本發(fā)明涉及一種批量化對酒類樣品中氨基甲酸乙酯快速測定的方法，可以批量化對黃酒等酒類樣品中氨基甲酸乙酯進(jìn)行高靈敏、快速測定，屬于分析化學(xué)和食品安全檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

氨基甲酸乙酯（ethylcarbamate,ec），俗稱尿烷、烏拉坦，屬無色無味晶體，是一種在發(fā)酵食品和飲料生產(chǎn)過程中伴隨產(chǎn)生的有害代謝產(chǎn)物，不僅存在于發(fā)酵酒類中，在面包、醬油等發(fā)酵食品中也存在。ec是能導(dǎo)致嚙齒類動物肺癌、肝癌等疾病的多位點致癌物，現(xiàn)在一般認(rèn)為ec致癌的主要機(jī)理是銅離子存在時，ec與體內(nèi)的細(xì)胞色素p450作用，造成dna損傷，從而引起肝、肺等器官的癌變?；诖?，2007年世界衛(wèi)生組織的國際癌癥研究署將ec歸為2組a類致癌物質(zhì)。

隨著生活水平的提高，人們對發(fā)酵類食品和飲料酒的消費量也在逐年增加。這意味著人們攝入ec的主要途徑是攝入發(fā)酵類食品和酒精類飲料，特別是飲用酒精飲料是人體攝入ec的主要途徑。因此，世界各國政府制定了相應(yīng)的發(fā)酵酒中ec含量的限量標(biāo)準(zhǔn)。而建立快速、準(zhǔn)確的檢測ec含量的方法顯得十分必要。

目前，高效液相色譜（hplc）法或氣相色譜（gc）法與質(zhì)譜（ms）聯(lián)用技術(shù)是檢測酒類中ec的最常用的方法。液相色譜法一般需要衍生化處理，加入一些特殊有機(jī)試劑；而氣相色譜法，特別是氣相色譜-質(zhì)譜法具有分析樣品靈敏度高等優(yōu)點，因此應(yīng)用也很廣泛。以此衍生出的方法還包括：一維氣相色譜-質(zhì)譜（meps/gc-ms）、高效液相色譜-熒光檢測器（hplc-fld）、多維頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜和火焰離子化檢測器（hs-spme/gc/fld）等。這些已報道的檢測方法都需要使用昂貴的設(shè)備，由于ec本身既沒有特征性的光譜吸收，又不具有電化學(xué)或熒光信號，其通過gc或hplc分離后均需要采用特殊的檢測器，這些都使得快速、批量化或在線檢測很難被實現(xiàn)。并且發(fā)酵食品中的成分非常復(fù)雜，雜質(zhì)組分對檢測的干擾比較嚴(yán)重，樣品的處理很大程度上會影響現(xiàn)有的這些檢測方法結(jié)果的重復(fù)性。

近年來，人們對于酶傳感器研究取得了很大的進(jìn)步，將酶固定于電極的載體材料不僅僅是傳統(tǒng)的有機(jī)物材料，現(xiàn)在更多的是使用納米材料、溶膠凝膠等先進(jìn)材料，以達(dá)到改善所構(gòu)建酶傳感器性能的效果，主要原因是這些技術(shù)可以明顯改善傳感器表面的電子傳遞速率，提高酶的穩(wěn)定性甚至活性，同時電子媒介體的范圍也在迅速擴(kuò)展。由于酶傳感器具有靈敏度高、選擇性高、可大批量及在線使用、低成本等優(yōu)點，其應(yīng)用也越來越廣泛。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是建立一種可以批量化對黃酒等酒類樣品中ec進(jìn)行高靈敏、快速測定的電化學(xué)方法，關(guān)鍵的技術(shù)問題包括從樣品中萃取出ec以消除較高濃度尿素的存在對測定的影響；其后利用ec降解酶和丙氨酸脫氫酶（aladh）的催化，將ec濃度信號轉(zhuǎn)化為nadh消耗產(chǎn)生的電流響應(yīng)值的變化。

本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明的前期篩選出了產(chǎn)氨基甲酸乙酯降解酶（ec降解酶）菌株，并實現(xiàn)了產(chǎn)酶和純化，ec降解酶，在中國專利申請?zhí)?01410146266.7已公開，研究發(fā)現(xiàn)該ec降解酶是一種雙功能酶，不僅能催化ec水解為乙醇、co2和nh4⁺，還能催化尿素水解為co2和nh4⁺，由于尿素在黃酒等酒類中含量較高，為排除尿素對ec檢測的干擾，本發(fā)明首先設(shè)計了利用商品化cleanertec專用固相柱（堿性硅藻土）對酒類樣品進(jìn)行前處理，萃取出其中的ec至待檢溶液體系。為了解決ec降解酶與酶電極上修飾的丙氨酸脫氫酶的最適反應(yīng)ph不一致的問題，又設(shè)計了雙階段酶耦聯(lián)反應(yīng)的方法。最后為了實現(xiàn)對實際酒類樣品的大批量快速檢測，構(gòu)建了可以批量化制備和一次性使用的丙氨酸脫氫酶修飾的絲網(wǎng)印刷電極，利用電流時間法（i-t）實現(xiàn)對ec含量的電化學(xué)測定。

一種批量化對酒類樣品中氨基甲酸乙酯快速測定的方法，步驟如下：首先利用ec專用固相柱對酒類樣品進(jìn)行前處理萃取出其中的ec；然后在萃取所得溶液體系中加入ec降解酶將ec降解為乙醇、co2和nh4⁺；最后往檢測體系中加入底物丙酮酸鈉和還原性輔酶inadh并用緩沖液調(diào)節(jié)ph，利用丙氨酸脫氫酶（aladh）修飾的絲網(wǎng)印刷電極（spe）進(jìn)行電化學(xué)檢測，在丙氨酸脫氫酶aladh催化下，上步反應(yīng)生成的nh4⁺和加入的丙酮酸鈉、還原態(tài)的nadh反應(yīng)生成丙氨酸鈉和氧化態(tài)的nad⁺，利用電流-時間法測定nadh消耗造成的電流響應(yīng)值下降與ec濃度的線性關(guān)系來測算出ec含量。

所述批量化對酒類樣品中氨基甲酸乙酯快速測定的方法，具體步驟如下：

（1）制備丙氨酸脫氫酶修飾的絲網(wǎng)印刷電極：將0.1%~0.5%的殼聚糖cs和0.4%~0.7%還原氧化石墨烯rgo加入到100ml質(zhì)量濃度為1%的醋酸溶液中得到cs/rgo混合液體系，然后將15~25u/ml丙氨酸脫氫酶加入到該混合體系中，得到cs/rgo/aladh生物復(fù)合材料；將20~30μl的cs/rgo/aladh均勻覆蓋于絲網(wǎng)印刷電極表面，4℃冰箱儲存48h，干燥成膜，制備得到cs/rgo/aladh/spe；

（2）ec標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：使用ph4.5的檸檬酸緩沖液配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)ec溶液，向其中加入10~16u/ml的ec降解酶，常溫下反應(yīng)1h；加入ph10的碳酸鈉緩沖液，將反應(yīng)體系ph調(diào)到10，然后加入30~50mmol/l的丙酮酸鈉和0.4~0.6mmol/l的nadh，隨后將上述修飾好的cs/rgo/aladh/spe電極插入溶液中，在0.5~0.6v電壓下，利用電流時間法i-t掃描5min，記錄nadh在反應(yīng)前后的電流響應(yīng)變化值；根據(jù)電流響應(yīng)變化值與ec濃度之間的關(guān)系，繪制出相應(yīng)的線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線；

（3）萃?。豪胑c專用固相柱對酒類樣品進(jìn)行前處理，萃取出其中的ec至待檢溶液體系，具體步驟為：準(zhǔn)確量取2ml酒類樣品，加入100μl2.0~3.0μg/ml的d5-氨基甲酸乙酯內(nèi)標(biāo)使用液、氯化鈉0.3~0.4g，40khz超聲波處理10~20min，混合液加到萃取柱上，抽成0.1mpa真空，靜置10min，先用10~15ml正己烷淋洗除雜，接著用乙酸乙酯：乙醚按照體積比1：1配置成洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫液收集于具塞刻度試管中，用n2吹至洗脫液剩余0.4~0.5ml，用ph4.5的檸檬酸緩沖液定容至1.0ml；

（4）計算：取步驟（3）定容后的溶液按步驟（2）操作，測定相應(yīng)的電流響應(yīng)變化值，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線可求得ec濃度，并進(jìn)一步計算出酒樣中的ec含量。

步驟（3）所述ec專用固相柱為商品化cleanertec專用固相柱，堿性硅藻土。步驟（3）所述酒類樣品為黃酒。

步驟（1）所用絲網(wǎng)印刷電極的工作電極直徑為4mm，材料為碳。

步驟（2）所述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)ec溶液具體為0-1000μm。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明構(gòu)建了一個基于酶修飾絲網(wǎng)印刷電極的ec傳感器，通過與ec萃取專用固相柱的聯(lián)用，有效排除了酒類基質(zhì)中主要干擾物尿素的影響，實現(xiàn)了對黃酒等酒類樣品中ec含量的直接測定。該方法比之目前ec測定的主流方法gc-ms，不需要大型儀器設(shè)備，且能實現(xiàn)快速、高靈敏、低成本地批量化測定。

附圖說明

圖1是丙氨酸脫氫酶修飾絲網(wǎng)印刷電極的制備和檢測原理圖。

圖2是氨基甲酸乙酯濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實施方式

實施例1丙氨酸脫氫酶（aladh）修飾絲網(wǎng)印刷電極制備時殼聚糖（cs）、還原氧化石墨烯（rgo）最適添加濃度的確定

在制備丙氨酸脫氫酶修飾spe時，需要優(yōu)化用于固定aladh至電極表面的cs和rgo的濃度。使用單因素試驗的方法優(yōu)化cs的濃度。首先，配制質(zhì)量濃度分別是0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%的cs，加入適量甘油作為保護(hù)劑，攪拌均勻去泡，放置于4℃冰箱備用。取50μl不同濃度的cs溶液，分別與25μl20u/ml的aladh混勻，并取20μl混合液滴涂于spe表面。制成的電極按上述雙階段反應(yīng)對標(biāo)準(zhǔn)ec溶液進(jìn)行檢測，記錄5min反應(yīng)時間內(nèi)nadh的電流響應(yīng)變化值。確定當(dāng)cs濃度為0.3%時，所制備的電極電流響應(yīng)變化值最大，因此cs的最適濃度為0.3%。在采用最適濃度cs的基礎(chǔ)上，配制質(zhì)量濃度分別是0%，0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%，1.0%的rgo，加入適量甘油作為保護(hù)劑，攪拌均勻去泡，放置于4℃冰箱備用。取50μl不同rgo濃度的混合液，分別與25μl20u/ml的aladh混勻，取20μl混合液滴涂于spe表面。制成的電極按上述雙階段反應(yīng)對標(biāo)準(zhǔn)ec溶液進(jìn)行檢測，當(dāng)rgo濃度為0.5%時，電極測得的nadh電流響應(yīng)變化值最大。因此，rgo的最適濃度為0.5%。

實施例2.第一階段反應(yīng)最適條件的確定

采用單因素試驗優(yōu)化反應(yīng)體系中加入ec降解酶的酶活。向含有8mmol/lec的溶液中分別加入6，8，10，12，14，16u/ml的ec降解酶，反應(yīng)1h后，調(diào)節(jié)ph10并加入50mmol/l丙酮酸鈉溶液和0.4mmol/lnadh溶液，采用修飾好的電極測定，記錄5min反應(yīng)時間內(nèi)nadh的電流響應(yīng)變化值。當(dāng)ec降解酶添加量為16u/ml時，電極電流響應(yīng)變化值最大，同時兼顧該酶的使用成本，確定ec降解酶的最適添加量為16u/ml。

采用單因素試驗優(yōu)化第一階段反應(yīng)時間。向含有8mmol/lec的溶液中加入16u/ml的ec降解酶，分別反應(yīng)0.5，1，1.5，2，3h后，調(diào)節(jié)ph10并加入50mmol/l丙酮酸鈉溶液和0.4mmol/lnadh溶液，采用修飾好的電極測定，記錄5min反應(yīng)時間內(nèi)nadh的電流響應(yīng)變化值。當(dāng)?shù)谝浑A段反應(yīng)時間為1h時，電極電流響應(yīng)變化值最大，因此第一階段最適反應(yīng)時間為1h。

實施例3.第二階段反應(yīng)最適條件的確定

在采用最適條件進(jìn)行第一階段反應(yīng)后，采用單因素試驗優(yōu)化第二階段反應(yīng)體系中nadh的添加濃度。第一階段反應(yīng)后的溶液調(diào)節(jié)ph10后分別加入濃度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.75，1.0mmol/l的nadh和50mmol/l丙酮酸鈉，用制備好的丙氨酸脫氫酶修飾絲網(wǎng)印刷電極進(jìn)行電流時間法測定，根據(jù)nadh響應(yīng)變化值的大小確定nadh最適濃度為0.5mmol/l。

采用單因素試驗優(yōu)化第二階段反應(yīng)體系中加入丙酮酸鈉的濃度。第一階段反應(yīng)后的溶液調(diào)節(jié)ph10后分別加入濃度為10,20,30,40,50,60mmol/l的丙酮酸鈉溶液和0.5mmol/l的nadh溶液，用制備好的丙氨酸脫氫酶修飾絲網(wǎng)印刷電極進(jìn)行電流時間法測定，根據(jù)nadh響應(yīng)變化值的大小確定最適丙酮酸鈉濃度為40mmol/l。

實施例4.模擬酒體系中ec含量的測定

為考察酒精對ec測定過程中酶活性的影響，配制了質(zhì)量濃度15%的酒精溶液作為模擬酒體系。將一定量的標(biāo)準(zhǔn)ec溶液加入到模擬酒中，得到三個ec濃度梯度，分別為5,30,60nmol/l，利用之前制備好的電極和優(yōu)化后的電化學(xué)檢測條件進(jìn)行測定，記錄nadh在反應(yīng)前后的電流響應(yīng)變化值。每個ec濃度檢測進(jìn)行四次平行試驗（n=4），利用上述繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得出模擬酒中ec含量，結(jié)果如表1所示。通過比較計算得出的ec濃度與實際加入的ec濃度，以及平行樣間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，驗證該方法檢測模擬酒中ec含量具有良好的精確度和準(zhǔn)確性。

表1檢測模擬酒樣品中ec的回收率以及相對標(biāo)準(zhǔn)差

實施例5.實際黃酒樣品中ec含量的測定

為了進(jìn)一步驗證該方法在測定實際黃酒等酒樣中ec含量時的準(zhǔn)確性，選用了市售某黃酒，采用商品化cleanertec專用固相柱（堿性硅藻土）對酒類樣品進(jìn)行前處理，萃取出其中的ec至待檢溶液體系，向其中加入16u/ml的ec降解酶反應(yīng)1h；再加入40mmol/l的丙酮酸鈉和0.5mmol/l的nadh，用制備的電極記錄nadh在反應(yīng)前后的電流響應(yīng)變化值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可換算出了該黃酒樣品中的ec濃度為0.823μmol/l。進(jìn)而用傳統(tǒng)的gc-ms標(biāo)準(zhǔn)方法對該酒樣測定，得到ec濃度為0.874μmol/l，證明該方法具有較高的準(zhǔn)確性。