本發(fā)明涉及一種復(fù)雜生物基質(zhì)中內(nèi)分泌干擾物的檢測技術(shù)，特別是一種復(fù)雜生物基質(zhì)中內(nèi)分泌干擾物的檢測方法。

背景技術(shù)：

內(nèi)分泌干擾物(endocrinedisruptingchemicals，edcs)是一類可以干擾生物體或人類內(nèi)分泌系統(tǒng)的外源性化學(xué)物質(zhì)。已有的研究已發(fā)現(xiàn)內(nèi)分泌干擾物普遍存在環(huán)境介質(zhì)中，包括水、土壤和空氣等各個(gè)環(huán)境介質(zhì)中。內(nèi)分泌干擾物會通過食物鏈網(wǎng)遷移到各個(gè)角落并沿著食物鏈呈現(xiàn)放大作用，對人類和動物構(gòu)成巨大威脅。在人和動物的體液，包括血液、尿液、臍帶血，甚至新生兒的體液中都廣泛檢測出內(nèi)分泌干擾物的污染，如雙酚a(bpa)、壬基酚(np)、辛基酚(4-t-op)和叔丁基酚(4-t-bp)等。加之，毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)及流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，環(huán)境中大量存在的edcs可能危害人類和生物體的內(nèi)分泌、生殖、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)等的正常功能，并很可能導(dǎo)致生長發(fā)育異常、內(nèi)分泌紊亂、嬰幼兒畸形等，嚴(yán)重影響人類的生存與發(fā)展。因此，內(nèi)分泌干擾物的問題引起了世界許多國家政府、相關(guān)學(xué)者和有關(guān)國際組織的高度重視，被視為繼臭氧層破壞、溫室效應(yīng)之后的又一個(gè)全球性的環(huán)境問題。

因此，檢測生物體中內(nèi)分泌干擾物的濃度，是明確內(nèi)分泌干擾物對生物體污染的前提。但是，很多生物樣品，例如動物的器官，膽汁，血液等，含有很多復(fù)雜的生物基質(zhì)，很難水解完全。加之，大部分edcs比傳統(tǒng)污染物極性更強(qiáng)，并且在生物中的低濃度，使得檢測分析方法更加困難和復(fù)雜，無法實(shí)現(xiàn)對生物體中edcs的定量分析，尤其是多組分同時(shí)分析遭遇巨大挑戰(zhàn)。

針對復(fù)雜的生物基質(zhì)，目前關(guān)于內(nèi)分泌干擾物的高效快速檢測方法還鮮有報(bào)道。因此，亟需提出一種容易操作，能夠有效檢測復(fù)雜生物基質(zhì)中內(nèi)分泌干擾物的濃度，實(shí)現(xiàn)對生物體中內(nèi)分泌干擾物定量分析的快速檢測方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種復(fù)雜生物基質(zhì)中內(nèi)分泌干擾物的檢測方法，該檢測方法采用加速溶劑萃取-凝膠滲透色譜凈化、固相萃取以及液相色譜-質(zhì)譜分析相結(jié)合的技術(shù)，能夠有效檢測復(fù)雜生物基質(zhì)中內(nèi)分泌干擾物的濃度，實(shí)現(xiàn)對生物體中內(nèi)分泌干擾物的定量分析，該檢測方法容易操作，具有有機(jī)溶劑用量少、對待測物的選擇性高、萃取速度快、樣品回收率高等優(yōu)點(diǎn)，適用于分析含量低且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物體中內(nèi)分泌干擾物。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種復(fù)雜生物基質(zhì)中內(nèi)分泌干擾物的檢測方法，包括下述步驟：

s1：加速溶劑萃取并復(fù)溶：

s11：加速溶劑萃?。悍Q取待測樣品，將待測樣品置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥；然后進(jìn)行研磨，研磨后置于加速溶劑萃取儀萃取池中，并加入同位素內(nèi)標(biāo)混合物，在設(shè)定好的溫度條件下，采用萃取溶劑提取待測樣品，收集得到溶解有內(nèi)分泌干擾物的萃取液；

s12：復(fù)溶：蒸發(fā)掉步驟s11獲得的萃取液中的萃取溶劑，采用復(fù)溶溶劑ⅰ溶解內(nèi)分泌干擾物，得到溶解液??；

s2：自動凝膠滲透色譜凈化并復(fù)溶：

s21：自動凝膠滲透色譜凈化：將溶解液ⅰ進(jìn)行自動凝膠滲透色譜凈化分析，收集流出組分液；

s22：復(fù)溶：蒸發(fā)掉s21獲得的流出組分液中的溶劑，采用復(fù)溶溶劑ⅱ溶解內(nèi)分泌干擾物，得到溶解液ⅱ；

s3：固相萃取并復(fù)溶：

s31：活化：活化固相萃取小柱，然后將溶解液ⅱ通過固相萃取小柱；

s32：收集洗脫液：真空干燥固相萃取小柱，然后洗脫留在固相萃取小柱上的樣品，用氮吹管接收，收集到洗脫液；

s33：將氮吹管置于氮吹儀上氮吹濃縮后，采用復(fù)溶溶劑ⅲ溶解內(nèi)分泌干擾物，得到溶解液ⅲ；

s4：采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析溶解液ⅲ，完成內(nèi)分泌干擾物的定量檢測。

優(yōu)選地，所述步驟s11中的萃取溶劑為正己烷和丙酮，所述正己烷和丙酮的用量體積比為1：1。

優(yōu)選地，所述步驟s12中復(fù)溶溶劑ⅰ為乙酸乙酯和環(huán)己烷，所述乙酸乙酯和環(huán)己烷的用量體積比為1：1。

優(yōu)選地，所述步驟s22中溶溶劑ⅱ為正己烷。

優(yōu)選地，所述步驟s2中，自動凝膠滲透色譜凈化的參數(shù)條件為如下：

填料為50g200-400目中性多孔的聚苯乙烯-二乙烯基苯微球體(bio-beads-x3)，柱規(guī)格40cm×2cmi.d，紫外檢測器檢測波長240nm，流動相為體積比為1:1的乙酸乙酯/環(huán)己烷，流速5ml/min，進(jìn)樣量5ml，收集20～30min的流出組分液。

優(yōu)選地，所述步驟s31中固相萃取小柱活化方法為：使用5ml甲醇、5ml丙酮和5ml的乙酸乙酯依次通過固相萃取小柱，隨后用5ml體積分?jǐn)?shù)0.1％的醋酸溶液通過固相萃取小柱。

優(yōu)選地，所述步驟s32中真空干燥時(shí)間為10min，

所述步驟s33中氮吹濃縮后加入甲醇并定容至100μl。

優(yōu)選地，所述步驟s4中的檢測條件如下：

agilentec-c18柱：3.0mm×100mm，2.7μm；

采用dmrm模式檢測；

離子噴射電壓為-4500v；

干燥氣溫度為350℃；

干燥氣流速為10l/min；

進(jìn)樣體積為5μl；

流動相為0.4ml/min體積比40％甲醇和60％水的混合物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明加標(biāo)回收率在81.2％-98.3％之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.13％-4.89％；

(2)凝膠滲透色譜結(jié)合固相萃取技術(shù)具有萃取速度快、待測物的選擇性高、對樣品回收率高等優(yōu)點(diǎn)，更適合可靠的分析濃度含量低，種類繁多的edcs樣品；

(3)相較于傳統(tǒng)的化學(xué)試劑水解生物樣品，本方法水解生物樣品更完全，能夠處理生物基質(zhì)更為復(fù)雜的生物樣品，同時(shí)具有有機(jī)溶劑用量少、等特點(diǎn)，更加適用于結(jié)構(gòu)、成分復(fù)雜的生物樣品。

附圖說明

圖1是魚類肝臟樣品中5種edcs的回收率。

圖2是5種edcs的lc/ms/ms分析譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明提供一種復(fù)雜生物基質(zhì)中內(nèi)分泌干擾物的檢測方法，該方法是基于加速溶劑萃取-凝膠滲透色譜凈化、固相萃取技術(shù)以及液相色譜-質(zhì)譜法相結(jié)合測定復(fù)雜生物基質(zhì)中的內(nèi)分泌干擾物。

下面以魚體肝臟中5種內(nèi)分泌干擾物的檢測為例，檢測方法和檢測步驟如下：

s1：加速溶劑萃取并復(fù)溶

s11：加速溶劑萃?。哼x擇健康的魚體樣品取5g(脂肪含量約為1g時(shí)，稱取樣品量為2-10g)的肝臟于樣品瓶中，經(jīng)冷凍干燥機(jī)干燥后，研磨后置于加速溶劑萃取儀萃取池中，用硅藻土填充，加入100μl200μg/l的同位素內(nèi)標(biāo)混合物(¹³c-bpa和¹³c-n-np)。用體積比為1:1的正己烷和丙酮作為萃取溶劑，在萃取溫度80℃下進(jìn)行萃??；

s12：復(fù)溶：蒸發(fā)掉步驟s11獲得的萃取液中的萃取溶劑，加入體積比1:1為的乙酸乙酯和環(huán)己烷的復(fù)溶溶劑ⅰ溶解內(nèi)分泌干擾物，并復(fù)溶至6ml，得到溶解液?。?/p>

s2：自動凝膠滲透色譜凈化并復(fù)溶：

s21：自動凝膠色譜凈化：將溶解液ⅰ經(jīng)自動凝膠滲透色譜凈化，自動凝膠滲透色譜凈化的參數(shù)條件為如下：填料為50g200-400目中性多孔的聚苯乙烯-二乙烯基苯微球體(bio-beads-x3)，柱規(guī)格40cm×2cmi.d，紫外檢測器檢測波長240nm；流動相為乙酸乙酯/環(huán)己烷(1:1，v/v)，流速5ml/min，進(jìn)樣量5ml，收集20～30min流出組分并減壓蒸發(fā)至近干，

s22：復(fù)溶：蒸發(fā)掉步驟s21獲得的流出組分液中的溶劑，加2ml正己烷(復(fù)溶溶劑ⅱ)溶解內(nèi)分泌干擾物，得到溶解液ⅱ；

s3：固相萃取并復(fù)溶：

s31：活化：oasishlb固相萃取小柱，使用5ml甲醇、5ml丙酮和5ml的乙酸乙酯依次通過固相萃取小柱，隨后用5ml體積分?jǐn)?shù)0.1％的醋酸溶液活化后(注意在更換溶劑的時(shí)候不可使固相萃取小柱干燥，務(wù)必保持濕潤的狀態(tài))，然后將溶解液ⅱ逐滴緩慢地通過固相萃取小柱；

s32：收集洗脫液：在真空條件下使固相萃取小柱干燥10min后，利用10ml體積比為1:1的丙酮和乙酸乙酯洗脫留在固相萃取小柱上的樣品，用氮吹管接收，收集到洗脫液；

s33：將氮吹管置于氮吹儀上經(jīng)氮吹濃縮后，加入甲醇(復(fù)溶溶劑ⅲ)溶解內(nèi)分泌干擾物并定容至100μl；

s4：采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析溶解液ⅲ，完成內(nèi)分泌干擾物的定量檢測，其色譜柱檢測條件為：

agilentec-c18柱：3.0mm×100mm，2.7μm；

采用dmrm模式檢測，有正離子和負(fù)離子方式檢測；

離子噴射電壓為-4500v；

干燥氣溫度為350℃；

干燥氣流速為10l/min；

進(jìn)樣體積為5μl；

流動相為0.4ml/min體積比40％甲醇和60％水的混合物為流動相。

五種物質(zhì)的掃描特征離子如表1所示：

表1五種物質(zhì)的特征離子、保留時(shí)間和檢測模式

數(shù)據(jù)分析：在空白實(shí)驗(yàn)中(甲醇)中分別添加低、中、高3個(gè)水平的5種edcs的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平做3份，按試驗(yàn)方法進(jìn)行平行測定。

如圖1所示，為魚類肝臟樣品中5種edcs的回收率；圖2為5種edcs的lc/ms/ms分析譜圖，為標(biāo)準(zhǔn)譜圖，通過保留時(shí)間(t)來定性確定5種edcs，通過豐度(abundance)確定各類待測物的響應(yīng)值，并采用與標(biāo)準(zhǔn)曲線相對比的方法來定量。

圖1和圖2的檢測結(jié)果顯示，5種edcs的回收率在81.2％-98.3％之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.13％-4.89％。在魚肝臟樣品中添加2種¹³c試劑(¹³c-bpa和¹³c-n-np)作回收率指示劑，實(shí)驗(yàn)測得¹³c試劑的回收率分別為82.5±8.01％和80.3±9.55％，滿足實(shí)驗(yàn)要求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果測得魚體肝臟中5種edcs的濃度范圍為0.63-138μg/l，表明目標(biāo)化合物的檢測具有良好的重現(xiàn)性。較于化學(xué)試劑水解生物樣品和傳統(tǒng)的萃取技術(shù)，本方法具有有機(jī)溶劑用量少、水解生物樣品更完全等特點(diǎn)，萃取速度快、待測物的選擇性高、對樣品回收率高等優(yōu)點(diǎn)，更加適用于結(jié)構(gòu)、成分復(fù)雜的生物樣品，類似于肝臟這類生物樣品中痕量edcs的檢測分析。

本實(shí)驗(yàn)方法中，edcs的測定下限為四倍的檢出限濃度。本實(shí)驗(yàn)方法還用于檢測魚體膽汁中5種內(nèi)分泌干擾物的濃度水平，每個(gè)樣品取20μl的膽汁于離心管中，經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行前處理和儀器分析檢測，結(jié)果顯示，5種edcs的回收率在78.9％-113.7％之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.13％-7.89％。在膽汁樣品中添加的2種¹³c試劑(¹³c-bpa和¹³c-n-np)回收率分別為87.9±5.35％和95.3±6.31％，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

因此，根據(jù)我們的研究結(jié)果表明，采用加速溶劑萃取-凝膠滲透色譜凈化、固相萃取以及液相色譜-質(zhì)譜分析相結(jié)合的技術(shù)，能夠有效消解多種復(fù)雜生物基質(zhì)，特異、高效地檢出內(nèi)分泌干擾物。

最后應(yīng)說明的是：以上所述的各實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。