專利名稱：：一種紅斑狼瘡檢測蛋白芯片及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及蛋白芯片疾病檢測產(chǎn)品，具體地說，涉及一種紅斑狼瘡檢測蛋白芯片及其試劑盒。
背景技術(shù)：
：系統(tǒng)性紅斑狼疫(SystemicLupuserythrematodes，SLE)是一種多因素參與的可累及全身多系統(tǒng)、多器官的自身免疫性疾病，伴有多種免疫學(xué)異常，嚴(yán)重時可以引起腎功能衰竭、感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷而導(dǎo)致死亡。如果出現(xiàn)多系統(tǒng)的損害，診斷并不困難，但此時大多已是疾病的中晚期，患者已有重要器官的受累，預(yù)后較差。在SLE的早期可能僅表現(xiàn)為一個或兩個系統(tǒng)受累，容易誤診為其他疾病。因此，SLE的早期診斷對改善其預(yù)后、防止重要器官受累尤為重要。目前應(yīng)用最廣的美國風(fēng)濕病學(xué)會1982年修訂的系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷標(biāo)準(zhǔn)中明確提出將狼瘡細(xì)胞(LE)陽性，抗雙鏈DNA抗體(dsDNA)陽性，抗Sm抗體陽性，或梅毒血清試驗假陽性作為SLE的免疫學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)。我國于1986年在中華醫(yī)學(xué)會風(fēng)濕病學(xué)專題會議上也規(guī)定LE細(xì)胞陽性，抗dsDNA抗體陽性，抗Sm抗體陽性作為SLE的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。由于SLE早期的臨床表現(xiàn)復(fù)雜，不易與其它疾病區(qū)分，因此越來越多的研究顯示紅斑狼瘡標(biāo)志物檢測成為SLE早期發(fā)現(xiàn)的重要工具之一，同時也可提示預(yù)后或監(jiān)測病程，而且血清SLE標(biāo)志物聯(lián)合檢測可以提高SLE檢測的敏感性和特異性。雖然對SLE的免疫學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)中主要只明確規(guī)定了抗dsDNA抗體和抗Sm抗體這兩項指標(biāo)，而實際在臨床診斷過程中，往往是對整個抗核抗體(anti皿clearantibodies;ANA)譜進(jìn)行檢測，醫(yī)生也是通過ANA的綜合指標(biāo)來判斷病人所患的是何種疾病(抗dsDNA抗體屬于ANA的一種，抗Sm抗體則為一種抗可提取的核抗原[extractablenuclearantigen.ENA]抗體，同屬ANA族抗體)。隨著人們對SLE的了解日益加深，近年國外對SLE標(biāo)志物的檢測已不僅僅局限于傳統(tǒng)的ANA(包括ENA)檢測，而是更加有針對性地進(jìn)行監(jiān)測，同時也修正了以往的錯誤看法如曾經(jīng)人們將抗SS-A(Ro)作為干燥綜合癥(SjSgren—ssyndrome,SS)的特異性標(biāo)志，但近期的研究則發(fā)現(xiàn)抗SS-A(Ro)有兩種不同的蛋白——52KDaRo蛋白(Ro52)和60KDaRo蛋白(Ro60)，兩者可分別用于辨別SS和SLE。又如人們曾認(rèn)為ssDNA雖然敏感性高，但在很多自身免疫疾病中都有陽性，因此沒有SLE特異性，不具有檢測意義，從而將ssDNA排除于ANA檢測項目之外。但根據(jù)S.S.Badakere等人在印度的研究成果表明，抗ANA抗體陰性的SLE患者體內(nèi)能夠檢出抗ssDNA陽性，從而建議將ssDNA也列入SLE的檢測項目之一(Anti薦learAntibody-negativeSystemicLupusErythematosusinIndiawithAnti_ssDNAAntibodies,Rheumatology,Dec1987;26:476-477.)。鑒于人們對SLE血清標(biāo)志物理解的加深，醫(yī)生在臨床診斷過程中可選擇使用這些更有效、更有針對性的指標(biāo)，來幫助他們判斷病人所患的疾病。而目前國內(nèi)市場上對SLE血清標(biāo)志物的檢測處于ANA和ENA廣譜檢查水平，醫(yī)院中比較主流的檢測方式仍為自動化免疫分析儀和ELISA。自動化免疫分析儀雖然可以同時檢測多種ANA和ENA標(biāo)志物，但檢測結(jié)果中有很多指標(biāo)并不是醫(yī)生所需要參考的，浪費了時間和成本；甚至還有個別指標(biāo)是無法通過此種方式檢測的。ELISA檢測方式要么只能是對ANA和ENA的整體普查，無法顯示具體指標(biāo)的檢測值；要么進(jìn)行有針對的單指標(biāo)檢測，但每次只能檢測一種指標(biāo)。若想通過ELISA方法查看與SLE相關(guān)的所有標(biāo)志物表達(dá)水平，必須進(jìn)行多次檢測，耗時巨大且需要病人提供大量的血清樣本。由此可見國內(nèi)市場上的這些檢測明顯缺乏有效性和針對性，并且缺少專門針對這些最新研究成果進(jìn)行檢測的多指標(biāo)蛋白檢測產(chǎn)品。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要提供一種專門用于紅斑狼瘡檢測，可以一次性進(jìn)行多個相關(guān)指標(biāo)檢測，并且指標(biāo)選擇恰當(dāng)?shù)亩喾N蛋白標(biāo)志物檢測芯片，以及包含該芯片的試劑盒。本發(fā)明目的是這樣實現(xiàn)的，發(fā)明人根據(jù)已報道的紅斑狼瘡標(biāo)志物的臨床應(yīng)用情況以及中國紅斑狼瘡的流行病學(xué)特點，選取dsDNA、ssDNA、Histon、SS_A(Ro60)、SS-B(La)、Sm和RNP/Sm7個標(biāo)志物，與陽性指標(biāo)，陰性指標(biāo)構(gòu)成陣列式點樣涂層，同時點陣于一張基片上，每個陣列可有多次重復(fù)。本發(fā)明涉及的用于紅斑狼瘡檢測蛋白芯片，由基片和陣列式分布于基片上的紅斑狼瘡抗原檢測指標(biāo)以及對照檢測指標(biāo)涂層組成，所述的紅斑狼瘡抗原檢測指標(biāo)包括dsDNA、ssDNA、Histon、SS-A(Ro60)、SS_B(La)、Sm和RNP/Sm共7個紅斑狼瘡標(biāo)志物，以共價鍵盤或非共價鍵固定在基片上面。所述的基片可以是玻璃片基，硝酸纖維素膜或尼龍膜。上述基片的一個優(yōu)選例是醛基化玻片。上述的對照檢測指標(biāo)涂層包括陽性對照和陰性對照；陽性對照為兔IgG抗體，陰性對照為抗原點樣所用的稀釋液。上述涂層上的每個陣列中的檢測指標(biāo)，每個有2-10個重復(fù)，對照指標(biāo)有1-5個重復(fù)。陣列的多少和大小與待檢樣品的數(shù)目，基片大小，以及點樣直徑有關(guān)。上述檢測指標(biāo)與檢測陣列的優(yōu)選例是當(dāng)檢測指標(biāo)點樣直徑為0.1mm時，點間距0.6mm，陣列大小為6mmX5mm，可在硝酸纖維素膜蛋白芯片上設(shè)置24個陣列。本發(fā)明還提供了包含上述紅斑狼瘡檢測蛋白芯片的試劑盒，還包括標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品；標(biāo)準(zhǔn)品與質(zhì)控品為瓶裝，用紙質(zhì)模板固定于包裝盒內(nèi)。所述的試劑盒，還包括樣本稀釋液，酶標(biāo)工作液，濃縮洗滌液，檢測液；各液體為瓶裝，與標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品一起用紙質(zhì)模板固定于包裝盒內(nèi)。各部分由紙質(zhì)模具固定于一包裝盒內(nèi)，不限放置方式，檢測時配套使用。所述的標(biāo)準(zhǔn)品由5-10個不同濃度梯度的蛋白混合液組成，每個蛋白混合液裝入一個容器，蛋白混合液由7個SLE標(biāo)志物的蛋白檢測指標(biāo)按不同濃度混合而成。標(biāo)準(zhǔn)品用于在每次標(biāo)本檢測結(jié)束后做標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以定量測定樣品中的檢測指標(biāo)的蛋白濃度。所述的質(zhì)控品由3-6個不同濃度的蛋白混合液組成，每個蛋白混合液裝入一個容器，蛋白混合液由7個SLE標(biāo)志物的蛋白檢測指標(biāo)按不同濃度混合而成。質(zhì)控品可以監(jiān)測整個檢測系統(tǒng)的CV值，保證每次檢測結(jié)果的有效性。所述的樣本稀釋液是一種蛋白穩(wěn)定劑；可以是由3%BSA和0.05X防腐劑(Proclin300)的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)配制而成;所述的酶標(biāo)工作液由含有HRP標(biāo)記的、所述的7個抗SLE標(biāo)志物的相應(yīng)—*+_抗體，以及檢測抗體HRP-羊抗兔IgG的前述樣本稀釋液組成；所述的濃縮洗滌液是一種中性緩沖液；可以是磷酸鹽緩沖液；所述的檢測液指配套使用的兩種試劑，一種含有魯米諾和化學(xué)發(fā)光增強劑，另一種含有過氧化氫。本發(fā)明涉及的檢測指標(biāo)全面且恰當(dāng)，應(yīng)用反應(yīng)條件一致，可以一次性檢測多個指標(biāo)，方便快捷，大大提高了檢測的效率，降低了檢測成本。本發(fā)明可以適用于疑似紅斑狼瘡病患人群的普查?？赏瑫r篩查的指標(biāo)包括抗dsDNA、抗ssDNA、抗Histon、抗SS_A(Ro60)、抗SS-B(La)、抗Sm和抗RNP/Sm抗體。輔助診斷SLE和藥物誘導(dǎo)的LE。圖1是紅斑狼瘡檢測蛋白芯片的外觀圖，l為反應(yīng)區(qū)域，底部為點樣涂層的基片。圖2是點樣陣列示意圖，第1行為陽性對照兔IgG抗體和陰性對照，各有3個重復(fù)點樣；其余各行分別為蛋白檢測指標(biāo)點樣dsDNA、ssDNA、Histon、SS-A(Ro60)、SS-B(La)、Sm和RNP/Sm，每行兩個指標(biāo)，第一行dsDNA、ssDNA，第二行Histon、SS_A(Ro60)，第三行SS-B(La)、Sm，第四行RNP/Sm，各有5個重復(fù)點樣。圖3是紅斑狼瘡檢測蛋白芯片試劑盒示意圖。2代表濃縮洗滌液；3代表1瓶樣本稀釋液和1瓶酶標(biāo)工作液；4代表2瓶配套使用的檢測試劑；5代表標(biāo)準(zhǔn)品；6代表質(zhì)控品。圖4為檢測血清示意圖，其中12個矩形表示所在加樣區(qū)域加的是標(biāo)準(zhǔn)品，6個標(biāo)準(zhǔn)品每個重復(fù)2次；5個多邊形表示所在加樣區(qū)域加的是質(zhì)控品；其余圓形表示所在加樣區(qū)域加的是樣本。圖5為結(jié)果檢測為SLE陰性的反應(yīng)區(qū)陣列圖，其中左上角3個亮點是陽性對照的信號，陰性對照和具有高度特異性的Sm和RNP/Sm沒有信號，其余指標(biāo)有微弱信號。在該種實驗結(jié)果下，雖然dsDNA檢出為陽性，但具有高度特異性的Sm和RNP/Sm未檢測到，具有中度特異性的Histon、SS-A(Ro60)均為陰性，因此可判定該血清樣本為SLE陰性。病人需做其他方面的檢查以查看是否有其他種類的自身免疫系統(tǒng)疾病。圖6為結(jié)果檢測為SLE陽性的反應(yīng)區(qū)陣列圖。左上角3個亮點表示陽性對照的信號。在該種實驗結(jié)果下，dsDNA和ssDNA、Sm和RNP/Sm檢出為陽性，具有中度特異性的Histon、SS-A(Ro60)等指標(biāo)為弱陽性。由于Sm具有高度特異性，加上dsDNA為陽性，因此符合中華醫(yī)學(xué)會制定的關(guān)于SLE的診斷標(biāo)準(zhǔn)，可經(jīng)判斷該血清樣本為SLE陽性。具體實施例方式實施例1:—種紅斑狼瘡檢測蛋白芯片的制備其步驟主要是(1)準(zhǔn)備基質(zhì)硝酸纖維素膜；(2)設(shè)計芯片，確定點陣的排列方式和點樣位置；(3)點樣針從384孔板吸出抗體噴點于硝酸纖維素膜上；(4)裝配硝酸纖維素膜，并且進(jìn)行封閉、干燥、包裝、保存。上述用于檢測男性多腫瘤標(biāo)志物抗體的蛋白芯片的制備方法具體包括以下步驟1.紅斑狼瘡標(biāo)志物檢測抗原抗體的確定檢測指標(biāo)抗原的確定紅斑狼瘡標(biāo)志物全部是由人血清中提取的純化后抗原。檢測指標(biāo)抗體的確定所采用的檢測抗體對均為小鼠雜交瘤單克隆抗體對，其檢測精度和準(zhǔn)確度明顯優(yōu)于多克隆抗體。2.點樣制備具檢測指標(biāo)涂層的膜芯片用Gesim點樣儀噴點，點樣針從384孔板吸出抗體噴點于硝酸纖維素膜上，點陣形式為10X5矩形陣列，當(dāng)點直徑為0.lmm，點橫向間距為0.6mm，抗原陣列的大小為6mmX5mm;點樣后貼膜，封閉；最后將芯片干燥、包裝后于4t:保存。3.蛋白芯片組裝用具有分隔反應(yīng)區(qū)域的器具將反應(yīng)區(qū)域固定。組裝方式見ZL032298900。組裝完成后的示意圖如圖1。實施例2:試劑盒的制備—種紅斑狼瘡檢測蛋白芯片試劑盒，由紅斑狼瘡檢測蛋白芯片，標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控品，樣本稀釋液，酶標(biāo)工作液，濃縮洗滌液，檢測液組成；各部分為瓶裝，用紙質(zhì)模板固定于包裝盒內(nèi)(如圖2)，不限放置方式，檢測時配套使用。以下是各部分的制備方法1.紅斑狼瘡檢測蛋白芯片為6X8孔板，由硝酸纖維素膜做為片基，組裝方式見ZL032298900。完成后外觀圖見圖1。2.標(biāo)準(zhǔn)品提供6瓶，每瓶0.25ml。用含有3%BSA和0.05%防腐劑(PrOClin300)的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)配置，其中抗dsDNA、抗ssDNA、抗Histon、抗SS-A(Ro60)、抗SS-B(La)、抗Sm和抗RNP/Sm標(biāo)準(zhǔn)品的終濃度見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>3.質(zhì)控品提供4瓶，每瓶0.2ml。質(zhì)控品分為5個濃度，分別是質(zhì)控品1、質(zhì)控品n、質(zhì)控品111、質(zhì)控品IV、質(zhì)控品V。這五個質(zhì)控品濃度分別趨近于相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度。質(zhì)控品是用含有3%BSA和0.05%防腐劑(PrOclinTM300)的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)配制，下表顯示抗dsDNA、抗ssDNA、抗Histon、抗SS-A(Ro60)、抗SS-B(La)、抗Sm和抗RNP/Sm標(biāo)準(zhǔn)品的終濃度及質(zhì)控界限。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>上述質(zhì)控品質(zhì)控界限測定方法如下分別由2個實驗人員按照標(biāo)準(zhǔn)實驗操作檢測質(zhì)控品1、質(zhì)控品n、質(zhì)控品ni、質(zhì)控品IV、質(zhì)控品V，重復(fù)4次/板，每天每人重復(fù)測2塊芯片，重復(fù)檢測10天，分別計算質(zhì)控品工、質(zhì)控品n、質(zhì)控品ni、質(zhì)控品iv、質(zhì)控品v的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，質(zhì)控界限為S±2sd。4.樣本稀釋液由3%BSA和0.05%防腐劑(Proclin300)的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)配制而成。提供l瓶，9ml。用于稀釋血清樣本(體積比1:1)。5.酶標(biāo)工作液由3%BSA和o.05%防腐劑(Proclin300)的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)配成溶液，含有HRP標(biāo)記的上述7個抗SLE標(biāo)志物的相應(yīng)抗體，以及檢測抗體HRP-羊抗兔IgG。提供6ml，1瓶。6.濃縮洗滌液(10X)為磷酸鹽緩沖液。由以下方法配置而成磷酸二氫鉀6.8g，磷酸氫二鈉7.lg，TWEEN-2010ml，溶于1000ml純化水。各化學(xué)物質(zhì)均為分析純。提供50ml，l瓶。使用前用450ml去離子水稀釋，混勻。7.檢測液使用PIERCE公司的SuperSigna俾ELISAFemtoMaximumSensitivitySubstrate作為配套檢測液。A液、B液各l瓶，每瓶0.6ml。實施例3:蛋白芯片及試劑盒的應(yīng)用及檢測本發(fā)明所述的用于檢測紅斑狼瘡的蛋白芯片的應(yīng)用，主要采用抗原_抗體_酶標(biāo)二抗方法檢測人血液中的紅斑狼瘡標(biāo)志物抗體，方法是將人血清加于芯片表面，樣本中的抗體分別于固定在芯片上的相對應(yīng)的抗原結(jié)合，甩干后加入酶標(biāo)二抗反應(yīng)，洗去未結(jié)合的二抗，加入檢測液后1分鐘，掃描并收集信號，樣本點的信號強度與血清中抗體的濃度成正比。在上述用于檢測紅斑狼瘡的蛋白芯片試劑盒的應(yīng)用中，其抗原抗體反應(yīng)及檢測的具體使用方法如下(1)對噴點抗原、陽性對照、陰性對照的芯片用3%BSA溶液進(jìn)行封閉，室溫2小時，封閉基片表面非特異性位點；(2)甩干封閉液后，室溫放置4小時，進(jìn)行干燥；(3)在芯片的反應(yīng)區(qū)域，加入經(jīng)等l:20稀釋的人血清樣品，以及6份標(biāo)準(zhǔn)品的2次重復(fù)，4份質(zhì)控品(加樣方式見示意圖4);每孔加100ul，置于恒溫反應(yīng)儀中37t:，振蕩反應(yīng)1小時，使抗原與抗體充分反應(yīng)；(4)甩干后，每孔加入酶標(biāo)二抗100ul，置于恒溫反應(yīng)儀中37t:，振蕩反應(yīng)30分鐘，并且用10倍稀釋的磷酸緩沖液在搖床上振蕩洗滌三次，每次1分鐘；(5)將PIERCE公司的SuperSigna俾ELISAFemtoMaximumSensitivitySubstrate的配套使用的檢測液A液和B液1:l混合，加入芯片上各反應(yīng)區(qū)域上，每陣列加60ul，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光；(6)用CCD檢測儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光的掃描并收集信號，依據(jù)掃描結(jié)果顯示分析檢測結(jié)果。如圖5為結(jié)果檢測為SLE陰性的陣列圖，圖6為結(jié)果檢測為SLE陽性的陣列圖。權(quán)利要求一種紅斑狼瘡檢測蛋白芯片，其特征在于，由基片和陣列式分布于基片上的紅斑狼瘡抗原檢測指標(biāo)以及對照檢測指標(biāo)涂層組成，所述的抗原檢測指標(biāo)包括dsDNA、ssDNA、Histon、SS-A(Ro60)、SS-B(La)、Sm和RNP/Sm共7個標(biāo)志物，以共價鍵或非共價鍵固定在基片上面。2.如權(quán)利要求1所述的紅斑狼瘡檢測蛋白芯片，其特征在于，所述的基片可以是玻璃片基，硝酸纖維素膜或尼龍膜。3.如權(quán)利要求2所述的紅斑狼瘡檢測蛋白芯片，其特征在于，所述的玻璃片基是帶有醛基修飾的載玻片。4.如權(quán)利要求1或2或3所述的紅斑狼瘡檢測蛋白芯片，其特征在于，所述的對照指標(biāo)包括1個陽性對照和1個陰性對照；陽性對照為兔IgG抗體，陰性對照為抗原點樣所用的稀釋液。5.如權(quán)利要求4所述的紅斑狼瘡檢測蛋白芯片，其特征在于，所述的涂層上每個檢測指標(biāo)有2-10個重復(fù)，對照指標(biāo)有1-5個重復(fù)。6.—種紅斑狼瘡檢測蛋白芯片試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的紅斑狼瘡檢測蛋白芯片，標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品；標(biāo)準(zhǔn)品與質(zhì)控品為瓶裝，用紙質(zhì)模板固定于包裝盒內(nèi)。7.如權(quán)利要求6所述的紅斑狼瘡檢測蛋白芯片試劑盒，其特征在于，還包括樣本稀釋液，酶標(biāo)工作液，濃縮洗滌液和檢測液；各液體為瓶裝，用紙質(zhì)模板固定于包裝盒內(nèi)。8.如權(quán)利要求6或7所述的紅斑狼瘡檢測蛋白芯片試劑盒，其特征在于，所述的標(biāo)準(zhǔn)品由5-10個不同濃度梯度的蛋白混合液組成，每個蛋白混合液裝入一個容器，蛋白混合液由7個紅斑狼瘡標(biāo)志物的蛋白檢測指標(biāo)按不同濃度混合而成。9.如權(quán)利要求6或7所述的紅斑狼瘡檢測蛋白芯片試劑盒，其特征在于，所述的質(zhì)控品由3-6個不同濃度的蛋白混合液組成，每個蛋白混合液裝入一個容器，蛋白混合液由7個紅斑狼瘡標(biāo)志物的蛋白檢測指標(biāo)按不同濃度混合而成。10.如權(quán)利要求7所述的紅斑狼瘡檢測蛋白芯片試劑盒，其特征在于，各部分配制方法如下所述的樣本稀釋液為蛋白穩(wěn)定劑；所述的酶標(biāo)工作液由含有HRP標(biāo)記的相應(yīng)抗體，以及檢測抗體HRP-羊抗兔IgG的前述樣本稀釋液組成；所述的濃縮洗滌液為中性緩沖液；所述的檢測液指配套使用的兩種試劑，一種含有魯米諾和化學(xué)發(fā)光增強劑，另一種含有過氧化氫。全文摘要本發(fā)明公開了一種紅斑狼瘡檢測蛋白芯片及其試劑盒，該芯片包括基片和陣列式分布的蛋白標(biāo)志物與對照的點涂層，所述的標(biāo)志物與對照的點涂層是指在基片上均勻分布的，點陣于基片上的dsDNA、ssDNA、Histon、SS-A(Ro60)、SS-B(La)、Sm和RNP/Sm七個抗原標(biāo)志物及陽性對照、陰性對照。本發(fā)明涉及的檢測指標(biāo)全面且恰當(dāng)，應(yīng)用反應(yīng)條件一致，可以一次性檢測多個指標(biāo)，方便快捷，大大提高了檢測的效率，降低了檢測成本。本發(fā)明可以適用于疑似紅斑狼瘡病患人群的輔助診斷。文檔編號G01N33/53GK101726586SQ200810201110公開日2010年6月9日申請日期2008年10月14日優(yōu)先權(quán)日2008年10月14日發(fā)明者劉綱,汪寧梅,王通,穆宇豪,穆海東申請人:上海裕隆生物科技有限公司