本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)牙周炎相關(guān)蛋白的抗體芯片及試劑盒。

背景技術(shù)：

牙周炎主要是由局部因素引起的牙周支持組織的慢性炎癥。發(fā)病年齡以35歲以后較為多見。如齦炎未能及時(shí)治療，炎癥可由牙齦向深層擴(kuò)散到牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì)而發(fā)展為牙周炎。由于早期多無明顯自覺癥狀而易被忽視，待有癥狀時(shí)已較嚴(yán)重，甚至已不能保留牙齒。因而必須加強(qiáng)宣教，使患者早期就診和及時(shí)治療。牙周炎的早期癥狀不明顯，患者常只有繼發(fā)性牙齦出血或口臭的表現(xiàn)，與齦炎癥狀相似。檢查時(shí)可見齦緣、齦乳頭和附著齦的腫脹、質(zhì)松軟，呈深紅色或暗紅色，探診易出血。

齦溝液(gcf)是指通過溝內(nèi)上皮和結(jié)合上皮從牙齦結(jié)締組織滲入到齦溝內(nèi)的液體。牙齦健康者有極少量齦溝液，齦溝液的流出量與該部位的炎癥程度成正比。齦溝液的液體成分主要來源于血清，其他成分則分別來自血清、鄰近的牙周組織及細(xì)菌。齦溝液包括各種電解質(zhì)、蛋白質(zhì)、葡萄糖、酶等，也含有白細(xì)胞、脫落的上皮細(xì)胞等多種生物大分子，這些生物大分子都可以作為標(biāo)志物用于牙周炎的檢測(cè)，齦溝液的蛋白質(zhì)可以作為理想的病理標(biāo)志物用于檢測(cè)牙周炎。

現(xiàn)在牙周炎的檢測(cè)方法通過包括觀察和x光檢測(cè)，該方法只能從病理形態(tài)上判斷病情，且病情的判斷也附帶這醫(yī)生的主觀因素，檢測(cè)結(jié)果往往不夠客觀。因此，急需開發(fā)一種利用生物標(biāo)志物快速檢測(cè)牙周炎的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，本發(fā)明提供一種檢測(cè)牙周炎相關(guān)蛋白的抗體芯片及試劑盒，以解決上述的技術(shù)問題。

一種檢測(cè)牙周炎相關(guān)蛋白的抗體芯片及試劑盒，包括抗體芯片，牙周病相關(guān)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品混合物，生物素標(biāo)記的牙周病相關(guān)蛋白檢測(cè)抗體混合物；和熒光素cy3標(biāo)記的鏈霉親和素；所述抗體芯片以含有烷基糖苷的親水試劑處理的玻片作為固相載體，且多種牙周病相關(guān)蛋白的特異性抗體混合物在4～20℃、20～29％的濕度條件下點(diǎn)樣到固相載體上。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

結(jié)合以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。

一種檢測(cè)牙周炎相關(guān)蛋白的抗體芯片及試劑盒，如圖1所示，包括抗體芯片，牙周病相關(guān)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品混合物，生物素標(biāo)記的牙周病相關(guān)蛋白檢測(cè)抗體混合物；和熒光素cy3標(biāo)記的鏈霉親和素；所述抗體芯片以含有烷基糖苷的親水試劑處理的玻片作為固相載體，且多種牙周病相關(guān)蛋白的特異性抗體混合物在4～20℃、20～29％的濕度條件下點(diǎn)樣到固相載體上。

優(yōu)選地，所述檢測(cè)牙周炎相關(guān)蛋白抗體混合物為纖維連接蛋白受體(fn)，層粘連蛋白受體(ln)，淋巴細(xì)胞功能相關(guān)分子-1(lfa-1)，透明連接蛋白受體(lrp)，內(nèi)皮性白細(xì)胞粘附分子-1(elam-1)，血小板α-顆粒膜蛋白(gmp-140)，黏膜血管粘附素(hcam)和外周淋巴結(jié)血管粘附素(lam-1)的特異性抗體的混合物。

本發(fā)明的檢測(cè)牙周炎相關(guān)蛋白的抗體芯片及試劑盒，比較適合纖維連接蛋白受體(fn)，層粘連蛋白受體(ln)，淋巴細(xì)胞功能相關(guān)分子-1(lfa-1)，透明連接蛋白受體(lrp)，內(nèi)皮性白細(xì)胞粘附分子-1(elam-1)，血小板α-顆粒膜蛋白(gmp-140)，黏膜血管粘附素(hcam)和外周淋巴結(jié)血管粘附素(lam-1)這8種牙周炎相關(guān)蛋白的特異性抗體的組合方式。

優(yōu)選地，所述親水試劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03～0.5％的烷基糖苷、0.2～0.8％的甘油，0.06～0.1％的聚乙二醇6000的去離子水溶液；親水試劑處理玻片的方法為將玻片在親水試劑中浸泡6～15分鐘，4℃冷凍干燥即可。

優(yōu)選地，所述牙周炎相關(guān)蛋白檢測(cè)抗體混合物在4～8℃、20～25％的濕度條件下點(diǎn)樣到固相載體上。

優(yōu)選地，所述牙周炎相關(guān)蛋白檢測(cè)抗體混合物在4℃、22％的濕度條件下點(diǎn)樣到固相載體上。

優(yōu)選地，所述親水試劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3％的烷基糖苷、0.2％的甘油，0.08％的聚乙二醇6000的去離子水溶液；親水試劑處理玻片的方法為將玻片在親水試劑中浸泡10分鐘，4℃冷凍干燥即可。

本發(fā)明通過比較多種處理玻片的方法，發(fā)現(xiàn)以含有烷基糖苷的親水試劑處理的玻片背景低，檢測(cè)靈敏度高，實(shí)現(xiàn)了不僅一次可以檢測(cè)十幾個(gè)牙周病相關(guān)蛋白，并且所檢測(cè)的牙周病相關(guān)蛋白的靈敏度可達(dá)單個(gè)蛋白的elisa檢測(cè)靈敏度。本發(fā)明的抗體芯片試劑盒克服了現(xiàn)有技術(shù)操作繁瑣、檢測(cè)指標(biāo)單一、靈敏度低等缺陷，具有廉價(jià)、便利、靈敏、準(zhǔn)確、高通量、標(biāo)本用量少、能在普通實(shí)驗(yàn)室推廣和規(guī)?；葍?yōu)點(diǎn)。

不同的牙周病相關(guān)蛋白的特異性抗體在本發(fā)明所述芯片檢測(cè)系統(tǒng)中的靈敏性是不同的，所以，如果將一些低靈敏性的牙周病相關(guān)蛋白抗體與一些高靈敏性的牙周病相關(guān)蛋白抗體組合，會(huì)造成低靈敏性的牙周病相關(guān)蛋白的漏檢。

實(shí)驗(yàn)例抗體芯片載體篩選

抗體芯片載體的篩選：常規(guī)的抗體芯片多以硝酸纖維素膜為載體，由于硝酸纖維素膜是多層結(jié)構(gòu)，芯片的洗滌難度大，以致芯片的背景高，結(jié)果波動(dòng)大。同時(shí)硝酸纖維素膜易碎，不易于大規(guī)模的操作，用于大規(guī)模臨床樣本的使用還不普遍。而傳統(tǒng)的玻片價(jià)廉背景低，這給診斷和研究領(lǐng)域的廣泛使用帶來了突破。我們篩選了市面上不用活性方法處理的玻片，無論是醛基化還氨基化的玻片點(diǎn)樣效果都不穩(wěn)定。經(jīng)過大量的篩查得出溫度及玻片表面的活性試劑成分才是決定玻片點(diǎn)樣效果的關(guān)鍵。

采用以下3中處理玻片的方案，探索一種適合用于抗體芯片的載體：

a組為氨基化玻片，買了的商品化玻片不做任何處理；

b組為多聚賴氨酸玻片：將普通玻片加入pbs稀釋的多聚賴氨酸浸泡0.5～1個(gè)小時(shí)，再用純水清洗制成多聚賴氨酸玻片；

c組為經(jīng)親水試劑處理的玻片：將普通玻片用親水試劑浸泡3～5分鐘，室溫晾干即可；所述親水試劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03～0.5％的烷基糖苷、0.2～0.8％的甘油，0.06～0.1％的聚乙二醇6000的去離子水溶液；親水試劑處理玻片的方法為將玻片在親水試劑中浸泡6～15分鐘，4℃冷凍干燥即可。

各種玻片的點(diǎn)樣效果不盡相同，3組玻片結(jié)合抗體后加入二抗及底物，在不同的溫度及濕度條件下的靈敏度篩選結(jié)果如下表1，表1中表示靈敏度的指標(biāo)是最低檢測(cè)線，單位ng/ml。

表1

綜合分析表1數(shù)據(jù)可知，c組的處理方法中，在4℃、8℃和16℃溫度中，3種不同的處理濕度中，其靈敏度的均比a組合b組中的高，可見c組處理方法非常適合用于本發(fā)明的抗體芯片的制備。

最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)地說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。