所述檢測b型肉毒神經(jīng)毒素的方法包括以下步驟：

4、(1)?使待測樣本與抗體或其抗原結(jié)合片段接觸，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段能夠與b型肉毒神經(jīng)毒素結(jié)合，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包括氨基酸序列分別如gfafssyd(seq?id?no.3)、issggsst(seq?id?no.4)和arqafytydgtamdy(seq?id?no.5)所示的重鏈cdr1-3，和/或氨基酸序列分別如qsivhnngdty(seq?id?no.6)、kvs和fqgshipwt(seqid?no.7)所示的輕鏈cdr1-3；

5、(2)?檢測所述b型肉毒神經(jīng)毒素與抗體或其抗原結(jié)合片段的結(jié)合，以確定所述待測樣本中b型肉毒神經(jīng)毒素的存在或確定所述待測樣本中b型肉毒神經(jīng)毒素的量。

6、本發(fā)明的第三方面，提供抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段能夠靶向b型肉毒神經(jīng)毒素，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包括氨基酸序列分別如gfafssyd、issggsst和arqafytydgtamdy所示的重鏈cdr1-3，和/或氨基酸序列分別如qsivhnngdty、kvs和fqgshipwt所示的輕鏈cdr1-3。

7、在某些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段具有(i)-(iii)所示的任意一種氨基酸序列：

8、(i)?包含evklvesggglvkpggslklscaasgfafssydmswvrqtpekrlewvatissggsstfypdsvkgrftisrdsarntlylqmislrsedtalyfcarqafytydgtamdywgqgtsvtvssakttppsvyplapgsaaqtnsmvtlgclvkgyfpepvtvtwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvpsstwpsetvtcnvahpasstkvdkkivprdcgckpcictvpevssvfifppkpkdvltitltpkvtcvvvdiskddpevqfswfvddvevhtaqtqpreeqfnstfrsvselpimhqdwlngkefkcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytipppkeqmakdkvsltcmitdffpeditvewqwngqpaenykntqpimdtdgsyfvysklnvqksnweagntftcsvlheglhnhhtekslshspgk(seq?id?no.1)的重鏈氨基酸序列和/或dvlmtqtplslpvslgdqasiycrssqsivhnngdtyfewylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyycfqgshipwtfgggtkleikradaaptvsifppsseqltsggasvvcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnswtdqdskdstysmsstltltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec(seq?id?no.2)的輕鏈氨基酸序列；

9、(ii)?與(i)所示的氨基酸序列具有至少90%同源性，且具有相同功能的氨基酸序列；

10、(iii)?與(i)或(ii)所示的氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個或多于一個氨基酸獲得的且具有相同功能的氨基酸序列。

11、在某些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述抗體包括單克隆抗體、嵌合抗體、鼠源抗體或人源化抗體；所述抗原結(jié)合片段包括fab（指包含了整個可變區(qū)（vh和vl）以及恒定區(qū)ch1的片段）、fab’（去除可結(jié)晶區(qū)的片段）、f(ab)2（以二硫鍵連接的片段）、f(ab’)2（去除可結(jié)晶區(qū)的以二硫鍵連接的片段）或scfv（單鏈可變片段）。

12、本發(fā)明的第四方面，提供核酸分子，所述核酸分子包含編碼根據(jù)本發(fā)明所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的核苷酸序列。

13、本發(fā)明的第五方面，提供載體分子，所述載體分子包含本發(fā)明所述的核酸分子。

14、本發(fā)明的第六方面，提供宿主細胞，所述宿主細胞包含本發(fā)明所述的核酸分子或本發(fā)明所述的載體分子。

15、本發(fā)明的第七方面，提供根據(jù)本發(fā)明所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的制備方法，所述抗體或其抗原結(jié)合片段通過人工合成或基因工程方式制備。

16、本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段可以對各類疑似肉毒神經(jīng)毒素中毒案例在短時間完成定性檢測（如使用elisa方法可在8?h內(nèi)完成檢測），同時，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段及檢測方法能夠顯著提高對毒素蛋白的特異性，避免血清型鑒別等動物實驗所帶來的時長問題等，可以應用于肉毒神經(jīng)毒素制品研發(fā)和生產(chǎn)過程。此外，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段及檢測方法在科研生產(chǎn)工作諸多的檢測過程中能夠?qū)θ舛旧窠?jīng)毒素標準品的穩(wěn)定性及保質(zhì)期等方面進行質(zhì)量控制。

技術(shù)特征：

1.一種用于b型肉毒神經(jīng)毒素的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒包含結(jié)合b型肉毒神經(jīng)毒素的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包括氨基酸序列分別如gfafssyd、issggsst和arqafytydgtamdy所示的重鏈cdr1-3，和/或氨基酸序列分別如qsivhnngdty、kvs和fqgshipwt所示的輕鏈cdr1-3。

2.一種檢測b型肉毒神經(jīng)毒素的方法，其特征在于，所述檢測b型肉毒神經(jīng)毒素的方法包括使待測樣本與抗體或其抗原結(jié)合片段接觸的步驟，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包括氨基酸序列分別如gfafssyd、issggsst和arqafytydgtamdy所示的重鏈cdr1-3，和/或氨基酸序列分別如qsivhnngdty、kvs和fqgshipwt所示的輕鏈cdr1-3。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測b型肉毒神經(jīng)毒素的方法，其特征在于，所述檢測b型肉毒神經(jīng)毒素的方法包括以下步驟：

4.抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述抗體或其抗原結(jié)合片段能夠靶向b型肉毒神經(jīng)毒素，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包括氨基酸序列分別如gfafssyd、issggsst和arqafytydgtamdy所示的重鏈cdr1-3，和/或氨基酸序列分別如qsivhnngdty、kvs和fqgshipwt所示的輕鏈cdr1-3。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述抗體或其抗原結(jié)合片段具有(i)-(iii)所示的任意一種氨基酸序列：

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述抗體包括單克隆抗體、嵌合抗體、鼠源抗體或人源化抗體；所述抗原結(jié)合片段包括fab、fab’、f(ab)2、f(ab’)2或scfv。

7.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含編碼根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的核苷酸序列。

8.載體分子，其特征在于，所述載體分子包含權(quán)利要求7所述的核酸分子。

9.宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞包含權(quán)利要求7所述的核酸分子或權(quán)利要求8所述的載體分子。

10.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的制備方法，其特征在于，所述抗體或其抗原結(jié)合片段通過人工合成或基因工程方式制備。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開一種用于B型肉毒神經(jīng)毒素的檢測試劑盒和檢測方法。本發(fā)明可以對各類疑似肉毒神經(jīng)毒素中毒案例在短時間完成定性檢測，為輔助醫(yī)生診斷、及時進行治療決策提供證據(jù)支持，在社會衛(wèi)生安全方面具有重要意義。同時，本發(fā)明的檢測方法能夠顯著提高對毒素蛋白的特異性，避免血清型鑒別等動物實驗所帶來的時長問題等，可以應用于肉毒神經(jīng)毒素制品研發(fā)和生產(chǎn)過程。此外，本發(fā)明能夠?qū)θ舛旧窠?jīng)毒素標準品的穩(wěn)定性及保質(zhì)期等方面進行質(zhì)量控制。

技術(shù)研發(fā)人員：王怡之,陸儉,張若暉,馬亞峰,張政,朱俐,張雪平,朱衍志,孫寶剛
受保護的技術(shù)使用者：蘭州生物技術(shù)開發(fā)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19