本發(fā)明涉及食品分析領(lǐng)域，具體涉及一種基于納米金粒子顏色變化的三聚氰胺可視化檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
三聚氰胺，化學(xué)式為c3n3(nh2)3，又稱蛋白精，是一種有機(jī)化合物，被用作于化工原料，對(duì)人體有害，不可用于食品加工或食品添加。但在2008年，我國很多食用三鹿奶粉的嬰兒被發(fā)現(xiàn)患有腎結(jié)石，并出現(xiàn)病重患兒死亡的案例。隨后，這些問題奶粉被發(fā)現(xiàn)含有三聚氰胺。調(diào)查顯示，由于牛奶收購標(biāo)準(zhǔn)中所要求的蛋白質(zhì)含量是通過氮元素總含量來測(cè)定的，因此，不法商販通過在牛奶中添加含氮的三聚氰胺來提高牛奶中的氮含量，從而達(dá)到以次充好的目的。這次“毒奶粉”危機(jī)產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響，使得食品安全問題成為全社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)。盡管當(dāng)前在牛奶制品中直接添加三聚氰胺的情況得到了遏制，但由于飼料污染等上游環(huán)節(jié)的問題所造成的三聚氰胺污染仍時(shí)有發(fā)生。因此，快速檢測(cè)奶制品中的三聚氰胺也成為了一個(gè)關(guān)系國計(jì)民生的迫切需求。
現(xiàn)有的三聚氰胺檢測(cè)方法包括高效液相色譜分析、質(zhì)譜分析等，但這類方法通常依賴大型設(shè)備，不利于快速、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的無法快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)三聚氰胺的問題，本發(fā)明旨在提供一種基于納米金粒子顏色變化的三聚氰胺可視化檢測(cè)方法。
本發(fā)明所述的基于納米金粒子顏色變化的三聚氰胺可視化檢測(cè)方法，包括：s1，通過檸檬酸三鈉還原氯金酸得到濃度為2.3nmol/l的納米金粒子水溶液，其中，納米金粒子的粒徑為15nm；s2，將寡聚腺嘌呤核苷酸溶解于去離子水中得到核苷酸水溶液，其中，寡聚腺嘌呤核苷酸中的腺嘌呤的數(shù)目為10-20個(gè)；s3，將核苷酸水溶液加到納米金粒子水溶液中直至寡聚腺嘌呤核苷酸的終濃度為100nm，室溫孵育以將寡聚腺嘌呤核苷酸鏈組裝到納米金粒子上得到酒紅色的檢測(cè)溶液；s4，在樣本中加入去離子水稀釋得到鈉鹽濃度低于0.1m的樣本溶液，利用除菌濾膜對(duì)樣本溶液進(jìn)行過濾得到無色透明的樣本澄清液；s5，將樣本澄清液與酒紅色的檢測(cè)溶液混合，通過肉眼觀察溶液的顏色是否變?yōu)樗{(lán)紫色。
在檢測(cè)溶液中，粒徑為15nm的納米金粒子均勻地分散于溶液中，納米粒子間距離較大，溶液整體呈現(xiàn)酒紅色。三聚氰胺作為一種含有多個(gè)氮原子的化合物，在溶液中存在時(shí)容易與納米金粒子間形成金氮鍵的非共價(jià)交聯(lián)結(jié)合，引發(fā)納米金粒子的聚集，使得納米金粒子彼此靠近形成聚集，溶液呈現(xiàn)為藍(lán)紫色，從而利用肉眼觀察顏色變化來判斷樣品中是否含有三聚氰胺。而且，本發(fā)明通過將核苷酸水溶液加到納米金粒子水溶液中，增強(qiáng)納米金粒子在含鹽水溶液中的穩(wěn)定性，以便于通過孵育將寡聚腺嘌呤核苷酸鏈組裝到納米金粒子上。另外，通過樣本稀釋，可以避免樣本中的大量蛋白質(zhì)與未經(jīng)修飾的納米金粒子產(chǎn)生非特異吸附，從而干擾三聚氰胺與納米金粒子的結(jié)合。另外，通常每100ml牛奶中含有3g蛋白，200mg鈉鹽鈣鹽，稀釋100倍后0.1ml樣品中含30微克蛋白，鹽濃度低于0.3mm。應(yīng)該理解，在某些奶酪制品中，將鹽濃度限定在0.1m鈉鹽以內(nèi)即可。納米金粒子遇高濃度鹽溶液會(huì)發(fā)生聚集變色，因此在檢測(cè)含鹽濃度較高的乳制品時(shí)可能導(dǎo)致假陽性，而對(duì)樣品的稀釋則可確保將鹽濃度降低至納米金粒子可耐受的范圍。
所述步驟s1包括：s11，鉻酸洗液浸泡玻璃器皿過夜，以除去玻璃器皿上的含油污漬；以及s12，在玻璃器皿中，氯金酸水溶液與檸檬酸三鈉水溶液回流反應(yīng)，得到納米金粒子水溶液。
所述步驟s11中的鉻酸洗液通過在100ml濃硫酸中緩緩加入5g重鉻酸鉀粉末并攪拌溶解制備。
所述步驟s12具體為：將0.01g氯金酸溶解于100ml去離子水中，置于帶有磁力攪拌子和冷凝回流裝置的燒瓶中，攪拌并油浴加熱至沸騰，加入新鮮配制的濃度為10mg/ml的檸檬酸三鈉水溶液3.5ml，繼續(xù)保持?jǐn)嚢杓訜岱序v20分鐘。
通過上述步驟s11和s12，直接獲得濃度為2.3nmol/l，粒徑為15nm的納米金粒子水溶液，無需稀釋或濃縮。
所述步驟s2中的寡聚腺嘌呤核苷酸的序列為5’-aaaaaaaaaa-3’。
所述步驟s4中的除菌濾膜的孔徑為0.22微米。
所述步驟s4中的樣本為市售牛奶。
所述步驟s4具體為：稀釋市售牛奶100倍得到樣本溶液，利用除菌濾膜與注射器對(duì)樣本溶液進(jìn)行過濾得到無色透明的樣本澄清液。
應(yīng)該理解，如果稀釋倍數(shù)過小，樣本溶液呈現(xiàn)乳白色，影響后續(xù)的顏色觀察；如果稀釋倍數(shù)過大，會(huì)大大降低三聚氰胺濃度，從而降低檢測(cè)靈敏度。其中，該稀釋操作可以除去大量多余的樣本本身的蛋白聚集，以便于后續(xù)的檢測(cè)。
所述步驟s5具體為：將0.1毫升樣本澄清液與1毫升檢測(cè)溶液混合，放置約2分鐘，通過肉眼觀察溶液的顏色是否由酒紅色變?yōu)樗{(lán)紫色來判斷市售牛奶中是否含有三聚氰胺。
所述步驟s4中的樣本的三聚氰胺的檢測(cè)極限為0.1mg/l。
實(shí)驗(yàn)表明：在含有濃度為1mg/l的三聚氰胺的對(duì)照例中，肉眼觀察溶液的顏色變?yōu)樗{(lán)紫色，而在含有濃度低于0.1mg/l的三聚氰胺的樣本中，溶液始終保持原有的酒紅色。
本發(fā)明利用納米金粒子獨(dú)特的光學(xué)性能——不同聚集程度的納米金粒子由于表面等離子共振體效應(yīng)而呈現(xiàn)不同的顏色，實(shí)現(xiàn)了基于顏色變化的快速檢測(cè)。顯然，這種通過肉眼直接觀察獲得結(jié)果的方式，不依賴大型設(shè)備，易于實(shí)現(xiàn)家庭診斷和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。另外，本發(fā)明的檢測(cè)方法不依賴于特異性識(shí)別三聚氰胺的抗體或其他生物大分子配體，由于制備、運(yùn)輸和儲(chǔ)存抗體等往往較為困難，因此，本發(fā)明的檢測(cè)方法極大地降低了檢測(cè)成本。而且，本發(fā)明的方法的靈敏度達(dá)到了2008年頒布的國家標(biāo)準(zhǔn)中嬰幼兒配方乳粉所限定的三聚氰胺檢出濃度(1mg/l)，且廉價(jià)、快速、便捷，不需要專業(yè)設(shè)備和專業(yè)技術(shù)，也不含有毒有害試劑，因此易于標(biāo)準(zhǔn)化、商業(yè)化，并在家庭環(huán)境或日常抽檢中推廣使用。
具體實(shí)施方式
下面給出本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并予以詳細(xì)描述。
實(shí)施例1
在100ml濃硫酸中緩緩加入5g重鉻酸鉀粉末并攪拌溶解制備鉻酸洗液，浸泡玻璃器皿過夜，以除去玻璃器皿上的含油污漬；
將0.01g氯金酸(國藥)溶解于100ml去離子水中，置于帶有磁力攪拌子和冷凝回流裝置的燒瓶中，攪拌并油浴加熱至沸騰，加入新鮮配制的濃度為10mg/ml的檸檬酸三鈉(國藥)水溶液3.5ml，繼續(xù)保持?jǐn)嚢杓訜岱序v20分鐘，得到濃度為2.3nmol/l的納米金粒子水溶液，其中，納米金粒子的粒徑為15nm；
將序列為5’-aaaaaaaaaa-3’的寡聚腺嘌呤核苷酸溶解于去離子水中得到核苷酸水溶液；
將核苷酸水溶液加到納米金粒子水溶液中直至寡聚腺嘌呤核苷酸的終濃度為100nm，室溫孵育以將寡聚腺嘌呤核苷酸鏈組裝到納米金粒子上得到酒紅色的檢測(cè)溶液；
取幾種品牌的市售牛奶，用移液器分裝在2毫升離心管中，在其中一管樣品中添加1mg/l三聚氰胺作為陽性對(duì)照。然后，將各樣品稀釋100倍，各取1毫升分裝于離心管中。接下來，用帶有0.22微米孔徑的除菌過濾膜將稀釋后樣品過濾一次，以除去樣品中多余的蛋白質(zhì)，得到無色透明的樣本澄清液；
取0.1毫升樣本澄清液，與離心管中1毫升檢測(cè)溶液混合均勻，放置兩分鐘后，通過肉眼觀察溶液的顏色是否由酒紅色變?yōu)樗{(lán)紫色來判斷市售牛奶中是否含有三聚氰胺。
結(jié)果：沒有添加三聚氰胺的牛奶樣品仍然呈現(xiàn)酒紅色，而添加了三聚氰胺的樣品顏色變?yōu)樗{(lán)紫色。經(jīng)過對(duì)市售六種品牌牛奶樣品的測(cè)試，結(jié)果顯示這些樣品均不會(huì)使納米金粒子溶液變色，說明這些牛奶均不含有本方法可檢出劑量的三聚氰胺。
以上所述的，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非用以限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的上述實(shí)施例還可以做出各種變化。即凡是依據(jù)本發(fā)明申請(qǐng)的權(quán)利要求書及說明書內(nèi)容所作的簡單、等效變化與修飾，皆落入本發(fā)明專利的權(quán)利要求保護(hù)范圍。本發(fā)明未詳盡描述的均為常規(guī)技術(shù)內(nèi)容。