本發(fā)明涉及熒光檢測領域，具體涉及一種用于檢測中樞神經維生素b12缺乏癥羥鈷胺受體抗體的熒光檢測試劑盒及其應用。

背景技術：

1、維生素b12是一種必需的水溶性微量營養(yǎng)素，參與新陳代謝過程。維生素b12在神經系統(tǒng)的正常功能中起到重要作用，通過參與髓鞘合成，同時在骨髓中促使紅細胞的成熟，對循環(huán)系統(tǒng)也具有影響。缺乏維生素b12可能導致神經功能缺陷，包括協(xié)調性變差、痙攣和認知功能下降。然而，依賴血液中b12的檢測無法準確反映大腦中的水平。

2、cd320，也稱為轉鈷胺素受體，在血腦屏障的內皮細胞中富集，并介導轉鈷胺素結合的維生素b12進入中樞神經系統(tǒng)的細胞攝取和轉胞作用。經研究發(fā)現(xiàn)，b12缺乏癥患者的免疫球蛋白抑制cd320功能，抗cd320可能通過減少細胞表面受體的可用性來阻礙維生素b12穿過血腦屏障的運輸。在血液中檢測到抗cd320抗體陽性可預測腦內維生素b12缺乏。cd320自身抗體可能通過首先減少腦內維生素b12水平，進而對腦內神經產生影響。對于抗cd320血清陽性且具有不明原因的神經系統(tǒng)異常的患者，考慮檢測腦脊液中維生素b12代謝物。

3、檢測cd320抗體的存在有助于診斷維生素b12缺乏相關的中樞神經系統(tǒng)疾病，并指導臨床治療。然而，目前缺乏高效、快速的檢測cd320抗體的方法和試劑盒。因此，開發(fā)一種高靈敏度、高特異性的檢測試劑盒具有重要的臨床意義。

技術實現(xiàn)思路

1、鑒于目前缺乏高效快速的cd320抗體檢測試劑盒，本發(fā)明旨在提供一種靶向cd320抗體試劑盒。本發(fā)明還提供了一種檢測患者血清或腦脊液中抗羥鈷胺受體自身抗體的新方法，通過制備攜帶cd320基因載體的細胞，結合高靈敏度的細胞免疫熒光檢測技術。使該方法具有高檢測效率和強特異性強等特點，具有重要的臨床應用價值。

2、本發(fā)明利用細胞免疫熒光(cba)技術，結合抗原與抗體的特異性結合特性，并且在檢測過程中未對樣品中的抗原或抗體進行修飾或固定，充分保留了它們的空間結構，從而提高了檢測的靈敏度和特異性。

3、具體而言，本發(fā)明通過多段重組方法將cd320基因重組至pires2-egfp載體中。該載體保留了egfp蛋白功能，同時避免對目的基因功能的影響。該載體便于檢測轉染是否成功，確保cd320基因高質量表達，從而產生足夠的cd320蛋白，用于檢測樣品中的抗cd320抗體。

4、為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種用于檢測抗cd320抗體的檢測試劑盒。該試劑盒包括表達cd320基因的細胞、第二抗體；其中第二抗體是抗人抗體，與第二抗體接觸時，會產生熒光或發(fā)生熒光淬滅。

5、本發(fā)明中，待測樣品中含有的cd320抗體為第一抗體，能夠與本發(fā)明試劑盒中所表達cd320基因的細胞產生的cd320蛋白發(fā)生抗原-抗體特異性結合。所述第一抗體(抗體性抗原)又能夠與試劑盒中所述第二抗體發(fā)生抗原-抗體特異性結合。

6、作為本發(fā)明實施方式之一，所述第二抗體包括但不限于山羊、大鼠、小鼠、驢、馬、兔、狗、牛等抗人抗體；優(yōu)選山羊抗人抗體，其來源包括但不限于市售或者實驗室制備。

7、作為本發(fā)明實施方式之一，所述第二抗體類型包括但不限于igg、igm、iga、igg(fc)等，優(yōu)選igg。

8、作為本發(fā)明實施方式之一，所述表達cd320細胞為轉有攜帶cd320基因表達pires2-egfp載體的細胞。

9、作為本發(fā)明實施方式之一，所述表達cd320基因的細胞制備方法包括：

10、cd320基因載體構建；

11、準備293t細胞用于轉染；

12、質粒轉染細胞；

13、作為本發(fā)明實施方式之一，所述cd320基因載體構建步驟包括：通過pcr方法擴增得到片段pcr產物，通過多段充足的方法重組到目的載體中，最終得到目標質粒。

14、作為本發(fā)明實施方式之一，所述cd320基因載體構建進一步包括：人體cd320基因的全長序列盒所述載體用限制性內切酶酶切后連接的步驟，所述限制性內切酶為xhol-bamhi酶切。在所述cd320基因載體構建質粒的步驟中，使用pcr法獲取所述cd320基因，在所述pcr法中使用的引物對的序列為g0294965-1_1所示序列和g0294965-1_2所示序列。

15、作為本發(fā)明實施方式之一，所述用于轉染的細胞包括但不限于hek293t，cho，hela，human?es細胞，mc3t3-e1等；優(yōu)選hek293t，進一步優(yōu)選經過傳代貼壁生長的hek293t。

16、作為本發(fā)明實施方式之一，所述質粒轉染方法包括但不限于電擊法，脂質體介導法，病毒介導法，顯微注射法，磷酸鈣法，基因槍法等；優(yōu)選脂質體介導法。

17、作為本發(fā)明實施方式之一，所述質粒轉染細胞中轉染使用脂質體為陽離子脂質體；優(yōu)選lipofectamine3000。

18、作為本發(fā)明實施方式之一，所述質粒轉染細胞中包括加入質粒和脂質體。

19、作為本發(fā)明提供的試劑盒可用于制備一種檢測患者血清或腦脊液中抗羥鈷胺受體自身抗體的檢測方法的試劑，檢測方法包括：

20、步驟1樣品處理：收集患者樣品，按照1:10，1:32，1:100，1:320的比例用稀釋液稀釋；

21、步驟2接種所述表達cd320基因的細胞；

22、步驟3加入封閉液，37℃孵育30分鐘；

23、步驟4加入待測樣品，37℃孵育1小時；

24、步驟5洗滌后加入二抗，37℃孵育30分鐘；

25、步驟6洗滌后，通過所述檢測細胞和所述待測樣品產生的熒光強度進行分析，診斷是否患有中樞神經系統(tǒng)b12缺乏癥。

26、作為本發(fā)明實施方式之一，所述步驟1中樣品包括但不限于血清和腦脊液；優(yōu)選血清。

27、作為本發(fā)明實施方式之一，所述步驟2中進一步包括：用1ml胰酶消化hek293t細胞1-2分鐘，用含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基重懸hek293t細胞。將細胞懸液置于96孔板，孔板置于37℃，5％二氧化碳、飽和濕度下的孵育箱中孵育8-24小時后，細胞完全貼壁后開始轉染。將轉有cd320基因質粒的hek293t細胞在96孔板中培養(yǎng)24小時，顯微鏡下觀察質粒轉染率達到60％-80％時，用于后續(xù)檢測。

28、作為本發(fā)明實施方式之一，所述封閉液包括山羊血清，牛血清白蛋白，脫脂奶粉，市售封閉液等，優(yōu)選山羊血清。

29、作為本發(fā)明實施方式之一，所述洗滌液包括不限于pbs，市售洗滌液等，優(yōu)選pbs。

30、作為本發(fā)明實施方式之一，所述步驟5中進行反應的二抗為熒光標記山羊抗人抗體。

31、作為本發(fā)明實施方式之一，所述步驟6進一步包括以陰性和陽性樣品作為對照，在顯微鏡視野下根據熒光信號強弱診斷是否患有中樞神經系統(tǒng)b12缺乏癥。

32、本發(fā)明還提供一種cmv-cd320-pires-egfp基因載體質粒構建方法，用于制備所述的用于檢測抗cd320抗體的熒光檢測試劑盒，包括如下步驟：

33、步驟一、通過pcr法，獲得擴增cd320片段，所用引物為：

34、上游引物的堿基序列為堿基序列表中seq?id?no.1的堿基序列：

35、tcagatccgctagcgctaccggactcagatctcgagatgagcggcggttggatggcgcaggttggagcgtgg；

36、下游引物的堿基序列為堿基序列表中seq?id?no.2的堿基序列：

37、taacgttaggggggggggagggagaggggcggatcctcacttgt?catcgtcgtccttgtaat；

38、步驟二、菌液pcr方法篩選陽性克隆，獲得陽性菌液37℃搖菌提質粒，經測序對比正確的質粒，用xhol-bamhi進行雙酶切。

39、一種轉有cd320基因質粒的hek293t轉染細胞的獲得方法，用于制備所述的用于檢測抗cd320抗體的熒光檢測試劑盒，包括如下步驟：

40、1)細胞培養(yǎng)：hek293t細胞由本實驗室常規(guī)培養(yǎng)，置于含有10％滅活胎牛血清的dmem培養(yǎng)基中，取對數生長期的細胞用于實驗；

41、2)細胞復蘇和傳代：預先向50ml離心管中加入20ml?dmem培養(yǎng)基，從液氮罐取出凍存細胞立刻放入37℃水浴中解凍，用70％酒精消毒凍存管外壁厚，將細胞儲存液轉移至離心管中，100rmp離心5分鐘后棄上清，重懸細胞置于含10％胎牛血清dmem培養(yǎng)基中，37℃，5％二氧化碳、飽和濕度下的孵育箱培養(yǎng)；

42、3)細胞準備：用1ml胰酶消化hek293t細胞1-2分鐘，用含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基重懸hek293t細胞；將細胞懸液置于96孔板，孔板置于37℃，5％二氧化碳、飽和濕度下的孵育箱中孵育8-24小時后，細胞完全貼壁后開始轉染；

43、4)質粒轉染：取無菌1.5mlep管，加入無血清dmem培養(yǎng)基，將權利要求8制備的質粒和lipofectamine3000充分混勻，靜置15-20分鐘；將混合液加入上述準備的細胞中，置于含5％二氧化碳的37℃孵育箱中孵育。

44、本發(fā)明的有益效果為：

45、本發(fā)明提供了一種用于檢測抗cd320抗體的熒光檢測試劑盒及其制備方法，能夠高效準確地檢測患者血清或腦脊液中抗cd320抗體的存在及濃度。試劑盒通過特異性抗體與表達cd320基因的細胞產生的cd320蛋白結合，再與熒光標記的第二抗體結合，產生熒光信號，從而實現(xiàn)對中樞神經系統(tǒng)b12缺乏癥的診斷。本技術中的堿基序列確保了cd320基因的有效表達，對于提高檢測的靈敏度和特異性至關重要。

46、該試劑盒具有高靈敏度和特異性，操作流程簡便，通過標準化的實驗步驟降低了操作難度，提高了檢測效率。此外，第二抗體的選擇靈活多樣，可根據實際需求選擇不同動物來源的抗人抗體，增強了試劑盒的適應性和靈活性。本發(fā)明不僅適用于診斷中樞神經系統(tǒng)b12缺乏癥，還可以擴展到其他需要檢測抗cd320抗體的領域，為臨床診斷和科學研究提供了有力的支持。

47、本發(fā)明通過細胞免疫熒光技術，建立高靈敏性檢測樣品中cd320抗體的方法，用于臨床定性及cd320自身抗體滴度測定。才用高靈敏度和特異性的細胞免疫應該染色法(cba)檢測技術，不需要對抗原和抗體進行化學修飾和固定，能更好的保留抗原和抗體的空間結構。

48、通過與現(xiàn)有的酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)、放射免疫沉淀法(ripa)、免疫印跡等檢測方法比較，確定本cba檢測技術具有靈敏度高和特異性強的特點，成功解決傳統(tǒng)檢測方法如elisa等常見的假陽性或假陰性，具有十分重要的臨床價值。