本發(fā)明涉及一種免疫學(xué)檢測方法，尤其涉及一種基于生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花的酶聯(lián)免疫吸附測定方法。

背景技術(shù)：

酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa),指將可溶性的抗原或抗體吸附到固相載體上，利用抗原-抗體結(jié)合專一性，進行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法。自從engvall和perlmann于1971年發(fā)明以來該方法得到了迅猛的發(fā)展，已廣泛應(yīng)用于各種抗原抗體的檢測。

夾心elisa方法是目前最為常用的抗原和抗體的檢測手段，該方法具有操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點。其基本原理是，檢測抗體時，把相應(yīng)的抗原分子包被在聚苯乙烯固相載體上，加入被檢測樣品，孵育，洗滌，加入酶標(biāo)抗抗體，再孵育、洗滌，然后加入酶底物顯色，在酶標(biāo)儀上讀取數(shù)據(jù)，根據(jù)底物顯色反應(yīng)的強弱來判斷被檢樣品中抗體的含量；檢測抗原時，把針對該抗原的抗體分子包被在固相載體上，加入被檢樣品，孵育，洗滌，再加入被檢抗原的另一種抗體(二抗)，孵育，洗滌，加入酶標(biāo)抗二抗的抗體，再孵育、洗滌，最后加入酶底物顯色，讀數(shù)，根據(jù)顏色反應(yīng)的強弱來判斷樣品中抗原的含量。

但是傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附實驗存在一些不足,例如抗體或抗原包被過程耗時長、費用高、批次間差異大，以及抗體或抗原需要嚴(yán)格的低溫保存條件；此外盡管夾心elisa方法敏感性高，但隨著生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和光學(xué)檢測領(lǐng)域的發(fā)展，簡單快捷的elisa方法的敏感性依然亟待。因此，如何解決抗體或抗原包被時間過長、抗體或抗原穩(wěn)定性差、抗體或抗原捕獲效率較低等問題，實現(xiàn)快速高效檢測成為當(dāng)前酶聯(lián)免疫吸附法研究的重點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附法(以下稱為“2delisa”)存在的問題，本發(fā)明采用仿生合成的策略制備了生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花，構(gòu)建了三維層狀結(jié)構(gòu)的免疫分析方法(以下稱為“3delisa”)。該方法利用鏈霉親和素和生物素的快速高效特異性作用，將生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花快速偶聯(lián)到鏈霉親和素修飾的酶標(biāo)板上，解決了傳統(tǒng)elisa抗體包被需過夜反應(yīng)的問題；其次，由于生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花具有較高的穩(wěn)定性，使其在常溫條件下放置下仍有較好的活性；最后，所合成的生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花具有三維層狀結(jié)構(gòu)，對后續(xù)抗體或抗原的捕獲更為高效，有利于提高檢測靈敏度(圖1)。

實現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術(shù)方案為：

第一方面，提供一種基于生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花的酶聯(lián)免疫吸附測定方法，其特征在于，將生物素化的抗原或抗體，與硫酸銅溶液一起加入到ph值為6.8～7.4的磷酸緩沖溶液中，得到生物素化的抗原或抗體-無機鹽雜化納米花復(fù)合物，與鏈霉親和素修飾的酶標(biāo)板在37℃孵育，將孵育有生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花的酶標(biāo)板用于待測樣品的酶聯(lián)免疫吸附測定。

具體地，本發(fā)明的酶聯(lián)免疫吸附測定方法包括以下步驟：

(a)將磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，氯化鈉解于去離子水中，調(diào)節(jié)混合溶液的ph值至6.8～7.4，得到磷酸緩沖溶液，再加入硫酸銅溶液和生物素修飾的抗原或抗體，搖勻后室溫放置18h，得到生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花復(fù)合物；

(b)將所得生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花復(fù)合物離心得沉淀，用水洗滌2～4次，得洗滌后的生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花復(fù)合物；

(c)將洗滌后的生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花復(fù)合物均勻分散在pbst緩沖溶液中,置于鏈霉親和素修飾的孔板中，37℃孵育30～120min后，用洗液洗滌五次，再加入2％bsa溶液，于37℃封閉45min,得包被有生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花的酶標(biāo)板(簡稱“3dsubstrate”)，置于4℃保存?zhèn)溆?；所述的洗液為pbst緩沖溶液，其中磷酸鹽緩沖溶液濃度為10mm,nacl的濃度為150mm,tween20的濃度為0.05％,ph為7.2；

(d)將待測樣品加入包被有生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花的酶標(biāo)板中，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)45min；

(e)棄去上清液，洗滌五次，拍干，每孔加入50μlhrp標(biāo)記的抗目標(biāo)物抗體，37℃反應(yīng)45min；

(f)溫育后，棄去孔內(nèi)液體，洗板5次，拍干，每孔加入tmb顯色工作夜50μl，37℃避光顯色10min，依序每孔加硫酸終止液50μl，終止反應(yīng)，此時溶液顏色由藍色立即轉(zhuǎn)為黃色；

(g)用酶標(biāo)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(od值)，或?qū)⑷芤恨D(zhuǎn)入比色皿，放置于紫外-可見吸收光譜儀中，測其在450nm波長處的吸收值。通過顏色深淺或吸收強度可對待測物進行可視化半定量檢測或定量測定。

其中，步驟(a)所述的磷酸鹽緩沖溶液濃度為0.1m，所述的硫酸銅溶液的濃度為10～200mm，所述的生物素修飾的抗原或抗體為生物素修飾的甲胎蛋白(afp)單克隆抗體，濃度范圍為0.001～0.5mg/ml；

步驟(b)所述的每次離心時的轉(zhuǎn)速為10000r/min，離心時間為10min；

步驟(e)所述的抗目標(biāo)物抗體為抗afp抗體；

步驟(f)中硫酸終止液濃度為2mh2so4。

本發(fā)明方法與現(xiàn)有方法相比，具有以下優(yōu)點和效果：

1、采用仿生方法合成生物素化抗原或抗體-無機鹽雜化納米花兼具了抗原或抗體的高活性和納米材料高比表面積的三維結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)了三維elisa的檢測模式，與傳統(tǒng)的二維elisa相比，提高了對抗體或抗原的捕獲效率,因此,本發(fā)明具有較高的靈敏度及較寬的檢測范圍。

2、與游離態(tài)抗原或抗體相比，該抗原或抗體-無機鹽雜化納米花穩(wěn)定性好，使其在常溫放置下仍有較好的活性。

3、該抗原或抗體包被技術(shù)由于引進了生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)，從而可以利用他們之間快速、高效的特異性結(jié)合，解決了傳統(tǒng)抗原或抗體包被時間過長的問題，實驗只需幾小時即可完成。

4.在本發(fā)明中，只需要提供生物素化的不同抗原或抗體，制備出對應(yīng)的抗原或抗體-無機鹽雜化納米花，就能利用該elisa方法實現(xiàn)不同抗體或抗原的檢測，具有高適用性。

附圖說明

圖1為2dsubstrate與3dsubstrate捕獲性能測試及2delisa與3delisa檢測afp的示意圖

圖2為實施例1合成的生物素化抗體-無機鹽雜化納米花的掃描電子顯微鏡圖(sem圖)。

圖3為實施例1合成的生物素化抗體-無機鹽雜化納米花材料的x射線粉末衍射(xrd)。

圖4為實施例1中3delisa定量檢測afp的工作曲線。

圖5為實施例2中2delisa定量檢測afp的工作曲線。

圖6為實施例2中的2delisa和實施例1中的3delisa可視化半定量檢測afp對比圖

圖a為實施例2中的2delisa可視化半定量檢測afp效果圖；圖b為實施例1中的3delisa可視化半定量檢測afp效果圖。

圖7為實施例1合成的生物素化抗體-無機鹽雜化納米花的包被時間優(yōu)化圖。

圖8為實施例5中的3dsubstrate與傳統(tǒng)的2dsubstrate與抗原的不同孵育時間捕獲抗原的效果對比圖。

圖9為實施例5合成的3dsubstrate及傳統(tǒng)的2dsubstrate常溫條件下儲存抗體活性變化對比圖。

圖10為實施例7合成的不同濃度的生物素化抗體-無機鹽雜化納米花對抗原的捕獲效果對比圖

其中a、b、c、d、e代表分別含有0.005，0.01，0.016，0.02，0.05mg/ml的生物素修飾的羊抗鼠二抗的樣本。

圖11為計算實施例1合成的生物素化抗體-無機鹽雜化納米花中抗體固定效率的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實施方式

通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

鏈霉親和素修飾的酶標(biāo)板及傳統(tǒng)的2delisa用的酶標(biāo)板購于thermofisherscientificinc.,生物素修飾的甲胎蛋白(afp)單克隆抗體，甲胎蛋白(afp)，hrp修飾的甲胎蛋白(afp)單克隆抗體均購于上海領(lǐng)潮生物科技有限公司，生物素修飾的羊抗鼠二抗購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，hrp標(biāo)記的鼠源抗體購于sinobiologicalinc.。

【實施例1】本發(fā)明的生物素化抗體-無機鹽雜化納米花用于快速高效檢測癌癥標(biāo)志物甲胎蛋白(afp)試驗(3delisa)

1)將4μl硫酸銅溶液加入600μl含有生物素化甲胎蛋白(afp)單克隆抗體的磷酸鹽緩沖溶液中，室溫放置18h,得生物素化抗體-無機鹽雜化納米花；

所述的磷酸鹽緩沖溶液濃度為0.1m，ph7.4；所述的硫酸銅溶液的濃度為120mm；所述的抗體為生物素化甲胎蛋白單克隆抗體的濃度為0.016mg/ml。

2)將上述混合物離心得沉淀，用去離子水洗滌3次，得洗滌后的生物素化抗體-無機鹽雜化納米花復(fù)合物；離心轉(zhuǎn)速為10000r/min，離心時間為10min。

3)將上述生物素化抗體-無機鹽雜化納米花均勻分散在pbst緩沖溶液中,置于鏈霉親和素修飾的酶標(biāo)板(thermoscientificnuncimmobilizerstreptavidin)中，于37℃孵育1h后，用洗液洗滌五次，再加入300μl2％bsa溶液，于37℃封閉45min,得包被有生物素化抗體-無機鹽雜化納米花的酶標(biāo)板(簡稱“3dsubstrate”)，置于4℃保存?zhèn)溆谩Ｋ龅南匆簽閜bst緩沖溶液，其中磷酸鹽緩沖溶液濃度為10mm,nacl的濃度為150mm,tween20的濃度為0.05％,ph為7.2。

4)將不同濃度的抗原afp標(biāo)準(zhǔn)溶液加入包被有生物素化抗體-無機鹽雜化納米花的酶標(biāo)板，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)45min。

5)棄去液體，pbst緩沖液洗滌五次，拍干。每孔加入50μl濃度為20μg/μlhrp標(biāo)記的抗afp抗體，37℃反應(yīng)45min。

6)溫育后，棄去孔內(nèi)液體，洗板5次，拍干。每孔加入tmb顯色工作液50μl，37℃避光顯色10min。依序每孔加2m硫酸終止液50μl，終止反應(yīng)，此時溶液顏色由藍色立即轉(zhuǎn)為黃色。

7)用酶標(biāo)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(od值)，或?qū)⑷芤恨D(zhuǎn)入比色皿，放置于紫外-可見吸收光譜儀中，測其在450nm波長處的吸收值。通過顏色深淺或吸收強度對待測物進行半定量檢測。根據(jù)450nm波長處的吸收值對afp的濃度作圖，可以得到定量檢測afp的工作曲線。

對本實施例所合成的生物素化抗體-無機鹽雜化納米花材料進行掃描電子顯微鏡(sem)表征，所得的sem如圖2所示。sem顯示產(chǎn)物形貌為直徑約10μm的球狀納米花。

對本實施例所合成的生物素化抗體-無機鹽雜花材料進行x射線粉末衍射(xrd)表征，所得xrd如圖3。經(jīng)x射線粉末衍射鑒定，該材料的無機組份為三水磷酸銅。

從圖4中可以看出，隨著目標(biāo)物afp濃度的增加，紫外-可見吸收強度隨之增加。目標(biāo)物afp濃度在0.1至100ng/ml之間，紫外-可見吸收強度與目標(biāo)物濃度成線性相關(guān)，通過對試驗結(jié)果進行線性回歸，得到回歸方程為：

y＝0.0613x+0.222(r²＝0.990)，計算得到檢出限為0.029ng/ml，具有較高的靈敏度。

【實施例2】傳統(tǒng)的2delisa用于檢測癌癥標(biāo)志物甲胎蛋白(afp)試驗

1)在thermofisherscientificinc.(貨號：446469)酶標(biāo)板孔中加入50μl甲胎蛋白(afp)單克隆抗體(20μg/ml)，于4℃孵育過夜。

2)將包被好的酶標(biāo)板內(nèi)的溶液傾去，加入300μlbsa溶液(2％)，于37℃封閉2h。

3)將不同濃度的afp標(biāo)準(zhǔn)溶液加入包被有抗體的酶標(biāo)板，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)45min。

4)棄去液體，洗滌五次，拍干。每孔加入50μl濃度為20μg/μl的hrp標(biāo)記的抗afp抗體，37℃反應(yīng)45min。

5)溫育后，棄去孔內(nèi)液體，洗板5次，拍干。每孔加入tmb顯色工作液50μl，37℃避光顯色10min。依序每孔加2m硫酸終止液50μl，終止反應(yīng)，此時溶液顏色由藍色立即轉(zhuǎn)為黃色。

6)用酶標(biāo)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(od值)，或?qū)⑷芤恨D(zhuǎn)入比色皿中，放置于紫外-可見吸收光譜儀中，測其在450nm波長處的吸收值。通過顏色深淺對待測物進行半定量檢測。根據(jù)450nm波長處的吸收值對afp的濃度作圖，可以得到定量檢測afp的工作曲線。

定量檢測afp效果如圖5所示，該檢測方法線性范圍為5–50ng/ml，通過對試驗結(jié)果進行線性回歸，得到回歸方程為：y＝0.0301x+0.336(r²＝0.994)，計算得到檢出限為0.92ng/ml。

本實施例使用傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附法(2delisa)檢測afp抗原,其可視化半定量檢測afp效果如圖6a所示，2delisa可視化檢測afp檢測范圍窄，僅在5-50ng/ml范圍中有較為明顯的顏色變化，對于低濃度的afp無法分辨，對于高濃度的afp檢測信號達到平臺,無法分辨；圖6b是實施例13delisa的可視化半定量檢測afp效果圖，其可視化檢測afp檢測范圍廣，在0.1-100ng/ml的afp濃度范圍內(nèi)均能看到明顯的顏色變化。

3delisa中的靈敏度和檢測范圍明顯優(yōu)于2delisa。從信號方面分析，由于抗體無機鹽雜化納米花中負(fù)載了大量的捕獲抗體和其特殊的三維結(jié)構(gòu)，使其對低濃度的afp抗體也能有效捕獲；同時其負(fù)載的大量的afp捕獲抗體也能滿足高濃度的afp的捕獲。從背景方面分析，由于抗體無機鹽雜化納米花中的無機組分能有效減少非特異性吸附，從而降低背景。

【實施例3】實施例1合成的生物素化抗體-無機鹽雜化納米花的包被時間優(yōu)化

1)將實施例1獲得的生物素化抗體-無機鹽雜化納米花均勻分散在pbst緩沖溶液中,置于鏈霉親和素修飾的孔板中，于37℃孵育分別孵育5,10,30,60,90,120min后，用洗液洗滌五次，再加入300μl2％bsa溶液，于37℃封閉45min,得包被有生物素化抗體-無機鹽雜化納米花的酶標(biāo)板(簡稱“3dsubstrate”)，置于4℃保存?zhèn)溆?。所述的洗液為pbst(10mm,150mmnacl,0.05％tween20,ph7.2)。

2)將50微升25ng/mlafp標(biāo)準(zhǔn)溶液加入包被有生物素化抗體-無機鹽雜化納米花的酶標(biāo)板，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)45min。

3)棄去液體，洗滌五次，拍干。每孔加入50μl濃度為20μg/μl的hrp標(biāo)記的抗afp抗體，37℃反應(yīng)45min。

4)溫育后，棄去孔內(nèi)液體，洗板5次，拍干。每孔加入tmb顯色工作液50μl，37℃避光顯色10min。依序每孔加硫酸終止液50μl，終止反應(yīng)，此時溶液顏色由藍色立即轉(zhuǎn)為黃色。

5)用酶標(biāo)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(od值)，或?qū)⑷芤恨D(zhuǎn)入比色皿，放置于紫外-可見吸收光譜儀中，測其在450nm波長處的吸收值。

圖7所示,生物素化抗體-無機鹽雜化納米花與鏈霉親和素修飾的酶標(biāo)板偶聯(lián)速度快，孵育5min即有較為明顯的檢測信號，當(dāng)孵育時間大于60min，檢測信號達到平臺。為了保證較高的檢測信號同時又實現(xiàn)快速檢測的目的，本實驗中，生物素化抗體-無機鹽雜化納米花與鏈霉親和素修飾的酶標(biāo)板的孵育時間均選擇為60min。

【實施例4】驗證本方法在實際樣品檢測中的可靠性和準(zhǔn)確性

在血清樣品中加入不同濃度的afp標(biāo)準(zhǔn)品，所得加標(biāo)回收率列于下表1中。從表1中可以看出，利用實施例1獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測的加標(biāo)回收率在93.0％到109.3％之間，測定結(jié)果與加標(biāo)濃度能夠很好地吻合，說明本方法具有較好的準(zhǔn)確性。

表1加標(biāo)回收率

【實施例5】基于生物素化抗體-無機鹽雜化納米花三維酶聯(lián)免疫吸附法(3delisa)和傳統(tǒng)的2delisa中各自捕獲抗體在不同孵育時間實驗效果對比

一、3delisa

1)將硫酸銅溶液加入含有生物素化抗體的磷酸鹽緩沖溶液中，室溫放置18h,得生物素化抗體-無機鹽雜化納米花；

所述的磷酸鹽緩沖溶液濃度為0.1m,ph7.4；所述的硫酸銅溶液的濃度為120mm；所述的抗體為生物素修飾的羊抗鼠二抗，濃度為0.016mg/ml。

2)將上述混合物離心得沉淀，用去離子水洗滌3次，得洗滌后的抗體-無機鹽雜化納米花復(fù)合物；所述的每次離心時的轉(zhuǎn)速為10000r/min，離心時間為10min。

3)將上述生物素化抗體-無機鹽雜化納米花均勻分散在pbst緩沖溶液中,置于鏈霉親和素修飾的孔板中，于37℃孵育1h后，用洗液洗滌五次，再加入2％bsa溶液，于37℃封閉45min,得包被有生物素化抗體-無機鹽雜化納米花的酶標(biāo)板(簡稱“3dsubstrate”)。所述的洗液為pbst(10mm,150mmnacl,0.05％tween20,ph7.2)。

4)將50μlhrp標(biāo)記的鼠源抗體(100ng/ml)加入包被有生物素化抗體-無機鹽雜化納米花的酶標(biāo)板，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)，控制時間分別為5，30，60，90，120min。

5)溫育后，棄去孔內(nèi)液體，洗板5次，拍干。每孔加入tmb顯色工作液50μl，37℃避光顯色10min。依序每孔加硫酸終止液50μl，終止反應(yīng)，此時溶液顏色由藍色立即轉(zhuǎn)為黃色。

6)用酶標(biāo)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(od值)，或?qū)⑷芤恨D(zhuǎn)入比色皿，放置于紫外-可見吸收光譜儀中，測其在450nm波長處的吸收值。

二、傳統(tǒng)的2delisa

1)將50μl生物素修飾的羊抗鼠的二抗(20μg/ml)加入溶有pbst緩沖溶液中,置于鏈霉親和素修飾的孔板中，于37℃孵育1h后，用洗液洗滌五次，再加入1％bsa溶液，于37℃封閉45min,得包被有抗體的酶標(biāo)板(簡稱“2dsubstrate”)。

2)將50μlhrp標(biāo)記的鼠源抗體(100ng/ml)加入包被有生物素修飾的抗體的酶標(biāo)板，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)，控制時間分別為5，30，60，90，120min。

3)溫育后，棄去孔內(nèi)液體，洗板5次，拍干。每孔加入tmb顯色工作液50μl，37℃避光顯色10min。依序每孔加硫酸終止液50μl，終止反應(yīng)，此時溶液顏色由藍色立即轉(zhuǎn)為黃色。

4)用酶標(biāo)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(od值)，或?qū)⑷芤恨D(zhuǎn)入比色皿中，放置于紫外-可見吸收光譜儀中，測其在450nm波長處的吸收值。

如圖8所示，3delisa和傳統(tǒng)的2delisa隨著捕獲抗體孵育時間的增強，其捕獲能力逐漸增加，且在相同的孵育時間下3dsubstrate的捕獲能力優(yōu)于傳統(tǒng)的2delisa。

【實施例6】本發(fā)明的生物素化抗體-無機鹽雜化納米花與游離態(tài)抗體儲存穩(wěn)定性比較

以上述實施例5合成的生物素化抗體-無機鹽雜化納米花為載體負(fù)載抗體，并考察室溫條件下磷酸鹽緩沖液(ph7.4)儲存時，固定化抗體與游離抗體的相對活性。在室溫和磷酸鹽緩沖液ph7.4的條件下，將生物素化抗體-無機鹽雜化納米花和游離生物素化抗體分別放置1-7天后，分別重復(fù)實施例5“一、3delisa”中的步驟3)-6)或“二、傳統(tǒng)的2delisa”中的1)-4)，與hrp標(biāo)記的鼠源抗體的反應(yīng)為37℃45min。

實驗結(jié)果如圖9所示，固定于雜化納米花中的抗體的儲存穩(wěn)定性與游離抗體相比大幅提升，相對活性在一周之內(nèi)仍維持在90％以上。

【實施例7】基于生物素化抗體-無機鹽雜化納米花三維酶聯(lián)免疫吸附法(3delisa)中，不同濃度生物素化抗體包被實驗效果測試

1)將硫酸銅溶液加入含有不同濃度生物素化抗體的磷酸鹽緩沖溶液中，室溫放置18h,得抗體-無機鹽雜化納米花；

所述的磷酸鹽緩沖溶液濃度為0.1m，ph7.4；所述的硫酸銅溶液的濃度為120mm；所述的抗體為生物素修飾的羊抗鼠二抗，濃度分別為0.005，0.01，0.016，0.02，0.05mg/ml。

2)將上述混合物離心得沉淀，用去離子水洗滌3次，得洗滌后的生物素化抗體-無機鹽雜化納米花復(fù)合物；所述的每次離心時的轉(zhuǎn)速為10000r/min，離心時間為10min。

3)將上述生物素化抗體-無機鹽雜化納米花均勻分散在pbst緩沖溶液中,置于鏈霉親和素修飾的孔板中，于37℃孵育1h后，用洗液洗滌五次，再加入2％bsa溶液，于37℃封閉45min,得包被有生物素化抗體-無機鹽雜化納米花的酶標(biāo)板。所述的洗液為pbst(10mm,150mmnacl,0.05％tween20,ph7.2)。

4)將50μlhrp標(biāo)記的鼠源抗體(100ng/ml)加入包被有生物素化抗體-無機鹽雜化納米花的酶標(biāo)板，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板上加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)45min。

5)用酶標(biāo)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(od值)，或?qū)⑷芤恨D(zhuǎn)入比色皿中，放置于紫外-可見吸收光譜儀中，測其在450nm波長處的吸收值。對本實施例中合成的不同濃度的生物素花抗體-無機鹽雜化納米花進行捕獲性能測試，所得的紫外可見吸收光譜圖如圖10所示，隨著固定在納米花上的生物素化抗體濃度的增加，納米花的捕獲能力增強。

【實施例8】本發(fā)明的生物素化抗體-無機鹽雜化納米花中抗體的固定效率計算

各取50μl不同濃度的bsa蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液至相應(yīng)標(biāo)記的試管中。滴加50μl考馬斯亮藍增強型試劑至每管中并充分混勻，置于室溫下閉光孵育10min。測定樣品于595nm處的吸收值(a595)，并對bsa的濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖11。再用此標(biāo)準(zhǔn)曲線判讀出未知樣品的蛋白濃度。

在600μl磷酸鹽緩沖溶液(0.1m，ph7.4)中加入4μl硫酸銅溶液(120mm)和10μl生物素修飾的afp抗體(1mg/ml)，具體過程參見實施例1，室溫放置18h,得生物素化抗體-無機鹽雜化納米花；離心，取上層清液置于待測樣品管中。取50μl待測樣品加入等體積考馬斯亮藍增強型試劑，充分混勻，測定待測樣品于595nm處的吸收值。

實驗結(jié)果：從圖11中可以看出，abs595與標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度關(guān)系為y＝0.006x-0.05(r²＝0.994)。待測樣品在595nm處的吸收值為0.013。帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得待測樣品中蛋白濃度為10.8μg/ml。

反應(yīng)前加入蛋白濃度為：

反應(yīng)完成后，上層清液的蛋白濃度為：10.5μg/ml。

通過實驗得到生物素化抗體-無機鹽雜化納米花中抗體的固定效率為：