本發(fā)明實施例涉及生物電探測技術領域，尤其涉及一種基于光激發(fā)掃描探針的細胞電生理探測方法、裝置和系統。

背景技術：

生物電在植物生長生命活動中發(fā)揮重要作用，電信號對植物的許多生理活動都會產生重要影響，細胞間通過電信號傳導信息是植物信息傳導的基本方式之一?？茖W家在生物電產生機制的研究中發(fā)現了細胞生物膜對離子通透性的變化。離子通道由細胞產生的特殊蛋白質構成，它們聚集起來并鑲嵌在細胞膜上。離子通道的活性對實現細胞各種功能具有重要意義。細胞膜上離子通道的功能，除了可以調節(jié)細胞內外的滲透壓，也是維持細胞膜電位的重要分子，而細胞要進行電訊號傳導，便是靠離子的進出以造成膜電位的變化。激光作用可顯著影響視蛋白光敏離子通道穩(wěn)態(tài)激活和失活過程。弱光作用光敏離子通道細胞膜可以改變電壓門控離子通道特性，從而影響動作電位的形成和發(fā)放，調節(jié)生理功能。目前對光敏離子通道的探測方法尚缺乏，能同時獲取細胞膜光激發(fā)生物電信號和細胞膜蛋白高精度結構的技術手段尚不足。

傳統研究細胞膜電特性和離子通道性能的方法包括：膜片鉗技術、通道蛋白分離純化等生化技術、人工膜離子通道重建技術及一些物理和化學技術。應用膜片鉗技術可以直接觀察和分辨光敏離子通道或光色素調控離子通道電流及其開閉時程，但是無法實時探測細胞膜納米結構形貌，不能同時獲取細胞膜納米尺度的結構信息和電特性。

技術實現要素：

本發(fā)明提供一種基于光激發(fā)掃描探針的細胞電生理探測方法、裝置和系統，以實現在樣品表面探測納米尺度形貌的同時，實時獲取細胞膜離子通道光激發(fā)電信號。

第一方面，本發(fā)明實施例提供了一種基于光激發(fā)掃描探針的細胞電生理探測方法，該方法包括：

驅動掃描探針的導電針尖與位于樣品基底之上的細胞膜樣品接觸，采用激光光源激發(fā)所述細胞膜樣品，使得所述細胞膜樣品獲得光電特性響應；

通過所述導電針尖對所述細胞膜樣品外加激勵電信號；

采用所述掃描探針記錄所述細胞膜樣品在光激發(fā)和外加激勵電信號下的離子通道形貌和光電響應電信號。

優(yōu)選地，采用所述掃描探針記錄所述細胞膜樣品在光激發(fā)和外加激勵電信號下的離子通道形貌和電信號具體包括：采用所述掃描探針掃描探測所述細胞膜樣品在光激發(fā)條件下的離子通道形貌，采用所述掃描探針探測所述細胞膜樣品在光激發(fā)條件下的離子通道的光電響應電信號；

采用所述掃描探針記錄所述細胞膜樣品在光激發(fā)和外加激勵電信號下的離子通道形貌和光電響應電信號之后，還包括：根據離子通道形貌生成細胞膜樣品的離子通道形貌圖，根據各離子通道的光電響應電信號生成細胞膜樣品的光電響應電信號分布圖。

優(yōu)選地，采用激光光源激發(fā)所述細胞膜樣品具體包括：調控激光光源的激光波長和強度，采用不同波長和不同強度的激光激發(fā)所述細胞膜樣品；采用所述掃描探針記錄所述細胞膜樣品在光激發(fā)和外加激勵電信號下的離子通道形貌和光電響應電信號具體包括：采用所述掃描探針記錄所述細胞膜樣品在不同波長和不同強度的激光激發(fā)下的離子通道形貌和光電響應電信號。

優(yōu)選地，采用所述掃描探針記錄所述細胞膜樣品在光激發(fā)和外加激勵電信號下的離子通道形貌和光電響應電信號之后，還包括：

根據所述細胞膜樣品的離子通道形貌和光電響應電信號，驅動所述導電針尖定位于細胞膜樣品的離子通道定點，改變所述激光光源的波長和/或強度，采用掃描探針記錄細胞膜樣品的離子通道定點在不同的波長和/或強度的激光激發(fā)下的局域光電響應電信號變化。

優(yōu)選地，采用所述掃描探針記錄所述細胞膜樣品在光激發(fā)和外加激勵電信號下的離子通道形貌和光電響應電信號之后，還包括：

改變細胞膜樣品環(huán)境，探測細胞膜樣品在不同環(huán)境條件下的光電響應電信號變化，生成不同環(huán)境條件下的離子通道形貌圖像和光電響應電信號圖像；或

根據所述細胞膜樣品的離子通道形貌和光電響應電信號，驅動所述導電針尖定位于細胞膜樣品的單個離子通道，改變細胞膜樣品環(huán)境，采用掃描探針觀測細胞膜樣品的單個離子通道在不同環(huán)境條件下的光電響應電信號變化。

第二方面，本發(fā)明實施例還提供了一種基于光激發(fā)掃描探針的細胞電生理探測裝置，該裝置包括：

掃描探針驅動模塊，用于驅動掃描探針的導電針尖與位于樣品基底之上的細胞膜樣品接觸；

光激發(fā)執(zhí)行模塊，用于采用激光光源激發(fā)所述細胞膜樣品，使得所述細胞膜樣品獲得光電特性響應；

外加電信號執(zhí)行模塊，用于通過所述導電針尖對所述細胞膜樣品外加激勵電信號；

形貌和光電響應電信號記錄執(zhí)行模塊，用于采用所述掃描探針記錄所述細胞膜樣品在光激發(fā)下的離子通道形貌和光電響應電信號。

優(yōu)選地，所述光激發(fā)執(zhí)行模塊具體用于：調控激光光源的激光波長和強度，采用不同波長和強度的激光激發(fā)細胞膜樣品；所述形貌和電信號記錄執(zhí)行模塊具體用于：采用所述掃描探針記錄所述細胞膜樣品在不同波長和強度的激光激發(fā)下的離子通道形貌和光電響應電信號。

優(yōu)選地，該裝置還包括：定點電信號記錄執(zhí)行模塊，用于根據所述細胞膜樣品的離子通道形貌和光電響應電信號，驅動所述導電針尖定位于細胞膜樣品的離子通道定點，改變所述激光光源的波長和/或強度，采用掃描探針記錄細胞膜樣品的離子通道定點在不同的波長和/或強度的激光激發(fā)下的局域光電響應電信號變化。第三方面，本發(fā)明實施例還提供了一種基于光激發(fā)掃描探針的細胞電生理探測系統，包括掃描探針，還包括激光光源和第二方面所述的裝置，所述裝置分別連接所述掃描探針和激光光源，所述掃描探針的導電針尖位于激光光源發(fā)射的激光的中心。

優(yōu)選地，該系統還包括樣品室，所述細胞膜樣品、掃描探針與樣品基底均位于所述樣品室，所述樣品室與水氣泵相連，所述水氣泵可將水蒸氣泵入樣品室；所述樣品室內設置有控溫元件。

本發(fā)明提供的基于光激發(fā)掃描探針的生理探測細胞膜電特性和離子通道的方法、裝置和系統，可以直接在樣品表面探測納米尺度形貌的同時，實時獲取細胞膜的通道電流及電學特性，并且不破壞樣品結構和性質。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例一中的一種基于光激發(fā)掃描探針的細胞電生理探測方法流程圖；

圖2是本發(fā)明實施例二中的一種基于光激發(fā)掃描探針的細胞電生理探測方法流程圖；

圖3是本發(fā)明實施例三中的一種基于光激發(fā)掃描探針的細胞電生理探測方法流程圖；

圖4是本發(fā)明實施例四中的一種基于光激發(fā)掃描探針的細胞電生理探測裝置結構示意圖；

圖5是本發(fā)明實施例五中的一種基于光激發(fā)掃描探針的細胞電生理探測裝置結構示意圖；

圖6是本發(fā)明實施例六中的一種基于光激發(fā)掃描探針的細胞電生理探測裝置結構示意圖；

圖7是本發(fā)明實施例七中的一種基于光激發(fā)掃描探針的細胞電生理探測系統結構示意圖；

圖8是本發(fā)明實施例七中的另一種基于光激發(fā)掃描探針的細胞電生理探測系統結構示意圖；

圖9是本發(fā)明實施例七中的另一種基于光激發(fā)掃描探針的細胞電生理探測系統結構示意圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明?？梢岳斫獾氖?，此處所描述的具體實施例僅僅用于解釋本發(fā)明，而非對本發(fā)明的限定。另外還需要說明的是，為了便于描述，附圖中僅示出了與本發(fā)明相關的部分而非全部結構。

實施例一

圖1為本發(fā)明實施例一提供的一種基于光激發(fā)掃描探針的細胞電生理探測方法的流程圖，本實施例可適用于細胞電特性和離子通道探測的情況，例如，水稻葉片細胞電學特性和離子通道探測，農作物/植物光敏色素對細胞離子通道和質子泵的調控機制，視蛋白光敏離子通道，表達有視蛋白的神經元細胞能被特異性地激活，研究神經元細胞之間信息交流機制，繪制神經網絡等，該方法可以由基于光激發(fā)掃描探針的細胞電生理探測裝置來執(zhí)行，該裝置可以由硬件和/或軟件來實現，例如可以為集成在掃描探針顯微系統的控制部件或控制程序。如圖1所示，該方法包括：

步驟s110、驅動掃描探針的導電針尖與位于樣品基底之上的細胞膜樣品接觸。

其中，細胞膜樣品位于樣品基底之上，掃描探針位于細胞膜上方，驅動掃描探針的導電針尖與細胞膜樣品的與樣品基底相對的一側接觸。

步驟s120、采用激光光源激發(fā)所述細胞膜樣品，使得所述細胞膜樣品獲得光電特性響應。

其中，采用激光光源激發(fā)所述細胞膜樣品，使得所述細胞膜樣品獲得光電特性響應，細胞膜樣品的離子通道通的打開/閉合程度發(fā)生改變，離子通道形貌和電信號發(fā)生變化。

采用激光光源激發(fā)所述細胞膜樣品具體包括：采用激光激發(fā)樣品一定時間。不同細胞樣品獲得光電特性響應的時間受激光激發(fā)時間的影響，不同細胞膜樣品的離子通道打開所需要的激光激發(fā)時間不一樣，跟細胞膜樣品的光敏性能有關，有的對光激發(fā)很敏感，有的不太敏感。例如，細菌視紫紅質細胞膜只需要幾秒鐘。本領域技術人員可以根據需要選擇激光激發(fā)的時間，本發(fā)明對激光激發(fā)時間不作具體限定。

步驟s130、通過所述導電針尖對所述細胞膜樣品外加激勵電信號；

步驟s130、采用所述掃描探針記錄所述細胞膜樣品在光激發(fā)和外加激勵電信號下的離子通道形貌和光電響應電信號。

其中，采用所述掃描探針記錄所述細胞膜樣品在光激發(fā)和外加激勵電信號下的離子通道形貌和電信號具體包括：采用所述掃描探針掃描探測所述細胞膜樣品在光激發(fā)下的離子通道形貌，采用所述掃描探針探測所述細胞膜樣品在光激發(fā)下的離子通道電信號。

此外，為了能更準確地記錄離子通道的電信號，還可以將離子通道的電信號通過前置放大器放大再進行記錄。

優(yōu)選地，采用所述掃描探針記錄所述細胞膜樣品在光激發(fā)下的離子通道形貌和電信號之后，還包括：根據離子通道形貌生成細胞膜樣品的離子通道形貌圖，根據各離子通道電信號生成細胞膜樣品的電信號分布圖。

需要指出的是，步驟s110和步驟s120的順序可以對調，并不影響本發(fā)明的結果。

在上述技術方案的基礎上，采用激光光源激發(fā)所述細胞膜樣品具體包括：調控激光光源的激光波長和強度，采用不同波長和不同強度的激光激發(fā)所述細胞膜樣品；所述采用所述掃描探針記錄所述細胞膜樣品的離子通道形貌和電信號具體包括：采用所述掃描探針記錄所述細胞膜樣品在不同波長和不同強度的激光激發(fā)下的離子通道形貌和電信號。

因為不同光敏蛋白具有不同的光色敏感性，有的對藍光敏感，有的對綠光敏感，有的對紅光敏感。例如，視錐細胞中的視蛋白根據其吸收光譜范圍的不同可進一步分為長波長視蛋白、中波長視蛋白、短波長視蛋白等。l型視錐細胞、m型視錐細胞和s型視錐細胞的敏感峰值分別為565nm、535nm和440nm。對他們進行探測時，波長分別選擇為敏感峰值，即565nm、535nm和440nm。激光強度可從1mw到100mw可調節(jié)，根據光激發(fā)電流的大小適當調節(jié)光強。

采用不同波長和不同強度的激光激發(fā)所述細胞膜樣品的好處是可以探測各種不同的光敏蛋白，可以探測不同蛋白相對應的光敏電流和光敏特性。本領域技術人員可以根據需要選擇激光的波長和強度，本發(fā)明對激光的波長和強度不作具體限定。

本實施例的基于光激發(fā)掃描探針的細胞電生理探測方法，能同時探測細胞膜離子通道電特性和離子通道納米尺度三維形貌，并且不破壞樣品結構和性質。

實施例二

請參考圖2，圖2是本發(fā)明實施例二提供的一種基于光激發(fā)掃描探針的細胞電生理探測方法的流程圖。本實施例以上述實施例方案為基礎，進行了優(yōu)化改進，特別是提供了定點探測的具體方案。如圖2所示，該方法包括：

步驟s210、驅動掃描探針的導電針尖與位于樣品基底之上的細胞膜樣品接觸。

步驟s220、采用激光光源激發(fā)所述細胞膜樣品，使得所述細胞膜樣品獲得光電特性響應。

步驟s230、通過所述導電針尖對所述細胞膜樣品外加激勵電信號。

步驟s240、采用所述掃描探針記錄所述細胞膜樣品在光激發(fā)和外加激勵電信號下的離子通道形貌和電信號。

步驟s250、根據所述細胞膜樣品的離子通道形貌和光電響應電信號，驅動所述導電針尖定位于細胞膜樣品的離子通道定點，改變所述激光光源的波長和/或強度，采用掃描探針記錄細胞膜樣品的離子通道定點在不同的波長和/或強度的激光激發(fā)下的局域光電響應電信號變化。

其中，驅動所述導電針尖定位于細胞膜樣品的離子通道定點，改變所述激光光源的波長和/或強度，采用掃描探針探測細胞膜樣品的離子通道定點在不同的波長和/或強度的激光激發(fā)下的局域電信號，從而根據在不同的波長和/或強度的激光激發(fā)下的局域電信號，獲得細胞膜樣品的離子通道電特性曲線。

本實施例采用的是接觸式掃描和定點探測相結合的探測模式。接觸式掃描，利用導電針尖掃描探測細胞膜樣品離子通道形貌和電信號；定點探測，根據離子通道形貌和電信號，利用針尖定位于掃描的樣品中的離子通道定點，對離子通道的局域電流進行測量和成像。從而可以直接在樣品表面探測納米尺度形貌的同時，實時獲取細胞膜的通道電流及電學特性，并且不破壞樣品結構和性質。

實施例三

請參考圖3，圖3是本發(fā)明實施例三提供的一種基于掃描探針的細胞電生理探測方法的流程圖。本實施例以上述實施例方案為基礎，進行了優(yōu)化改進，特別是提供了改變樣品環(huán)境進行掃描探測或定點探測的具體方案。如圖3所示，該方法包括：

步驟s310、驅動掃描探針的導電針尖與位于樣品基底之上的細胞膜樣品接觸。

步驟s320、采用激光光源激發(fā)所述細胞膜樣品，使得所述細胞膜樣品獲得光電特性響應。

步驟s330、通過所述導電針尖對所述細胞膜樣品外加激勵電信號。

步驟s340、采用所述掃描探針記錄所述細胞膜樣品在光激發(fā)下的離子通道形貌和光電響應電信號。

步驟s350、改變細胞膜樣品環(huán)境，探測細胞膜樣品在不同環(huán)境條件下的光電響應電信號變化，生成不同環(huán)境條件下的離子通道形貌圖像和光電響應電信號圖像；或

根據所述細胞膜樣品的離子通道形貌和光電響應電信號，驅動所述導電針尖定位于細胞膜樣品的單個離子通道，改變細胞膜樣品環(huán)境，采用掃描探針觀測細胞膜樣品的單個離子通道在不同環(huán)境條件下的光電響應電信號變化。

其中，改變細胞膜樣品環(huán)境包括藥物、濕度、或溫度等，一方面，通過導電針尖掃描探測細胞膜樣品在不同環(huán)境條件下的光電響應電信號變化，生成不同環(huán)境條件下的離子通道形貌圖像和光電響應電信號圖像，此時獲得的是細胞膜樣品整體或某個區(qū)域的離子通道形貌圖像和光電響應電信號圖像；另一方面，驅動所述導電針尖定位于細胞膜樣品的單個離子通道，以觀測單個離子通道在不同環(huán)境條件下的光電響應電信號變化，此時獲得的是細胞膜樣品單個離子通道光電響應電信號變化。

通過各離子通道開放的電信號，可直接得到各離子通道開放的電信號幅值分布、開放幾率、和開放壽命分布等功能參量，在此基礎上還可以并分析功能參量與膜電位、離子濃度等之間的關系。

本實施例采用的是接觸式掃描和定點探測相結合的探測模式，可以直接在樣品表面探測納米尺度形貌的同時，實時獲取細胞膜的通道電流及電學特性，并且不破壞樣品結構和性質。

以下是本發(fā)明具體實施方式中提供的一種基于光激發(fā)掃描探針的細胞電生理探測裝置的實施例，裝置的實施例基于上述的方法的實施例實現，在裝置中未盡的描述，請參考前述方法的實施例。

實施例四

請參考圖4，圖4是本發(fā)明第四實施例提供的一種基于光激發(fā)掃描探針的細胞電生理探測裝置的結構示意圖。如圖4所示，該裝置1包括：

掃描探針驅動模塊101，用于驅動掃描探針的導電針尖與位于樣品基底之上的細胞膜樣品接觸；

光激發(fā)執(zhí)行模塊102，用于采用激光光源激發(fā)所述細胞膜樣品，使得使得所述細胞膜樣品獲得光電特性響應；

外加電信號執(zhí)行模塊103，用于通過所述導電針尖對所述細胞膜樣品外加激勵電信號；

形貌和光電響應電信號記錄執(zhí)行模塊104，用于采用所述掃描探針記錄所述細胞膜樣品在光激發(fā)下的離子通道形貌和電信號。

進一步地，所述光激發(fā)執(zhí)行模塊102具體用于：調控激光光源的激光波長和強度，采用不同波長和強度的激光激發(fā)細胞膜樣品；所述形貌和光電響應電信號記錄執(zhí)行模塊104具體用于：采用所述掃描探針記錄所述細胞膜樣品在不同波長和強度的激光激發(fā)下的離子通道形貌和電信號。

本實施例各模塊之間相互聯系實現接觸式掃描探測，可以直接在樣品表面探測納米尺度形貌的同時，實時獲取細胞膜的通道電流及電學特性，并且不破壞樣品結構和性質。

實施例五

實施例五以實施例四的方案為基礎，進行了優(yōu)化改進，特別是提供了定點探測的方案，與實施例四不同之處僅在于多了定點形貌和電信號記錄執(zhí)行模塊104。如圖5所示，該裝置1還包括：

定點電信號記錄執(zhí)行模塊105，用于根據所述細胞膜樣品的離子通道形貌和光電響應電信號，驅動所述導電針尖定位于細胞膜樣品的離子通道定點，改變所述激光光源的波長和/或強度，采用掃描探針記錄細胞膜樣品的離子通道定點在不同的波長和/或強度的激光激發(fā)下的局域光電響應電信號變化。

實施例六

實施例六以實施例四或五的方案為基礎，進行了優(yōu)化改進，特別是提供了改變樣品環(huán)境進行掃描探測或定點探測的方案，不同之處僅在于多了單個環(huán)境控制下的信號探測模塊106。如圖6所示，該裝置1還包括：

環(huán)境控制下的信號探測模塊106，用于：

改變細胞膜樣品環(huán)境，探測細胞膜樣品在不同環(huán)境條件下的光電響應電信號變化，生成不同環(huán)境條件下的離子通道形貌圖像和光電響應電信號圖像；或

根據所述細胞膜樣品的離子通道形貌和光電響應電信號，驅動所述導電針尖定位于細胞膜樣品的單個離子通道，改變細胞膜樣品環(huán)境，采用掃描探針觀測細胞膜樣品的單個離子通道在不同環(huán)境條件下的光電響應電信號變化。

實施例五和六的各模塊之間相互聯系實現接觸式掃描和定點探測相結合的探測模式，可以直接在樣品表面探測納米尺度形貌的同時，實時獲取細胞膜的通道電流及電學特性，并且不破壞樣品結構和性質。

實施例七

請參考圖7-9，圖7-9是本發(fā)明第七實施例提供的一種光激發(fā)基于掃描探針的細胞電生理探測系統的結構示意圖。如圖7和圖9所示，該系統包括：上述實施例四-六任一所述的裝置1、掃描探針2、和激光光源3，所述裝置1分別連接所述掃描探針2和激光光源3，所述掃描探針2的導電針尖位于激光光源3發(fā)射的激光的中心。

具體的，所述掃描探針1的控制端連接所述裝置1，所述掃描探針1在所述裝置1的驅動下移動，與細胞膜樣品接觸，掃描記錄探測細胞膜樣品在光激發(fā)下的離子通道形貌和電信號。

掃描探針的針尖為導電探針，本體結構為二氧化硅或氮化硅材料，針尖涂覆導電層，導電層為金膜、鉻、鈦、鉑銥復合薄膜等。

激光光源3包括激光波長和光強度可調節(jié)的激光發(fā)生器和直角三角棱鏡。激光從激光發(fā)生器水平出射，通過三角棱鏡反射轉向90度豎直向上射向細胞膜樣品6。所述激光光源3的激光發(fā)生器的控制端連接所述裝置1。所述激光光源3用于激發(fā)細胞膜樣品的光電特性響應。所述激光光源3在所述裝置1的控制下打開或關閉，調整激光波長和強度。為了能夠使激光豎直向上射向細胞膜樣品6，放置所述細胞膜樣品6的樣品基底7為透光石墨基底。

在上述實施例的技術方案的基礎上，如圖8和圖9所示，所述系統還包括水氣泵4、控溫元件5和樣品室8，所述掃描探針2、細胞膜樣品6、與樣品基底7均位于所述樣品室8，所述樣品室8與水氣泵4相連，所述水氣泵4可將水蒸氣泵入所述樣品室8；所述樣品室8內設置有控溫元件5。水氣泵4和控溫元件5的控制端分別連接所述裝置1，在所述裝置1的驅動下改變細胞樣品環(huán)境。

具體的，所述樣品室8為帶水汽出口和水汽入口的密封裝置，水汽入口與水氣泵4相連，水氣泵4可將水蒸氣泵入樣品室8中調節(jié)濕度，保持待測細胞膜的生物活性?？販卦?為半導體制冷元件，控制樣品溫度保持在10度以下的低溫環(huán)境中，保持待測生物膜的生物活性。

上述產品可執(zhí)行本發(fā)明任意實施例所提供的方法，具備執(zhí)行方法相應的功能模塊和有益效果。

注意，上述僅為本發(fā)明的較佳實施例及所運用技術原理。本領域技術人員會理解，本發(fā)明不限于這里所述的特定實施例，對本領域技術人員來說能夠進行各種明顯的變化、重新調整和替代而不會脫離本發(fā)明的保護范圍。因此，雖然通過以上實施例對本發(fā)明進行了較為詳細的說明，但是本發(fā)明不僅僅限于以上實施例，在不脫離本發(fā)明構思的情況下，還可以包括更多其他等效實施例，而本發(fā)明的范圍由所附的權利要求范圍決定。