本發(fā)明涉及光致發(fā)光的測量方法,該方法可以用于相關(guān)的設(shè)備儀器的設(shè)計(jì)和制造中,可以用于延遲發(fā)光的測量和成像。屬于光學(xué)儀器制造領(lǐng)域。
背景技術(shù):
在光致發(fā)光現(xiàn)象中,分子受光照激發(fā)躍遷到激發(fā)態(tài),激發(fā)態(tài)的分子可通過釋放光子回到基態(tài),即分子的熒光或磷光。分子的激發(fā)態(tài)存在壽命,即激發(fā)態(tài)的分子要在過一段時(shí)間之后才釋放光子回到基態(tài),且不同分子的激發(fā)態(tài)壽命各不不同,分子激發(fā)態(tài)壽命越長,其發(fā)光持續(xù)時(shí)間越長。通常情況下,分子的熒光壽命在納秒級,磷光壽命可以達(dá)到微秒級以上。延遲熒光分子,其壽命也可以達(dá)到微秒級甚至毫秒級。近些年發(fā)展的一些磷光分子,壽命可以達(dá)到秒級。此外一些無機(jī)納米材料,其壽命在毫秒級以上。這些長壽命的發(fā)光統(tǒng)稱為延遲發(fā)光,也被稱為輝光。
在熒光和磷光的測量中,一般需要構(gòu)建兩個(gè)光路:光路一是激發(fā)光路,即激發(fā)光照射樣品的光路,其目的是使樣品中的分子受光照激發(fā);光路二是探測光路,即樣品發(fā)光到達(dá)探測器的光路,其目的是探測樣品發(fā)光的光譜、強(qiáng)度等信息。
兩條光路相交于同一點(diǎn),將樣品置于該交點(diǎn)上,以探測樣品的熒光和磷光。
在穩(wěn)態(tài)的測量過程中,光路一和光路二同時(shí)打開,即激發(fā)光一直照射樣品的條件下測量,這種方式可以獲得樣品發(fā)光光譜和強(qiáng)度的信息,但是不能得到樣品激發(fā)態(tài)壽命的信息。
為了測量樣品延遲發(fā)光的信號,通常需要在關(guān)閉激發(fā)光路之后打開探測光路,即在停止激發(fā)后,測量樣品的發(fā)光?;谶@樣的思路,人們發(fā)展了許多測量延遲發(fā)光的方法和儀器。(參考專利公開說明書CN201310392018.6、CN200510092520.0、CN201180017387.6、CN201110005032.7等。)其中比較常用的方法是采用脈沖光源,一個(gè)周期中,光照時(shí)間很短,其余時(shí)間的發(fā)光信號即為延遲發(fā)光信號;利用時(shí)間相關(guān)的單光子計(jì)數(shù)器可探測樣品發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的曲線。另外一種常用的方法也是采用脈沖光源,用具有門控功能的CCD探測延遲發(fā)光信號。
還有一種常用的方法,利用斬波器控制其中一個(gè)或兩個(gè)光路的開關(guān)時(shí)間,以達(dá)到探測延遲發(fā)光信號的目的。(參考文獻(xiàn)Biophysical Journal 1994, 67, 957-965、Biophysical Journal 1998, 74, 2210–2222、Anal. Chem. 2011, 83, 2294-2300、CN205484048U等。)由于許多樣品的發(fā)光壽命在毫秒以下,因而兩個(gè)光路開關(guān)需要精確的時(shí)間控制,為此,許多瞬態(tài)光譜儀和時(shí)間分辨的成像裝置采用TTL調(diào)制、脈沖發(fā)生器、延時(shí)發(fā)生器等控制兩個(gè)光路的開關(guān)時(shí)機(jī)。此外,為了避免雜散光干擾,還需要光源的脈沖、探測器快門、斬波器控制等都具有較高的時(shí)間分辨率。
上述各種零部件的添加增加了儀器的復(fù)雜度,此外許多高時(shí)間分辨率的零部件價(jià)格非常高,如皮秒激光器、高速相機(jī)、單光子計(jì)數(shù)器、高精度的TTL控制器等。
為了簡化儀器并降低成本,專利US6839134B2、CN205080051U和CN106066317A公開了使用一個(gè)斬波器同時(shí)控制激發(fā)光路和探測光路的方法,不使用激光器、高速相機(jī)、TTL控制也可以實(shí)現(xiàn)延遲發(fā)光的探測。該方法具有一定的適用性,然而為了獲得高的時(shí)間分辨率,斬波器的通光孔要盡量狹窄,這直接降低了激發(fā)光的光通量,也就降低了發(fā)光信號。此外,針對一些特殊的樣本或裝置,增加斬波器的同時(shí)還需要改變光路才能實(shí)現(xiàn)延遲發(fā)光的探測。
流體樣本的熒光測量在色譜、微流控芯片、流式細(xì)胞儀等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用。在以往的微流管道樣本測量中,激發(fā)光路和探測光路都聚焦于微流管道的同一點(diǎn),主要用于非延遲的熒光測量(專利CN105917211A),為了測量樣本的延遲發(fā)光,需要對激發(fā)光路進(jìn)行脈沖控制,對探測進(jìn)行延遲控制(專利US20100032584A1、CN106053786A),這樣的方法不僅增加了儀器的復(fù)雜程度,還降低了測量效率。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
為了進(jìn)一步簡化儀器,以更加便捷的測量延遲發(fā)光的信號,本發(fā)明構(gòu)建了不同于傳統(tǒng)思路的測量方法。在以往的方案中,激發(fā)光路和探測光路相交或聚焦于同一點(diǎn),樣品需置于該交點(diǎn)上進(jìn)行測量,這種方式必須使用脈沖、快門分別控制激發(fā)光路和探測光路才能測量樣品的延遲發(fā)光。
為了省略脈沖和快門控制,本發(fā)明采用的方法是:
構(gòu)建激發(fā)光路和探測光路,使兩條光路不相交,這樣,當(dāng)樣品在激發(fā)光路上的時(shí)候,其發(fā)光不在探測光路上;當(dāng)樣品在探測光路上的時(shí)候,激發(fā)光不能照射樣品;
在延遲發(fā)光的測量中,移動(dòng)樣品,使樣品先位于激發(fā)光路上,再轉(zhuǎn)移到探測光路上,這樣就可以探測樣品的延遲發(fā)光信號。
其中,激發(fā)光路和探測光路可參考現(xiàn)有的技術(shù)構(gòu)建,激發(fā)光路包含光源,探測光路包含探測器,還可以根據(jù)需要,在光路上設(shè)置狹縫、光闌、棱鏡、光柵、濾光元件、透鏡、光纖等光學(xué)元件。
該方法測量延遲發(fā)光的原理顯而易見:當(dāng)樣品位于激發(fā)光路上,樣品的熒光或磷光被激發(fā),由于激發(fā)光路和探測光路不相交,因而,非延遲的發(fā)光不會(huì)被探測到;再將樣品轉(zhuǎn)移到探測光路上,由于轉(zhuǎn)移需要經(jīng)歷一段時(shí)間,因而探測的是延遲的發(fā)光信號;其中:該方法中的轉(zhuǎn)移指的是改變樣品相對于光路的位置,既可以是轉(zhuǎn)移樣品,也可以是轉(zhuǎn)移光路;該轉(zhuǎn)移過程經(jīng)歷的時(shí)間就是延遲時(shí)間,延遲時(shí)間的長短與移動(dòng)的相對距離和相對速率有關(guān)。
該方法探測延遲發(fā)光的優(yōu)勢顯而易見:不需要對光源進(jìn)行脈沖控制,省略了TTL控制、脈沖發(fā)生器、斬波器等設(shè)備,任何穩(wěn)態(tài)的光源都可以作為激發(fā)光源;不需要對探測器進(jìn)行時(shí)間、快門控制,省略了斬波器、快門等附件;在一些情況下,不需要周期性激發(fā)、延遲、測量的過程,只要重復(fù)移動(dòng)樣品或光路、增加曝光時(shí)間即可增強(qiáng)探測信號。
本方法適用于流體樣本的測量。流體樣本包括:液體、氣體和等離子樣本。其中液體樣本包括純凈物液體、溶液、懸浮液、膠體,氣體樣本包括均相的氣態(tài)樣本、蒸汽樣本、氣溶膠樣本等。
以液體樣本為例,具體測量中,液體樣本勻速經(jīng)過某管道,激發(fā)光路聚集于管道的上游某處,使該處的樣本被激發(fā),探測光路聚焦于管道下游某處,使該處的樣本發(fā)光可以被探測器檢測,這樣樣本從管道的上游流至管道的下游的過程中,經(jīng)過了激發(fā),延遲,測量的過程,因而該方法可探測流體樣本的延遲發(fā)光。
相對于其它時(shí)間分辨的流體測量裝置,該方法不需要脈沖快門調(diào)制,不需要額外添加任何附件,簡化了儀器,并降低了成本。此外,通過控制流速或改變光路聚焦的位置可以改變延遲時(shí)間,相對于調(diào)控快門,這種方法簡單易于實(shí)施。
在這樣的流體測試裝置中,含有管道、激發(fā)光路和探測光路,其中激發(fā)光路聚焦于管道上一點(diǎn)A,探測光路聚焦于管道上另外一點(diǎn)B,樣品流經(jīng)管道,先經(jīng)過點(diǎn)A,再經(jīng)過點(diǎn)B,則該系統(tǒng)可以探測管道內(nèi)流體樣品的延遲發(fā)光。
優(yōu)選的,該裝置還包括一個(gè)泵,將流體樣本以恒定速率注入管道,通過泵控制流體的速率可以調(diào)節(jié)延遲時(shí)間。
優(yōu)選的,可以將流體樣本循環(huán)注入管道,延長探測的曝光時(shí)間可以增強(qiáng)檢測信號強(qiáng)度。
優(yōu)選的,該裝置中,激發(fā)光路和探測光路聚焦的位置可以移動(dòng)或調(diào)節(jié),通過移動(dòng)或調(diào)節(jié)激發(fā)光路和探測光路聚焦的位置可以調(diào)節(jié)延遲時(shí)間。
優(yōu)選的,該裝置含有兩條或兩條以上的探測光路,每個(gè)探測光路聚焦于管道上的不同點(diǎn),樣本依次流經(jīng)各點(diǎn),各個(gè)光路可以同時(shí)探測不同延遲時(shí)間的發(fā)光信號。
在上述所有方案中,如果探測光路包括色散元件和探測器,其中色散元件選自棱鏡或光柵,探測器選自線陣CCD或CMOS傳感器,則該裝置可用于探測延遲發(fā)光的光譜。
該方法中,樣品從A點(diǎn)到B點(diǎn)的時(shí)間為延遲時(shí)間,即從A到B所經(jīng)過的距離除以樣品的流速的值。在經(jīng)過距離不變的情況下,調(diào)節(jié)流速即可調(diào)節(jié)延遲時(shí)間。在單位時(shí)間通過管道某橫截面的樣品體積不變的情況下,樣品的流速與橫截面積成反比,當(dāng)液體以1微升/秒通過管道時(shí),若管道橫截面為邊長10微米的正方形,則樣品的流速為10米/秒,若從A到B所經(jīng)過的距離為1厘米,則延遲時(shí)間為1毫秒,該系統(tǒng)可以測量毫秒的延遲發(fā)光信號。如果進(jìn)一步提高流速,并縮短AB的距離,則延遲時(shí)間可以縮短到微秒級,可以滿足大多數(shù)磷光、延遲熒光材料的檢測。
在上述所有方案中,流體管道不限于直線式,可以是曲折式、彎曲式。
實(shí)際的流體樣品往往是非均相,如血液樣本中含有細(xì)胞,空氣、河水中含有固體顆粒,因而流體樣本的延遲發(fā)光可能源于樣品中的溶質(zhì)或懸浮顆粒,借助上述微流測試系統(tǒng),可以測量這些溶質(zhì)或懸浮顆粒的延遲發(fā)光。
此外,許多有機(jī)化合物或納米材料的熒光和磷光往往需要溶解或懸浮于液體中測量,這些化合物或納米材料的延遲發(fā)光也可以在上述微流系統(tǒng)中測量。
流體樣本的熒光測量在色譜、微流控芯片、流式細(xì)胞儀等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用,因而該方法用于上述領(lǐng)域具有積極的作用。本方法充分利用流體的流動(dòng)性,在傳統(tǒng)測量設(shè)備基礎(chǔ)上,只需要改變光路的位置即可實(shí)現(xiàn)延遲發(fā)光的測量。
例如,在流式細(xì)胞儀的應(yīng)用中,使激發(fā)光路和探測光路分別聚焦于流動(dòng)室微流管道的上下游的不同點(diǎn),即可以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞延遲發(fā)光的高速探測。
探測過程大致如下:微流管道中每次通過一個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞進(jìn)入管道后在管道上游受光照激發(fā),當(dāng)該細(xì)胞流到下游的時(shí)候,經(jīng)過了一段延遲時(shí)間,再被探測器收集的發(fā)光信號即為延遲發(fā)光信號。
其中,細(xì)胞在管道的速度跟延遲時(shí)間直接相關(guān)。
現(xiàn)有的大多數(shù)商業(yè)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的速度可以達(dá)到1000個(gè)/秒,有的每秒可檢測上萬個(gè)細(xì)胞,按照同樣的分選速度,單個(gè)細(xì)胞流過管道的時(shí)間不超過1毫秒,因而這個(gè)方法可以檢測延遲時(shí)間在毫秒級甚至更短延遲時(shí)間的發(fā)光信號。
從該測試的原理可知,該方法可以搭配任意的穩(wěn)態(tài)光源使用,如汞燈、氙燈等,相對于使用單一波長的脈沖激光器,其激發(fā)波長可以使用光柵調(diào)節(jié),范圍覆蓋廣,可以測試不同激發(fā)波長的物質(zhì),大大降低了成本。該方法也可以搭配大功率的近紅外激光器,如980nm、808nm等,可以用于上轉(zhuǎn)換材料或近紅外發(fā)射材料的時(shí)間分辨的流體檢測。
附圖說明
圖1為測量流體延遲發(fā)光的示意圖,101為管道,102為流體樣品,103為透鏡,104為透鏡,105為探測器。
圖2為測量流體延遲發(fā)光光譜的示意圖,201為管道,202為流體樣品,203為透鏡,204為透鏡,205為反射光柵,206為探測器。
圖3為測量流體延遲發(fā)光的示意圖,301為管道,302為流體樣品,303為透鏡,304為透鏡,305為反光鏡,306為透鏡,307為探測器。
圖4為用光纖測量流體延遲發(fā)光的示意圖,401為管道,402為流體樣品,403、404、405、406為光纖,407、408、409為探測器。
圖5為測量曲折管道中流體發(fā)光的示意圖,501為管道,502、503、504為光纖。
圖6為流式細(xì)胞儀流動(dòng)室光路示意圖,601為管道,602為流體樣品,603為激光器,604、606、613為透鏡,605、610、611、612、617、618、619為探測器,607、608、609、614、615、616為二向色鏡。
具體實(shí)施方式
為了說明本發(fā)明的原理以及其優(yōu)勢,下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明,其目的在于幫助更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容,但這些具體實(shí)施方案不以任何方式限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。 在實(shí)際應(yīng)用中,可以根據(jù)具體情況實(shí)施最合適的方案。
實(shí)施實(shí)例1 ,流體延遲發(fā)光的測量。
如圖1所示,管道101中的流體樣本102勻速流動(dòng),激發(fā)光經(jīng)過透鏡103會(huì)聚于管道101上A1處,激發(fā)該處的樣品,其下游B1處的樣品發(fā)光經(jīng)過透鏡104會(huì)聚于探測器105中。其中B1處沒有激發(fā)光通過,因而該處的樣品發(fā)光源于樣品在A1處受激發(fā)后再流經(jīng)B1處的延遲發(fā)光,延遲時(shí)間為樣品從A1到B1的時(shí)間。
該方法使用的是穩(wěn)態(tài)光源,不需要脈沖和快門控制,成本低廉,只要流體樣品一直勻速經(jīng)過管道101,通過增加激發(fā)光強(qiáng)和探測器的曝光時(shí)間,可以提高檢測信號強(qiáng)度。
實(shí)施實(shí)例2 ,流體延遲發(fā)光光譜的測量。
如圖2所示,管道201中的流體樣本202勻速流動(dòng),激發(fā)光經(jīng)過透鏡203會(huì)聚于管道201上A2處,激發(fā)該處的樣品,其下游B2處的樣品發(fā)光經(jīng)過透鏡204后轉(zhuǎn)為平行光,經(jīng)過光柵205反射后色散為不同波長的光,照射在探測器206上。該裝置測量延遲發(fā)光的原理與圖1中相同,不同的是,采用了色散元件,優(yōu)選的,探測器206為線陣CCD或CMOS傳感器,可以探測延遲發(fā)光的光譜。
實(shí)施實(shí)例3 ,延遲時(shí)間可調(diào)的流體測量裝置。
如圖3所示,管道301中的流體樣本302勻速流動(dòng),激發(fā)光經(jīng)過透鏡303會(huì)聚于管道301上A3處,激發(fā)該處的樣品,其下游B3處的樣品發(fā)光經(jīng)過透鏡304后轉(zhuǎn)為平行光,經(jīng)過反光鏡305反射,再經(jīng)過透鏡306會(huì)聚到探測器307中。該裝置測量延遲發(fā)光的原理與圖1中相同,其中,透鏡304和反光鏡305可以沿著管道301方向平行移動(dòng),通過這種移動(dòng)可以使探測光路聚焦于管道301上的任意一處,在流速不變的情況下,不同位置的發(fā)光信號具有不同的延遲時(shí)間。
實(shí)施實(shí)例4 ,用光纖測量流體延遲發(fā)光。
如圖4所示,管道401中的流體樣本402勻速流動(dòng),激發(fā)光經(jīng)過光纖403照射于管道401上A4處,激發(fā)該處的樣品,其下游的樣品延遲發(fā)光經(jīng)過光纖404、405、406分別到達(dá)探測器407、408、409。
相對于透鏡,光纖體積小,便于實(shí)現(xiàn)多點(diǎn)檢測,圖中多個(gè)探測器分別探測不同位置的發(fā)光信號,由于延遲時(shí)間和位置線性相關(guān),因而,比較多個(gè)點(diǎn)的光強(qiáng)信號可以獲得發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化信息,即該方法可以測量延遲發(fā)光的壽命。
從原理可知,該方法不限于圖中的三根探測光纖,增加光纖探測的點(diǎn),可以獲得更多的延遲發(fā)光信息。
實(shí)施實(shí)例5 ,曲折管道流體的延遲發(fā)光探測。
如圖5所示,流體樣本在管道501中勻速流動(dòng),激發(fā)光經(jīng)過光纖502照射于管道501上A5處,其透射光經(jīng)過光纖502可被探測器探測,可以獲得樣品的吸收光譜信息,管道下游的B5處樣品發(fā)光經(jīng)過光纖503可被探測器探測,可以獲得延遲發(fā)光信息。
曲折的微流管道在實(shí)際的應(yīng)用較廣泛,通過設(shè)計(jì)合理的管道形狀,可以降低流體散射光的干擾。按本發(fā)明的原理,該方法可以用于其它非直線型的管道流體測量中。
本方法適用于液相色譜的延遲發(fā)光探測。
實(shí)施實(shí)例6,流式細(xì)胞儀中延遲發(fā)光的探測。
該方法可以應(yīng)用于流式細(xì)胞儀中,探測顆粒的延遲發(fā)光信號。
如圖6所示,微流管道601中的流體樣品602向下流動(dòng),激光器603照射在管道601中的A點(diǎn),構(gòu)成激發(fā)光路;樣品在A點(diǎn)受光照激發(fā),其背向散射光經(jīng)過透鏡604會(huì)聚于探測器605中,為第一探測光路;A點(diǎn)發(fā)出的熒光經(jīng)過透鏡606,會(huì)聚于二向色鏡607的方向,其中二向色鏡607、608、609為長波通二向色鏡,截止波長依次增大,各二向色鏡將截止波長以下的光分別反射至探測器610、611、612中,構(gòu)成第二探測光路;位于A點(diǎn)下方的B點(diǎn)發(fā)出的光經(jīng)過透鏡613,會(huì)聚于二向色鏡614的方向,其中二向色鏡614、615、616為長波通二向色鏡,截止波長依次增大,各二向色鏡將截止波長以下的光分別反射至探測器617、618、619中,構(gòu)成第三探測光路。
該裝置中,激發(fā)光路和第一、二探測光路為經(jīng)典流式細(xì)胞儀流動(dòng)室的光路結(jié)構(gòu),用于顆粒穩(wěn)態(tài)發(fā)光的探測。第三激發(fā)光路聚焦于激發(fā)光照射不到的B點(diǎn),可以探測流體的延遲發(fā)光,原理與前面的實(shí)例相同。
從原理可知,該裝置可以同時(shí)探測樣品的非延遲發(fā)光和延遲發(fā)光,不需要脈沖、延遲控制。流速越快,延遲時(shí)間越短,越有利于檢測延遲發(fā)光信號,同時(shí)提高了分選效率。
優(yōu)選的,該裝置中的探測器為光電倍增管。
如果只是為了測量延遲發(fā)光,可以省略第一、二探測光路。
將該裝置用于流式細(xì)胞儀,可以避免細(xì)胞自熒光的干擾。相對于現(xiàn)有的時(shí)間分辨測量方法,該方法成本低廉、操作簡單。
此外,實(shí)例1到實(shí)例6中的所有裝置中,可以改變延遲發(fā)光的探測方向,還可以增加延遲發(fā)光的探測光路,以獲得更多的延遲發(fā)光信息。還可以根據(jù)具體需要,在光路上添加狹縫、光闌、光柵、透鏡、濾光片、分光片、衰減片等,還可以增加二向色鏡、棱鏡、反光鏡或光纖以改變光路的方向,以增強(qiáng)檢測的信噪比。