本發(fā)明涉及一種藥材的檢測方法，具體涉及一種白樺茸藥材的質量檢測方法，屬于藥材質量標準
技術領域：
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背景技術：
：白樺茸是多孔菌科真菌的干燥子實體，早在16世紀，俄羅斯、波蘭、芬蘭及其他東歐國家的居民就已開始食用，用于防治多種疑難雜癥，如肝癌、胃癌、各類消化器官的癌癥、糖尿病、心臟病等?，F(xiàn)代研究證明，白樺茸具有增強免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、降血脂等作用，臨床上常用于治療糖尿病、高血壓、癌癥、傳染性病毒等，且具有極小的毒副作用。白樺茸主要由葉酸衍生物、樺褐孔菌醇、多種氧化三萜類化合物等化學成分組成。有文獻報道，白樺茸多糖除具有抗腫瘤、抗氧化和提高免疫力的作用外，還具有降糖作用，降糖效果顯著持久且對人體無副作用。因此，將白樺茸開發(fā)為藥品有較好的應用前景。《中國藥典》2015年版及各省地方藥材標準均未對白樺茸藥材質量進行控制，相關文獻也未對白樺茸藥材質量標準進行系統(tǒng)性的研究，故有必要建立白樺茸藥材的質量標準，為白樺茸質量控制提供依據(jù)。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術中存在的不足，而提供一種白樺茸藥材的質量檢測方法，以紫外分光光度法測定藥材中多糖含量，同時該方法經(jīng)過線性關系考察、精密度考察等一系列方法學驗證均符合要求。本發(fā)明方法簡單、易行、重復性好，能夠確切反應白樺茸藥材質量。由此建立了白樺茸質量控制標準，采用本發(fā)明所述檢測方法可有效控制白樺茸藥材質量，從而確保其臨床應用的安全性、穩(wěn)定性和有效性。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：一種白樺茸藥材的質量檢測方法，采用紫外分光光度法，以無水葡萄糖為對照品做為標示，用外標法對白樺茸多糖進行含量測定；其特征在于，方法包括以下步驟：(1)供試品溶液的制備：取白樺茸藥材，粉碎、過40-60目篩后得白樺茸細粉；精密稱取0.5-1.0g白樺茸細粉置于50-300ml溶劑中得到白樺茸細粉溶液，稱重；白樺茸細粉溶液靜置一段時間后加熱回流，得到回流液，補足回流液損失重量；回流液離心，精密稱取上清液50-100ml，蒸干得到殘渣，向殘渣中加入10ml蒸餾水使之溶解得到殘渣液；精密稱取殘渣液1ml，邊攪拌邊向其中緩慢滴加乙醇15ml，搖勻得到殘渣液-乙醇體系；殘渣液-乙醇體系靜置一段時間后離心，棄去上清液，沉淀物加蒸餾水使之溶解后置于50ml量瓶中，并加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液；(2)對照品溶液的制備：精密稱取無水葡萄糖對照品12.0mg，置100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解，定容，即得無水葡萄糖對照品溶液；(3)求回歸方程式：采用紫外分光光度法，以相應試劑為空白，測試在492nm波長處步驟(2)中不同濃度的對照品溶液的吸光度，求得標準曲線的回歸方程式；(4)測定法：采用紫外分光光度法，測試在492nm波長步驟(1)供試品溶液的吸光度，利用步驟(3)中的回歸方程式，采用標準曲線法計算得到試品溶液的無水葡萄糖濃度；白樺茸藥材按干燥品計算，多糖含量以得到的無水葡萄糖濃度計。上述技術方案中，步驟(1)中，所述的溶劑為蒸餾水。上述技術方案中，步驟(1)中，白樺茸細粉溶液靜置時間為1h。上述技術方案中，步驟(1)中，加熱回流過程中，滴速為每秒兩滴；加熱回流時間為5小時。上述技術方案中，步驟(1)中，回流液在3000r/min下離心；離心時間為15min。上述技術方案中，步驟(1)中，殘渣液-乙醇體系靜置時間為12-24h。上述技術方案中，步驟(1)中，殘渣液-乙醇體系在3000r/min下離心；離心時間為15min。上述技術方案中，質量檢測方法操作步驟如下：(1)供試品溶液的制備：取白樺茸藥材，粉碎、過50目篩后得白樺茸細粉；精密稱取1g白樺茸細粉置500ml圓底燒瓶中，加蒸餾水150ml得到白樺茸細粉溶液，稱重；白樺茸細粉溶液靜置1小時后加熱回流5小時，得到回流液，加熱回流過程中滴速為每秒兩滴，回流液補足損失重量；回流液在3000r/min下離心15min，精密吸取上清液50ml，蒸干得到殘渣，向殘渣中加入10ml蒸餾水使之溶解并定容，得到殘渣液；精密量取殘渣液1ml，置50ml離心管中，邊攪拌邊向其中緩慢滴加乙醇15ml，搖勻得到殘渣液-乙醇體系；殘渣液-乙醇體系放置12h后，在3000r/min下離心15min，棄去上清液，沉淀物加蒸餾水使之溶解后置于50ml量瓶中，并加水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液；(2)對照品溶液的制備：精密稱取無水葡萄糖對照品12.0mg，置100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解，定容，即得無水葡萄糖對照品溶液；(3)求回歸方程式：精密量取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml，分別置10ml具塞試管中且各加蒸餾水至2.0ml，分別加4％苯酚溶液1ml混勻，分別迅速加入硫酸7.0ml搖勻，于40℃水浴中保溫30分鐘，置冰水浴5分鐘，取出；以蒸餾水為空白參比溶劑，采用紫外分光光度法在492nm波長處測吸光度，空白溶液無干擾；以吸光度為縱坐標y，無水葡萄糖濃度x為橫坐標進行線性回歸，求得回歸方程式，線性范圍為0.024～0.144mg/ml、其相關系數(shù)r≥0.995，以此回歸方程代入所測得供試品的吸光度求以無水葡萄糖計白樺茸多糖濃度，進而求得以無水葡萄糖計白樺茸多糖含量；(4)測定法：精密量取步驟(1)中的供試品溶液2.0ml，采用紫外分光光度法，測試在492nm波長的吸光度y，利用步驟(3)中的回歸方程式，采用標準曲線法計算得到試品溶液的無水葡萄糖濃度；白樺茸藥材按干燥品計算，多糖含量以得到無水葡萄糖濃度計。本發(fā)明方法中，白樺茸藥材按干燥品計算，多糖含量以步驟(4)中得到的無水葡萄糖濃度計，計算公式為：；按上述的質量檢測方法對采集于11個不同地區(qū)的白樺茸藥材進行測定，對十一批樣品測定結果分析，并以測定結果平均值的70％，即3.90％為限度，作為白樺茸藥材質量控制標準，以判定其質量優(yōu)劣。本發(fā)明方法中，白樺茸藥材按干燥品計算，多糖含量以無水葡萄糖計≥3.90％，證明待測白樺茸藥材質量符合規(guī)定，反之若測定白樺茸多糖以無水葡萄糖計含量<3.90％，則說明白樺茸質量相對較差，可能對其臨床療效有一定影響。本發(fā)明技術方案的優(yōu)點在于：本發(fā)明提供了一種白樺茸藥材的質量檢測方法，經(jīng)過線性關系考察、精密度考察等一系列方法學驗證均符合實驗要求；該方法簡便、易行、重復性好，能夠確切反應白樺茸藥材質量；由此建立系統(tǒng)完善的白樺茸質量控制標準，為促進白樺茸資源的開發(fā)利用奠定了良好的基礎。采用本發(fā)明所述檢測方法可有效控制白樺茸藥材質量，從而確保其臨床應用的安全性、穩(wěn)定性和有效性。附圖說明圖1為：無水葡萄糖對照品溶液的全波長掃描的光譜掃描曲線(1代表波長為492nm處的波峰，其abs為0.42；2代表代表波長為329nm處的波峰，其abs為0.401)；圖2為：實施例1中的無水葡萄糖標準曲線(y＝9.8833x+0.0167，r＝0.9950)；圖3為：實施例2中白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計多糖含量與提取時間的關系圖；圖4為：實施例3中白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計多糖含量與料液比的關系圖；圖5為：實施例4中白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計多糖含量與靜置時間的關系圖；圖6為：實施例5中白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計多糖含量與提取次數(shù)的關系圖；圖7為：實施例6中白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計多糖含量與含醇量的關系圖。圖8為：實施例8中不同批次白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計多糖含量變化圖。具體實施方式以下對本發(fā)明技術方案的具體實施方式詳細描述，但本發(fā)明并不限于以下描述內(nèi)容：本發(fā)明實施例中所使用的試劑、儀器、藥品等如下：儀器：紫外分光光度計(tu-1810，北京普析通用)，調(diào)溫電熱套(北京市佳科利儀器有限公司)，hws-12電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)，lxj-ⅱb型低速大容量奪冠離心機(上海安亭科學儀器廠制造)。試劑與試藥：苯酚(北京化工廠，分析純)，硫酸(北京化工廠，分析純)，超純水。樣品：來源于采自不同地區(qū)的十一批樣品，經(jīng)性狀鑒定為銹革孔菌科真菌白樺茸inontusobliquu(fr.)pilát的干燥子實體。對照品：無水葡萄糖對照品(批號：110833-201506，供含量測定用，規(guī)格：100mg，購于中國食品藥品檢定研究院)。實施例1：測定方法選擇1.1無水葡萄糖對照品溶液的制備：取無水葡萄糖對照品12.0mg，精密稱定，加水使溶解并定容至100ml，制成每1ml含0.12mg的溶液，即得。1.2全波長掃描：精密量取無水葡萄糖對照品溶液1.0ml置10ml具塞試管中，加水1.0ml，加4％苯酚溶液1ml，混勻，迅速加入硫酸7.0ml，搖勻，于40℃水浴中保溫30分鐘，置冰水浴5分鐘，取出，以相應試劑為空白，照紫外可見分光光度法，進行全波長掃描。通過測定無水葡萄糖對照品溶液的紫外吸收光譜，確定492nm附近為合理的以無水葡萄糖計多糖的紫外分光光度法測定區(qū)間，結果見圖1。1.3標準曲線的制備：精密量取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml，分別置10ml具塞試管中，各加水至2.0ml，分別加4％苯酚溶液(稱取重蒸苯酚4g，加水溶解并定容至100ml，即得)1ml，混勻，迅速加入硫酸7.0ml，搖勻，于40℃水浴中保溫30分鐘，置冰水浴5分鐘，取出，以相應試劑為空白，照紫外可見分光光度法，在492nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標y，無水葡萄糖濃度為橫坐標x進行線性回歸，求得回歸方程式為y＝9.8833x+0.0167，線性范圍為0.012～0.072mg/ml，相關系數(shù)r＝0.9950，線性關系良好，結果見表1，圖2：表1無水葡萄糖對照品標準曲線濃度mg/ml吸光度0.0120.1050.0240.2660.0360.4060.0480.4980.060.599實施例2：多糖提取單因素——提取時間的考察取白樺茸藥材粉末(50目)1g，精密稱定，置500ml圓底燒瓶中，加水150ml，稱重，靜置1小時，以電熱套為熱源回流提取(滴速為每秒2滴)，加水補足損失重量，離心15分鐘(3000r/min)，精密吸取上清液50ml，蒸干，殘渣加水溶解并定容至10ml，精密吸取1ml，置50ml離心管中，邊攪拌邊滴加乙醇15ml，搖勻，放置12小時，離心15分鐘(3000r/min)，沉淀物加水使溶解并定容至50ml，精密量取2ml，以相應試劑為空白，在492nm處測得吸光度a，再從實施例1的回歸方程中計算出濃度x，按照的計算公式計算出白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計多糖含量；得到的靜置時間、白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計多糖含量的關系如表2、圖3所示：隨著提取時間的升高，白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計多糖含量逐漸增加，當提取時間為5小時時，白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計多糖含量達到最大，為5.03％。表2提取時間考察實施例3：多糖提取單因素——液料比的考察取藥材粉末(50目)6份，每份1g，精密稱定，置適宜大小的圓底燒瓶中，加水50-400ml，稱重，靜置1小時，以電熱套為熱源回流提取5小時(滴速為每秒2滴)，加水補足損失重量，離心15分鐘(3000r/min)，精密吸取上清液50-100ml，蒸干，殘渣加水溶解并定容至10ml，精密吸取1ml，置50ml離心管中，邊攪拌邊滴加乙醇15ml，搖勻，放置12小時，離心15分鐘(3000r/min)，沉淀物加水使溶解并定容至25ml，適當稀釋，精密量取2ml，以相應試劑為空白，在492nm處測得吸光度a，再從實施例1回歸方程中計算出濃度x，按照的計算公式計算出白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計多糖的含量，得到的液料比、白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計多糖含量的關系結果如表3、圖4所示：當液料比為150時，白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計多糖含量達到最大，為5.76％。表3液料比考察實施例4：多糖提取單因素——靜置時間考察取藥材粉末(50目)6份，每份1g，精密稱定，置500ml圓底燒瓶中，加水150ml，稱重，靜置0-180分鐘，以電熱套為熱源加熱回流5小時(滴速為每秒兩滴)，加水補足損失重量，離心15分鐘(3000r/min)，精密吸取上清液50ml，蒸干，殘渣加水溶解并定容至10ml，精密吸取1ml，置50ml離心管中，邊攪拌邊滴加乙醇15ml，搖勻，放置12小時，離心15分鐘(3000r/min)，沉淀物加水使溶解并定容至50ml，精密量取2ml，以相應試劑為空白，在492nm處測得吸光度a，再從實施例1回歸方程中計算出濃度x，按照的計算公式計算出白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計多糖含量，得到的靜置時間、白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計多糖含量的關系見表4、圖5：隨著靜置時間的升高，白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計多糖含量逐漸增加，當達到60min時，白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計多糖含量增加緩慢。表4靜置時間考察實施例5：多糖提取單因素——提取次數(shù)考察取藥材粉末(50目)1g，精密稱定，置500ml圓底燒瓶中，加水150ml，靜置1小時，稱重，以電熱套為熱源加熱回流提取4次，第一、二次各4小時(滴速為每秒2滴)，第三、四次各1小時(滴速為每秒2滴)，加水補足損失重量，離心15分鐘(3000r/min)，精密吸取第一次、第二次提取上清液50ml，蒸干，第三次、第四次提取上清液全部蒸干，第一次提取殘渣加水溶解并定容至10ml，精密吸取1ml置50ml離心管中，第二次、第三次、第四次提取殘渣加1ml水使溶解，分別置50ml離心管中，邊攪拌邊滴加乙醇15ml，搖勻，放置12小時，離心15分鐘(3000r/min)，沉淀物加水使溶解分別定容至50ml、10ml、10ml、10ml，精密量取2ml，在492nm處測得吸光度a，再從實施例1回歸方程中計算出濃度x，按照的計算公式計算出白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計多糖含量，得到的提取次數(shù)與白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計多糖含量的關系見表5、圖6：提取一次能把白樺茸中多糖類成分90％以上提出。表5提取次數(shù)考察實施例6：多糖提取單因素——含醇量考察取藥材粉末(50目)5份，每份1g，精密稱定，置500ml圓底燒瓶中，加水150ml，稱重，靜置1小時，以電熱套為熱源加熱回流5小時(滴速為每秒兩滴)，加水補足損失重量，離心15分鐘(3000r/min)，精密吸取上清液50ml，蒸干，殘渣加水溶解并定容至10ml，精密吸取1ml，置50ml離心管中，邊攪拌邊分別滴加乙醇2ml、3ml、5ml、15ml、30ml，搖勻，放置12小時，離心15分鐘(3000r/min)，沉淀物加水使溶解并分別定容至5ml、2ml、50ml、50ml、50ml，精密量取2ml，在492nm處測得吸光度a，再從實施例1回歸方程中計算出濃度x，按照的計算公式計算出白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計多糖含量，得到的含醇量與白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計多糖含量的關系見表6、圖7：隨著含醇量的升高，測得白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計多糖含量逐漸增加，當含醇量達到89％時，測得白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計含量多糖含量最大。表6含醇量考察實施例7：本發(fā)明方法的方法學考察1、日內(nèi)精密度同一濃度無水葡萄糖對照品溶液，于492nm處測定吸光度a，如表7所示算得rsd＝0.10％(n＝6)，表明儀器日內(nèi)精密度良好。表7儀器日內(nèi)精密度2、日間精密度同一濃度的無水葡萄糖對照品溶液，連續(xù)6日，于492nm處測定吸光度a，如表8所示，算得rsd＝0.88％(n＝6)，表明儀器日間精密度良好。表8儀器日間精密度3、重復性實驗取藥材粉末(50目)6份，每份1g，精密稱定，置500ml圓底燒瓶中，加水150ml，稱重，靜置1小時，以電熱套為熱源回流提取5小時(滴速為每秒兩滴)，加水補足損失重量，離心15分鐘(3000r/min)，精密吸取上清液50ml，蒸干，殘渣加水溶解并定容至10ml，精密吸取1ml，置50ml離心管中，邊攪拌邊滴加乙醇15ml，搖勻，放置12小時，離心15分鐘(3000r/min)，沉淀物加水使溶解并定容至50ml，精密量取2ml，以相應試劑為空白，在492nm處測得吸光度a，再從實施例1回歸方程中計算出濃度x，按照的計算公式計算出白樺茸干燥品中以無水葡萄糖計多糖含量，計算結果如表9所示，算得相對標準偏差rsd＝1.18％，表明該方法的重復性良好。表9重復性實驗結果4、準確度(加樣回收率)精密稱定白樺茸藥材粉末(50目)6份，每份1g，按供試品溶液制備方法制備，分別加入無水葡萄糖對照品適量，按上述白樺茸多糖含量測定法進行測定。結果如下表10所示。表10加樣回收率試驗結果5、穩(wěn)定性實驗取同一份供試品溶液，分別在0h、4h、8h、12h、18h、24h測量吸光度a值，如表11所示，rsd＝0.67％(n＝5)，說明供試樣品24小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。表11穩(wěn)定試驗結果實施例8：一種白樺茸藥材的質量檢測方法來源于不同地區(qū)的十一批白樺茸樣品，每批樣品均按照下述方法制備成十一種供試品溶液：取白樺茸藥材，粉碎，過50目篩，精密稱取藥材粉末1g，置500ml圓底燒瓶中，加水150ml，稱重，靜置1小時，以電熱套為熱源加熱回流5小時(滴速為每秒2滴)，加水補足損失重量，離心15分鐘(3000r/min)，精密吸取上清液50ml，蒸干，殘渣加水使溶解并定容至10ml，精密吸取1ml置50ml離心管，邊攪拌邊滴加乙醇15ml，搖勻，放置12小時，離心15分鐘(3000r/min)，沉淀物加水使溶解并定容至50ml，即得供試品溶液；分別精密量取十一種供試品溶液均2ml，以相應試劑為空白，在492nm處測得各自的吸光度，將吸光度代入實施例1回歸方程中計算出各自的濃度，按照的計算公式計算出每一批白樺茸干燥品以無水葡萄糖計多糖含量，結果表12、圖8所示：表12不同批次的白樺茸藥材多糖含量分析表12中十一批白樺茸樣品測定結果，以十一批樣品含量測定結果均值的70％，即3.90為限度，作為白樺茸藥材的質量控制標準。這說明，白樺茸藥材按干燥品計算，多糖含量以無水葡萄糖計≥3.90％即待測白樺茸藥材質量符合規(guī)定，反之若測定白樺茸多糖以無水葡萄糖計含量<3.90％，則說明白樺茸質量相對較差，可能對其臨床療效有一定影響。實施例9：一種白樺茸藥材的質量檢測方法按實施例1中標準曲線制備方法重新制備一標準曲線已驗證其有效性，以吸光度為縱坐標y，無水葡萄糖濃度為橫坐標x進行線性回歸，求得回歸方程式為y＝11.49x‐0.0133，線性范圍為0.01252～0.07512mg/ml，相關系數(shù)r＝0.9998，線性關系良好，結果見表13：表13無水葡萄糖對照品標準曲線濃度mg/ml吸光度0.012520.1330.025040.2820.037560.4350.050080.5950.06260.7540.075120.920將十一批白樺茸吸光度代入標準曲線，計算得以無水葡萄糖計多糖濃度與實施例8中以無水葡萄糖計多糖濃度比較，計算得rsd均小于5％，無顯著差異，即按實施例1中標準曲線制備得到r大于0.995的標準曲線均符合要求。本發(fā)明簡便、易行、重復性好，能夠確切的反映白樺茸藥材的質量，為白樺茸藥材質量標準制定奠定了基礎，可有效地控制白樺茸藥材的質量，從而確保其臨床應用的安全性、穩(wěn)定性和有效性。上述實例只是為說明本發(fā)明的技術構思以及技術特點，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明的實質所做的等效變換或修飾，都應該涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁12