本發(fā)明涉及直接應用于感染斯氏貍殖吸蟲且年齡小于15周歲的未成年患者血清的il－5的elisa診斷，特別是一種斯氏貍殖吸蟲感染的免疫診斷生物標志物il－5的制備方法。

背景技術(shù)：

并殖吸蟲(paragonimus)是一種腸道蠕蟲，引起并殖吸蟲病，可感染貓、狗、野生動物等哺乳動物，廣泛分布于亞洲、非洲及南美洲，是一種人畜共患的重要寄生蟲病，據(jù)世界衛(wèi)生組織(who)1995年的統(tǒng)計，全世界有2千萬人感染并殖吸蟲，有2.93億人口處于感染的威脅之下，兒童的發(fā)病率最高，患者年紀多在10－14周歲之間(who1995)。中國全國的流行率大約是1.7％，有1.95億人處于感染威脅下，最近的流行病學數(shù)據(jù)顯示中國某些地區(qū)的發(fā)病率正在上升中(liuetal.，2008)。2004年我們開展的流行病學調(diào)查顯示貴州省2090例寄生蟲病住院病例回顧性調(diào)查分析結(jié)果顯示并殖吸蟲病例為67列(占3.21％)，僅次于蛔蟲發(fā)病率，男女比例4.151，發(fā)病率居高不下；2008年我們協(xié)助貴州省各家醫(yī)院排查的門診病人送檢血清陽性率18.18％，2009年上升了4.04％，送檢患者5－14歲所占比率為39.33％－68.18％。我國分布的并殖吸蟲優(yōu)勢種主要為衛(wèi)氏并殖吸蟲paragonimuswestermani和斯氏貍殖吸蟲paragonimusskrjabini，而貴州省流行優(yōu)勢種是斯氏貍殖吸蟲，以因感染其引發(fā)的并殖吸蟲病人為主。并殖吸蟲病常用臨床診斷技術(shù)方法主要有病原學檢查、elisa檢測患者血清或者胸腔積液抗體、粗抗原真皮內(nèi)測試id及嗜酸性粒細胞eos檢測等診斷方法(鄭曉燕等，2008)。elisa是最為大量采用的檢測方式，通常使用并殖吸蟲粗抗原或部分提純的抗原進行反應，雖然有大量研究報道了不同的elisa方法，但是只有少量文獻標準引起人們的注意，各研究組常使用自己自創(chuàng)的檢測方法(blairetal.，2008)。th2控制的免疫反應是蠕蟲感染的一個獨有特征。它具有如下特征：(1)不同蟲種的具體調(diào)控情況不完全相同。(2)不同年齡段的同一寄主，th2細胞免疫反應存在差異。寄主感染發(fā)生后通常無癥狀，大部分寄主能忍受其作為一個正常的病原存在而無病變，病理學變化更多地同增高的細胞免疫學變化有關，例如感染中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)eos顯著增高。典型的如嗜酸性粒細胞通常在健康人中只占到2％～4％，而在感染患者中會上升到40％。嗜酸性粒細胞現(xiàn)在被假定為引發(fā)th2反應的主要細胞之一，它分泌多種細胞因子和趨化因子，il－5來源于它。il－5促進嗜酸性粒細胞上升，介導其從骨髓中釋放，趨化因子ccl11、ccl5、il－5是其在肺部募集涉及的最主要分子，蠕蟲感染誘導的嗜酸性粒細胞需要il－5。因此，以蠕蟲感染引起的th2細胞免疫反應為基礎，很可能篩選到某些特異變化的免疫分子，這顯然對斯氏貍殖吸蟲的臨床診治具有很大的現(xiàn)實意義。而il－5即是其特征分子，還介導eos形態(tài)改變或通過蛋白激酶c誘導此變化，在過敏性疾病的發(fā)生過程中起著更為重要的作用。

很多寄生蟲病診斷中常用的形態(tài)學檢查不適用于斯氏貍殖吸蟲，因為其以童蟲寄生人體，偶有發(fā)育為成蟲，故基本上無法查到蟲卵。而當前臨床常用檢測試劑盒基于寄生蟲的抗體，以蟲體粗抗原包被制備成的elisa試劑盒為主，不同批次之間的試劑盒質(zhì)量難免會有差異，而全國臨檢領域?qū)τ谠摬∫矡o一套統(tǒng)一的行業(yè)診斷的金標準，因此檢測結(jié)果只能局限于某種試劑盒的方法體系，無法與其他實驗室的結(jié)果進行比較，所獲數(shù)據(jù)只可作為臨床診斷的參考，不能憑此一項制定治療方案，必需借助于影像學等其他醫(yī)學檢驗方法排查；除此以外，不同吸蟲品種的免疫交叉反應也是影響檢測的重要原因(王光西，2000)，以上因素增加了檢測結(jié)果的不準確性，導致無法準確診斷及針對性治療。再者，通過eos進行的檢測會受檢查者技術(shù)及儀器辨別能力影響，無法保證結(jié)果穩(wěn)定可靠。最后，eos和寄主抗體都存在一個很大的缺陷，即它們能在患者體內(nèi)存在十幾年，長時間在血清中處于高水平，所以無法判斷現(xiàn)癥或既往感染，同時也無法對療效做出判斷。

立足于蠕蟲感染的th2細胞免疫學變化特征，尋找斯氏貍殖吸蟲特異、敏感的免疫分子診斷標志物，開發(fā)更為特異、標準的免疫學診斷方法，解決因寄生蟲粗抗原elisa試劑盒的質(zhì)控差異、吸蟲交叉反應及eos形態(tài)學檢查缺陷導致的檢驗結(jié)果不穩(wěn)定或不確定，避免出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果，同時提出一種能統(tǒng)一行業(yè)的檢驗標準，有利于所有的從業(yè)人員快速輕松地掌握并穩(wěn)定地重復。進一步地，克服抗體和eos的時效性，通過其動態(tài)變化能監(jiān)測患者病程，評判藥物療效，做出病情是否轉(zhuǎn)歸的判斷以指導臨床治療方案的制定。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決上述問題，設計了一種斯氏貍殖吸蟲感染的免疫診斷生物標志物il－5的制備方法。

實現(xiàn)上述目的本發(fā)明的技術(shù)方案為，一種斯氏貍殖吸蟲感染免疫診斷生物標志物il－5的制備方法：步驟一；患者樣品收集，用生化管抽取斯氏貍殖吸蟲感染患者全血2ml，同時抽取不限標準的健康非感染者(至少4例)全血作為陰性組，靜止2－3h，離心機3000r/min離心5min取患者血清。每人份血清收集100μl，3000r/min離心5min取患者血清，血清量不少于100ml，放入1.5ml離心管中，保存于冰箱冷凍層待測，冷凍層溫度低于－20℃。步驟二；檢測，采用聯(lián)科生物il－5試劑盒檢測，每孔加入50μl樣本稀釋液，在加入50μl的標準品、患者樣本和健康人陰性血清，每個樣品各重復兩次。然后每孔加入5μl檢測抗體室溫孵育3h。洗板后每孔加入100μl辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素孵育45min。洗板后加入100μl顯色底物tmb孵育10－30min，最后加入100μl終止液終止反應，在酶標儀上以450nm檢測od。根據(jù)標準品繪制標準曲線并計算直線回歸方程(r＞99％)。

所述抽取的患者全血和健康非感染者全血者，年齡都在15周歲以下，性別不限。

所述同時抽取不限標準的健康非感染者全血，是隨機抽取。

所述離心管為聚丙烯材質(zhì)的無菌產(chǎn)品。

利用本發(fā)明的技術(shù)方案制作的斯氏貍殖吸蟲感染的免疫診斷生物標志物il－5的制備方法，以il－5的濃度變化倍數(shù)作為診斷15周歲以下未成年人的斯氏貍殖吸蟲感染指標，具有簡單易行、結(jié)果可靠穩(wěn)定及成本低廉的特點。首先，作為各醫(yī)療機構(gòu)的檢驗科，都可以提供本檢測進行的所有儀器設備；其次，il－5即是蠕蟲感染th2免疫反應的特征分子，亦是斯氏貍殖吸蟲感染15周歲以下未成年人的特異性且敏感性的免疫分子。最后，人的il－5試劑盒已實現(xiàn)國產(chǎn)商品化生產(chǎn)，穩(wěn)定性良好，成本也比較低廉?？蓹z測96個病人的市售試劑盒單價從1550－2000元，平均每個孔的成本為16－20.8元人民幣。

附圖說明

圖1是本發(fā)明所述一種斯氏貍殖吸蟲感染的免疫診斷生物標志物il－5的制備方法的結(jié)構(gòu)示意圖；

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進行具體描述，如圖1所示，一種斯氏貍殖吸蟲感染免疫診斷生物標志物il－5的制備方法：步驟一；患者樣品收集，用生化管抽取斯氏貍殖吸蟲感染患者全血2ml，同時抽取不限標準的健康非感染者(至少4例)全血作為陰性組，靜止2－3h，離心機3000r/min離心5min取患者血清。每人份血清收集100μl，3000r/min離心5min取患者血清，血清量不少于100ml，放入1.5ml離心管中，保存于冰箱冷凍層待測，冷凍層溫度低于－20℃。步驟二；檢測，采用聯(lián)科生物il－5試劑盒檢測，每孔加入50μl樣本稀釋液，在加入50μl的標準品、患者樣本和健康人陰性血清，每個樣品各重復兩次。然后每孔加入5μl檢測抗體室溫孵育3h。洗板后每孔加入100μl辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素孵育45min。洗板后加入100μl顯色底物tmb孵育10－30min，最后加入100μl終止液終止反應，在酶標儀上以450nm檢測od。根據(jù)標準品繪制標準曲線并計算直線回歸方程(r＞99％)；所述抽取的患者全血和健康非感染者全血者，年齡都在15周歲以下，性別不限；所述同時抽取不限標準的健康非感染者全血，是隨機抽??；所述離心管為聚丙烯材質(zhì)的無菌產(chǎn)品。

本實施方案的特點為，從蠕蟲感染誘導的嗜酸性粒細胞需要il－5而il－5又能促進其上升的機理出發(fā)，結(jié)合具體蟲種及寄主不同發(fā)育時期的免疫反應存在差異的特點，本發(fā)明首次創(chuàng)造性地在15周歲以下的斯氏貍殖吸蟲感染患者中提出il－5可以用于診斷和療效評估。檢驗科只需要簡單、常用的設備和商品化、價格比較低廉的試劑盒就可快速靈敏的檢測，患者服藥后il－5也會迅速下降，十分有利于臨床治療方案的調(diào)整及優(yōu)化。il－5確診的結(jié)果也能與患者臨床癥狀和流行病學調(diào)查一致，這使得因感染斯氏貍殖吸蟲導致的并殖吸蟲病的診斷比較簡單、易行、可靠，減少了假陽性和假陰性情況的發(fā)生，克服了常用診斷方法的缺陷以及無法對病程做出判斷的不足。總之，il－5是一個在診治效果、人力和物力成本投入方面都非常適合大面積推廣的免疫診斷生物標志物。

在本實施方案中，具體操作步驟如下：

步驟一、患者樣品收集

15周歲以下、性別不限人群，用2ml普通生化管抽取斯氏貍殖吸蟲感染患者全血。同時隨機抽取不限標準的健康非感染者(至少4例)全血作為陰性組。將其放置2－3小時，選擇普通國產(chǎn)離心機3000r/min離心5min取患者血清。每人份血清收集100μl。

步驟二、聯(lián)科生物il－5試劑盒的檢測

(1)標準品制備

用蒸餾水或去離子水重溶人的il－5標準品，重溶體積標注在人il－5標準品的標簽上。輕柔地渦旋震蕩，確保充分混勻，重溶后標準品的濃度為2000pg/ml。重溶后靜置10－30分鐘。稀釋前充分混勻。取150μl濃縮的人il－5標準品，加入150μl標準品稀釋液，作為標準曲線的最高濃度(1000pg/ml)。在每一個試管中加入150μl標準品稀釋液。使用高濃度標準品做1：1系列稀釋。每次移液時，請確保充分混勻。后續(xù)步驟同樣品檢測。

(2)樣品檢測

首先將不需要的板條拆卸下來，放回裝有干燥劑的鋁箔袋，重新封好封口保存于4度冰箱。加入300μl1×洗液靜置浸泡30秒。棄掉洗液之后，在吸水紙上將微孔板拍干。洗板完成之后每孔加入50μl1×檢測緩沖液。加入50μl樣本于孔中，重復2次，保證連續(xù)加樣，不要間斷。加樣過程在15分鐘內(nèi)完成。每孔加入50μl稀釋的檢測抗體。使用封板膜封板。3000轉(zhuǎn)/分鐘振蕩，室溫孵育2小時。棄掉液體，每孔加入300μl洗液洗板，洗滌6次。每次洗板，在吸水紙上拍干。為獲得理想的實驗性能，必須徹底移除殘留液體。每孔加入100μl稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素。使用新的封板膜封板。300轉(zhuǎn)/分鐘振蕩，室溫孵育45分鐘。重復步驟8。每孔加入100μl顯色底物tmb，避光，室溫孵育5－30分鐘。每孔加入100μl終止液。顏色由藍色變?yōu)辄S色。如果顏色呈現(xiàn)綠色或者顏色的變化明顯不均勻，請輕輕叩擊板框，充分混勻。在30分鐘之內(nèi)，使用熱電multiscanmk3進行雙波長檢測，測定450nm最大吸收波長和570nm或630nm參考波長下的od值。校準后的od值為450nm的測定值減去570nm或630nm的測定值。僅使用450nm測定會導致od值偏高，并且準確度降低。

步驟三、結(jié)果計算及判斷

以標準品稀釋液作為標準曲線的零濃度。計算標準品或樣品平均od值，然后減去零濃度標準品的od值。對濃度值和od值取10為底的對數(shù)，以標準品濃度為橫坐標，od值為縱坐標，用計算機軟件進行回歸擬合生成標準曲線?；貧w分析確定最佳擬合曲線。用樣品所測od結(jié)合方程計算倍比稀釋后的細胞因子濃度，原始樣品濃度＝稀釋后的細胞因子濃度×2。按照公式計算倍數(shù)：患者il－5濃度－陰性組平均值/陰性組平均值＞2即確診。吡喹酮一療程劑量按每顆/每公斤體重，連續(xù)服用3天后il－5下降到陰性組平均值或以下即治愈。

在貴州省斯氏貍殖吸蟲流行地區(qū)收集患者12例，對于送檢樣品病人或家屬，詳細詢問其流行病學史、記錄臨床癥狀和體征、影像學檢查結(jié)果、感染時間、途徑、地點信息，用普通生化管抽取感染患者2ml左右全血，3000r/min離心5min取上清經(jīng)珠海海泰肺吸蟲抗體試劑盒診斷陽性。然后同時采用聯(lián)科生物人的il－5試劑盒檢測。陰性組il－5平均值為4.45pg/ml，患者il－5的值為10.36－48.66pg/ml，變化倍數(shù)是2.32－10.93，確診率100％，同時臨床癥狀及流行病學調(diào)查也能與之相互佐證。12名患者服藥后il－5均下降至陰性組平均值或以下的水平。具體信息如下。

表1患者il－5濃度檢測

表2患者臨床癥狀及流行病學史

表3患者臨床及流行病史的分析

上述技術(shù)方案僅體現(xiàn)了本發(fā)明技術(shù)方案的優(yōu)選技術(shù)方案，本技術(shù)領域的技術(shù)人員對其中某些部分所可能做出的一些變動均體現(xiàn)了本發(fā)明的原理，屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。