專利名稱：細胞電生理集成芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及細胞生理學(xué)，細胞傳感器以及集成芯片技術(shù)，具體涉 及一種細胞電生理集成芯片。
技術(shù)背景傳統(tǒng)的神經(jīng)電生理檢測基本采用微電極進行細胞內(nèi)記錄，或者應(yīng)用膜片鉗(patch damp)技術(shù)，將內(nèi)裝電極的玻璃毛細管緊貼于細胞膜，在吸 破細胞膜后進行全細胞記錄。微電極和膜片鉗所存在的問題主要在于用 微電極刺入細胞或者鉗制細胞，都會對細胞造成一定的損害，并導(dǎo)致細胞 在很短的時間內(nèi)死亡，限制了對動作電位以及離子通道電流記錄的實時檢 測；同時，可供選擇采集信號的細胞數(shù)較少，并且難以確定突觸的確切位 置，所記錄到的信號難以具有代表性；另外，由于技術(shù)上的限制，膜片鉗 技術(shù)目前仍難以實現(xiàn)對多個神經(jīng)元進行同步測量。胞外信號檢測方法由于 可以實現(xiàn)無損，長時程的測量而受到越來越多的關(guān)注，但是，在進行細胞 生理實驗時，對單一參數(shù)的監(jiān)測往往只能從某一方面反映出細胞的生理活 動，而測試環(huán)境的復(fù)雜性(各種噪聲源、長期測試后培養(yǎng)液對電極的腐蝕 等)會干擾測試的結(jié)果，所以對細胞生理活動的機理的揭示則需要同時對 多種相關(guān)的生理參數(shù)進行綜合分析才能完成。目前，現(xiàn)有儀器或器件功能 單一，指標不夠穩(wěn)定(信噪比較低，參考對照方法較少)，且不能實現(xiàn)多 參數(shù)同時檢測，成為快速細胞生理分析發(fā)展的瓶頸。 發(fā)明內(nèi)容本實用新型的目的在于它提供一種細胞電生理集成芯片，將細胞生化 參數(shù)和電生理參數(shù)檢測集成于一體，克服細胞生理參數(shù)的同時測試的難題。為達到上述目的，本實用新型采用的技術(shù)方案如下 1、 一種細胞電生理集成芯片在S i基底正面中間集成ME A微電極陣列，在ME A微電極陣列兩側(cè)分別 集成IDA叉指電極和LAPS光尋址電位傳感器，在MEA微電極陣列另外 兩側(cè)分別對稱設(shè)置參考電極。所述的IDA叉指電極為梳狀的叉指電極對，單個叉指電極中間為暴露出的Au電極以及下面Cr黏附層，周圍高出部分為SK)2或SisN4絕緣 保護層，下面依次分別為SiCb層和Si基底。所述的MEA微電極陣列為6排正方形電極孔陣列，單個微電極結(jié)構(gòu) 與前所述IDA叉指電極的單個叉指電極結(jié)構(gòu)相同。所述的LAPS光尋址電位傳感器結(jié)構(gòu)分為4層，依次分別為Si3N4層， Si02層，Si基底以及Al層。2、 一種細胞電生理集成芯片的制作方法MEA微電極陣列制備過程為采用標準半導(dǎo)體制作工藝，先濺射 300nm的Au到硅片基底上，再采用剝離技術(shù)形成Au電極，為了和絕緣 層貼合需加一層30nm的Ti、 Cr或Ni層，最后做Si3N4或聚酰亞胺絕緣 保護層，并蝕刻出電極孔；IDA叉指電極制備過程為采用多層光刻工藝加工電極，電極表面 的叉指對為暴露出的Au電極，引線部分除了焊盤外均覆蓋由等離子體氣 相沉積技術(shù)形成的Si02的絕緣層，并刻蝕出有效細胞貼附區(qū)；LAPS光尋址電位傳感器制備過程為在Si基片上采用深法刻蝕技 術(shù)將LAPS區(qū)域的氧化層干法刻蝕掉，然后采用等離子體氣相沉積技術(shù)先 后生長一層Si02層和SisN4層；將基底Si基片背面的氧化層用HF溶液 腐蝕掉，正面用光刻膠進行保護；然后在硅片背面濺射一層Al層作歐姆 接觸，完成集成芯片LAPS光尋址電位傳感器的制作；參考電極制備過程為采用標準半導(dǎo)體制作工藝，先濺射300nm的 Au到硅片基底上，再采用剝離技術(shù)形成金電極，為了和絕緣層貼合需加 一層30nm的Ti、 Cr或Ni層，最后做Si3N4或聚酰亞胺絕緣保護層，并 蝕刻出參考電極。在集成芯片上分別集成了微電極陣列傳感器(microelectrode array, MEA),光尋址電位傳感器(light-addressable potentiometric sensor,LAPS) 和叉指型細胞—阻抗傳感器(interdigital sensor, IDA)三種傳感器。集成 芯片各部分同時工作，通過表面處理在集成芯片上培養(yǎng)了心肌細胞、嗅覺 細胞等具有電生理活性的細胞，配合流動注射技術(shù)連續(xù)監(jiān)測細胞從正常生 理狀態(tài)到藥物刺激下的形態(tài)變化、動作電位以及代謝物質(zhì)的改變。本實用新型具有的有益效果是 本集成芯片能同時檢測細胞在器件上的貼壁生長狀態(tài)，動作電位及細胞新 陳代謝產(chǎn)物中多種離子的濃度，用于實現(xiàn)多參數(shù)的同時并行檢測，解決了集成細胞傳感器芯片設(shè)計、加工的核心技術(shù)難題，為集成化細胞傳感器技術(shù)的便攜化及儀器化發(fā)展拓展了新的應(yīng)用領(lǐng)域。


圖1是本實用新型的集成芯片裝配圖；圖2是本實用新型的集成芯片的結(jié)構(gòu)圖；圖3是本實用新型的MEA和IDA芯片的剖面結(jié)構(gòu)圖；圖4是本實用新型的LAPS芯片的剖面結(jié)構(gòu)圖；圖5是本實用新型的系統(tǒng)連接示意圖；圖6是本實用新型的微電極陣列(直徑30pm)在PBS溶液中的器件 穩(wěn)定性測試圖；圖7是本實用新型的微電極器件沒有細胞耦合的電極噪聲輸出； 圖8是本實用新型的微電極器件培養(yǎng)心肌細胞后，在藥物作用下的響 應(yīng)信號；圖9是本實用新型的IDA電極與細胞的耦合示意圖；圖10是本實用新型的貼有腎細胞的器件隨時間的阻抗相對變化率圖；圖11是本實用新型的p型Si3N4 LAPS器件于不同pH溶液下的i-V 特性曲線；圖12是本實用新型的p型Si3N4 LAPS器件于不同pH溶液下的pH 值和偏壓的對應(yīng)變化曲線；圖13是本實用新型的p型Si3N4LAPS片測試的3種pH溶液在6個 不同頻率下測試的I-V曲線的靈敏度。圖中1、 PCB底座，2、集成芯片，2.1、 IDA叉指電極，2丄1、 Si 基底，2.1.2、 Si02， 2.1.3、 Si02或Si3N4絕緣保護層，2.1.4、 Cr黏附層， 2丄5、 Au電極，2.2、 MEA微電極陣列，2.3、 LAPS光尋址電位傳感器， 2.3.1、 Al層，2.3.2、 Si02層，2.3.3、 813>14層，2.4、參考電極，3、腔體 槽，4、密封蓋。
具體實施方式
以下結(jié)合附圖和實施例對本實用新型作進一步說明。 如圖2所示，本實用新型是在Si基底2正面中間集成MEA微電極 陣列2.2，在MEA微電極陣列2.2兩側(cè)分別集成IDA叉指電極2.1和LAPS 光尋址電位傳感器2.3，在MEA微電極陣列2.2另外兩側(cè)分別對稱設(shè)置參考電極2.4。如圖3所示，所述的叉指電極2.1為梳狀的叉指電極對，單個叉指電 極中間為暴露出的Au電極2丄5以及下面Cr黏附層2丄4，周圍高出部 分為Si02或Si3N4絕緣保護層2.1.3，下面依次分別為SiCb層2丄2和Si 基底2.1.1。如圖2所示，所述的MEA微電極陣列2.2為6排正方形電極孔陣列， 單個微電極結(jié)構(gòu)與前所述IDA叉指電極2.1的單個叉指電極結(jié)構(gòu)相同。 如圖4所示，所述的LAPS光尋址電位傳感器2.3結(jié)構(gòu)分為4層，依次分 別為Si;jN4層2.3.3， SiCb層2.3.2， Si基底2.1.1以及Al層2.3.1 。l.芯片制備(1) ME A微電極陣列器件的制備 MEA器件設(shè)計成6排等間距陣列，過多的電極將造成引線困難和干擾的 增大，寄生效應(yīng)的增加，以及多路并行分析技術(shù)的復(fù)雜性。間距設(shè)置應(yīng)該 既能監(jiān)測細胞網(wǎng)絡(luò)，又不對周圍細胞起到干擾作用。電極邊長分別為 70^im， 50pm和3(^m，適用于各種尺度的細胞培養(yǎng)。同時，不同的電極 直徑易于進行電學(xué)特性仿真，判斷幾何尺寸對于細胞動作電位和電生理的 影響。在制作過程中，本方法采用標準半導(dǎo)體制作工藝，步驟簡述為濺 射300nm的Au到硅基底上，采用剝離技術(shù)形成金電極，為了和絕緣層貼 合需加一層30nm的Ti、 Cr或Ni。最后做Si3N4或聚酰亞胺等絕緣保護 層，并蝕刻出電極孔。(2) IDA叉指電極器件的制備-叉指電極對的數(shù)量選擇中，如果叉指電極對數(shù)量過少，則自身的體阻 抗較大，且大大降低了細胞與其貼附的概率；如果叉指電極對數(shù)量過多， 雖然體阻抗會降低，且增大了電極與細胞接觸的有效面積，但由于電極并 聯(lián)的關(guān)系，檢測靈敏度也會相應(yīng)降低。電極的寬度應(yīng)與細胞尺度相近，且 叉指對選擇的數(shù)目合適，總體設(shè)計原則是在保證器件較小體阻抗的情況下 提高測試的精度。叉指電極的基底一般為玻璃或硅基底。在本方法中，為 了考慮多個傳感單元的集成芯片并行設(shè)計，采用了硅基底。目前，IDA 的有效電極區(qū)面積為4 25mn^左右，本方法設(shè)計的有效電極面積為8.4 mm2。其中，單個叉指電極的寬度和間距均為50pm，長度為7mm，所加 工的IDA電極由12對微帶電極組成。采用多層光刻工藝加工電極時，電 極表面的叉指對為暴露出的金電極，引線部分除了焊盤外均覆蓋了 Si02絕緣層，同時暴露出面積為8.4mn^的有效細胞貼附區(qū)。 (3) LAPS光尋址電位傳感器器件的制備集成芯片上的LAPS光尋址電位傳感器制備工藝步驟為(l)在基片上光刻 出LAPS區(qū)域；(2)由于在制作MEA與IDA單元時采用PECVD沉積了 500nm 厚的Si02層，所以LAPS單元需要將該部分氧化層去除，采用深法刻蝕技術(shù)將 該部分氧化層干法刻蝕掉。(3)在LAPS區(qū)域采用等離子氣相沉積先后生長一層 30nm的Si02層和60nm的SigN4層；(4)將基底硅片背面的氧化層用HF溶液腐 蝕掉，正面用光刻膠進行保護，避免將正面圖形破壞；然后在硅片背面濺射一 層0.2(im厚的A1層作歐姆接觸，完成LAPS光尋址電位傳感器的制作。在集 成芯片2完成制作后，將其粘在制作好的PCB底座1上，然后將腔體槽3蓋 在集成芯片2上，暴露出三個傳感器測量區(qū)域，最后加上密封蓋4，完成裝配， 如圖1所示。芯片測試系統(tǒng)的連接示意圖如圖5所示。2.集成芯片測試(1) .使用聚丙二甲基硅氧垸(PDMS)膜將各單元分隔，單元間通過 寬度100pm的微通道相連，并用密封墊圈等形成密封細胞測試腔，在芯 片上培養(yǎng)具有電活性的細胞，并將培養(yǎng)液和藥物按順序流過測試單元。培 養(yǎng)液或藥物首先流過IDA單元，通過電阻抗測試細胞在培養(yǎng)液或藥物環(huán) 境下的生長狀況，然后流入中間的MEA區(qū)域，進行細胞動作電位的檢測； 最后進入LAPS區(qū)域進行代謝產(chǎn)物中各種離子的濃度變化檢測，通過檢測 細胞在器件上的貼壁生長狀態(tài)，動作電位以及細胞新陳代謝產(chǎn)物中多種離 子的濃度，用于實現(xiàn)多參數(shù)的同時并行檢測。(2) .選材心肌細胞實驗取1 3天齡的小鼠，用70%乙醇消毒。剪 開胸壁，取心室肌。用PBS沖洗三次。將心室肌剪成lmmS左右的小塊。 消化、離心后，用培養(yǎng)液懸浮沉淀細胞，調(diào)整細胞濃度至5xl()S個/ml， 接種到集成芯片表面的培養(yǎng)腔中。根據(jù)細胞生長情況，每隔2 3天換液(3) .選材嗅覺細胞將新生乳鼠剪取鼠頭，取下嗅球，置于PBS液中， 在解剖顯微鏡下剝離被膜并剪成1 mr^左右的組織塊，在0.25%胰蛋白 酶37 °C中消化并于2 ml加有濃度為10 pg/l NGF的DMEM培養(yǎng)液吹打成 細胞懸液，接種于集成芯片表面的培養(yǎng)腔中，培養(yǎng)第3天滴加5-FU以抑 制膠質(zhì)細胞生長。培養(yǎng)7天后可進行檢測。(4) .為了促使細胞和器件的貼合，本方法采用的表面處理過程簡述如浸入含有100|ag/ml的多聚鳥氨酸的磷酸鹽緩沖液中 24h。沖洗后，再浸入含有8^ig/ml層粘素的磷酸鹽緩沖液中24h， 37°C， 5%002環(huán)境下。這層膜 4nm，因為多聚鳥氨酸和層粘素含有正電荷而 使心肌細胞等細胞粘附在器件上，同時還防止了硅片上Si02的水合。(5) .MEA器件特性測試 為了測試每個系統(tǒng)中通道是否工作良好，將MEA器件的培養(yǎng)腔內(nèi)注入pH 二7.3的PBS溶液，以直徑O.lmm的螺旋狀鉑絲作為對電極接地，選用 MEA器件上一排直徑均為3(Him的8個電極陣列，并行接入到8通道放 大器上。將器件浸浴在PBS溶液中，連續(xù)浸泡2d，觀察器件在PBS溶液 的連續(xù)浸泡下，輸出的噪聲變化情況?？梢钥闯?，在6h測量范圍內(nèi)，各 通道的輸入噪聲變化幅度不大可以看出每個通道的噪聲幅度波動不是很 大,基本保持在一定范圍內(nèi)，說明了系統(tǒng)8通道噪聲的量級大致相同(圖 6)。(6) .MEA細胞動作電位測試MEA器件經(jīng)表面處理后，可培養(yǎng)上團狀的心肌細胞。為了初步驗證基于 MEA的細胞芯片的可行性，我們選用PBS液配制10 pg/ml的去甲腎上腺 素(NE)，作為細胞的刺激底物。鑒于去甲腎上腺素可以引起心肌興奮性， 所以被選為心肌細胞的興奮性剌激底物，用以檢測MEA細胞芯片的敏感 性。將細胞在芯片上培養(yǎng)2d后，用顯微鏡觀察有細胞生長的電極并進行 編號。將未加入藥物的培養(yǎng)液泵入細胞培養(yǎng)測試腔，根據(jù)電極編號進行多 通道測試。在無細胞耦合的電極上，主要為一些環(huán)境噪聲和系統(tǒng)噪聲輸出， 該記錄信號可以看作是測試基線，如圖7中波形。泵入NE后，耦合有心肌細胞的電極得到如圖8波形所示的電位信號 改變即出現(xiàn)幅度大約為30 40pV的峰值改變，在ls內(nèi)出現(xiàn)2 3次搏 動，動作電位時程為200ms左右，細胞自發(fā)放電明顯。由于其余通道沒 有耦合上細胞，均為噪聲信號，所以不作記錄。對記錄得到的單個波形進 行分析得出，所測得信號有上升峰和下降峰，復(fù)極化時間較長。上升峰占 整個信號幅度的10% 30%左右，負向峰持續(xù)時間為100ms左右。該信 號與經(jīng)典的膜片鉗測量的波形不同，這主要與細胞一器件耦合情況、刺激、 細胞類型有很大關(guān)系。根據(jù)這種差異，有研究者針對記錄胞外電生理芯片 的特點已采集了大量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，認為胞外信號在芯片上測得的較長復(fù)極化時間可能是由于測量過程中的心肌細胞胞外C^+濃度的緩慢增 強以及細胞一芯片間的耦合層電容的逐漸放電過程所共同造成的。從研究結(jié)果得出，心肌細胞對于藥物的刺激響應(yīng)表現(xiàn)在細胞放電頻率 和幅度的改變，腎上腺素會影響細胞放電過程，這個結(jié)果同膜片鉗電生理 研究的諸多結(jié)果吻合，進一步驗證了 MEA細胞芯片應(yīng)用于細胞電生理研 究的可行性。(7) .IDA器件細胞貼壁性測試為測試在細胞貼壁培養(yǎng)后的細胞一阻抗變化影響，我們將腎細胞培養(yǎng)在叉 指電極上。由于腎細胞屬于貼壁性、繁殖力較強的細胞，在叉指電極上未進行表面處理，直接進行培養(yǎng)。經(jīng)2d培養(yǎng)后，腎細胞在叉指電極上生長 情況良好，細胞與器件的耦合示意圖如圖9所示。5-氟尿嘧啶(5-Fluororacil)是一種抗癌藥物，具有較強細胞毒性作 用，尤其會影響細胞自身新陳代謝，如糖代謝、氧代謝等。為了測試腎細 胞在給藥或物理性的傷害下細胞貼壁程度對阻抗的影響，本實驗在器件上 培養(yǎng)了腎細胞后，采用了濃度為lOOpg/mL的5-氟尿嘧啶注射液作用于培 養(yǎng)了腎細胞的多個叉指電極上，連續(xù)觀察系統(tǒng)的輸出阻抗值隨時間的變化 曲線。將培養(yǎng)2d的腎細胞從培養(yǎng)箱中取出后，分別選擇工作頻率于6kHz、 8kHz、 10kHz進行測試。對腎細胞在藥物刺激前，首先于室溫下(20°C) 靜置lh后進行掃頻阻抗測試；然后再隔lh加入100嗎/mL的5-氟尿嘧啶， 間隔lh進行掃頻阻抗測試，得到如圖10的時間一阻抗平均相對變化率曲 線(n = 5)。在曲線中，可以看出細胞于靜置狀態(tài)下lh內(nèi)阻抗的相對變 化率在6% 8%左右，說明溫度及C02等因素對細胞的貼壁性影響是較 大的，而在加藥后的lh內(nèi)在lOkHz下的阻抗相對變化率最大，達到8% 左右，這可能是由于細胞在藥物毒性的作用下凋亡或漂浮在溶液中造成 的，在后2h內(nèi)阻抗變化率在4%左右，阻抗變化已不太明顯，而在顯微 鏡下鏡檢時，這些細胞也從透明鼓起狀變?yōu)榘櫩s狀，說明藥物對細胞毒性 是較強的，在本實驗中所引起的阻抗變化率范圍在12% 16%左右，且 lOkHz是較好的工作點頻率。由于目前實驗結(jié)果只是初步的測試，應(yīng)進一 步將實驗結(jié)果定量化。當然，從以上實驗結(jié)果可看出，基于IDA的ECIS 阻抗器件作為一種評價細胞生理狀態(tài)的器件是具有顯著意義的。(8) . LAPS器件的測試為了對LAPS的H標準曲線進行測試，我們?nèi)型Si3N4片LAPS測量四 種不同pH的標準溶液的I-V曲線(pH6 pH9)，如圖11所示。將這四條S形 特征曲線的下降沿用最小二乘法對其進行線性回歸，可得出LAPS的線性工作 區(qū)為-1.5V 0.5V，取歸一化后的斜率在0.5處的點進行測試比較，發(fā)現(xiàn)傳感器 的靈敏度S為50.65mV/pH，即溶液pH變化一個單位，若光生電壓(電流) 要保持不變，偏置電壓需變化50.65mV。 pH的改變量和偏壓的對應(yīng)線性曲線 如圖12所示，線性度為0.9978，有良好的響應(yīng)曲線。由于整個線性區(qū)的范圍 大于700mV，所以可以測試14個pH變化范圍。在測量藥物的酸化率時，應(yīng) 固定偏置電壓在工作點，則當光生電壓上升50.65mV， pH減少一個單位。為直觀地比較在不同光源頻率下，LAPS上檢測不同pH值溶液的靈敏度， 本設(shè)計將3種pH溶液于6個頻率下測試同一 LAPS的響應(yīng)曲線靈敏度用柱狀 圖進行比較，如圖13所示，各個pH的靈敏度基本相近，但6kHz和8kHz左 右得到的結(jié)果較好，所以在考慮多光源對器件檢測時，所采用的頻率應(yīng)選擇在 該范圍內(nèi)能達到
權(quán)利要求1、一種細胞電生理集成芯片，其特征在于在Si基底(2.1.1)正面中間集成MEA微電極陣列(2.2)，在MEA微電極陣列(2.2)兩側(cè)分別集成IDA叉指電極(2.1)和LAPS光尋址電位傳感器(2.3)，在MEA微電極陣列(2.2)另外兩側(cè)分別對稱設(shè)置參考電極(2.4)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種細胞電生理集成芯片，其特征在于 所述的IDA叉指電極(2.1)為梳狀的叉指電極對，單個叉指電極中間為暴 露出的Au電極(2丄5)以及下面Cr黏附層(2丄4)，周圍高出部分為Si02 或Si3N4絕緣保護層(2丄3)，下面依次分別為Si02層(2丄2)和Si基底 (2丄1)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種細胞電生理集成芯片，其特征在于 所述的MEA微電極陣列(2.2)為6排正方形電極孔陣列，單個微電極結(jié)構(gòu) 與前所述IDA叉指電極(2.1)的單個叉指電極結(jié)構(gòu)相同。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種細胞電生理集成芯片，其特征在于 所述的LAPS光尋址電位傳感器(2.3)結(jié)構(gòu)分為4層，依次分別為SisN4層 (2.3.3)， Si02層(2.3.2)， Si基底(2.1.1)以及Al層(2.3.1)。
專利摘要本實用新型公開了一種細胞電生理集成芯片。在Si基底正面中間集成MEA微電極陣列，在MEA微電極陣列兩側(cè)分別集成IDA叉指電極和LAPS光尋址電位傳感器，在MEA微電極陣列另外兩側(cè)分別對稱設(shè)置參考電極。本集成芯片能同時檢測細胞在器件上的貼壁生長狀態(tài)，動作電位及細胞新陳代謝產(chǎn)物中多種離子的濃度，用于實現(xiàn)多參數(shù)的同時并行檢測，解決了集成細胞傳感器芯片設(shè)計、加工的核心技術(shù)難題，為集成化細胞傳感器技術(shù)的便攜化及儀器化發(fā)展拓展了新的應(yīng)用領(lǐng)域。
文檔編號C12Q1/02GK201110854SQ20072018456
公開日2008年9月3日 申請日期2007年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月29日
發(fā)明者輝 余, 劉清君, 瑩 徐, 斯 朱, 平 王, 華 蔡 申請人:浙江大學(xué)