本發(fā)明涉及化學(xué)分析領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)銀杏葉提取液中總銀杏酸的方法。
背景技術(shù)：
：銀杏素有“植物界的活化石”之稱，原產(chǎn)中國(guó)，銀杏資源在中國(guó)的擁有量占有世界總量的70％。銀杏葉為銀杏科植物銀杏(ginkgobilobal.)的干燥葉，性甘、苦、澀、平，歸心、肺經(jīng)，具有斂肺、平喘、活血化瘀、止痛等功效；常用于治療冠心病、心絞痛及高脂血癥。銀杏葉經(jīng)加工制成的銀杏葉提取物，其制劑是目前國(guó)內(nèi)外暢銷的藥品及保健品；作為天然藥物，在治療心腦血管疾病及老年癡呆癥中具有非常顯著的效果。因此銀杏葉和銀杏葉提取物作為原料，被廣泛用于治療心腦血管等疾病的藥品制劑中，僅《中國(guó)藥典》就收載了包括銀杏葉在內(nèi)的5個(gè)相關(guān)品種。銀杏中有一類毒性成分—銀杏酸，銀杏酸具有致敏性、胎盤毒性和免疫毒性，對(duì)人類的健康具有潛在的危害。其主要存在于銀杏葉、果和外種皮中，在常規(guī)的銀杏葉提取物中也經(jīng)常含有，且部分提取物中含量不低，為控制產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)而確保患者的用藥安全，因此對(duì)銀杏葉提取物中銀杏酸含量的檢測(cè)顯得尤為重要。who及多國(guó)藥典對(duì)銀杏提取物及其制劑中總銀杏酸的含量都進(jìn)行了限定。例如，舒血寧注射液制劑就由銀杏葉提取液制成，其中限定總銀杏酸的含量每1ml不得過(guò)20ng。但現(xiàn)有的總銀杏酸的檢測(cè)方法并不能準(zhǔn)確測(cè)定樣品中的含量，因此，建立更為準(zhǔn)確、便捷的銀杏酸分析方法就顯得極其重要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供了一種檢測(cè)銀杏葉提取液中總銀杏酸的方法，具體包括以下步驟：1)取待測(cè)銀杏葉提取液，加工成粉末，得供試品；以甲醇水溶液為溶劑充分溶解，過(guò)濾，取濾液，即得供試品溶液；2)取白果新酸對(duì)照品，以甲醇水溶液為溶劑溶解，即得對(duì)照品溶液；3)采用高效液相色譜法，分別對(duì)所述供試品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測(cè)，分別獲得供試品色圖譜和對(duì)照品色譜圖；所述檢測(cè)的條件具體為：色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相由流動(dòng)相a和流動(dòng)相b組成，其中，含0.1％-0.2％三氟乙酸的乙腈為流動(dòng)相a，0.1％-0.2％三氟乙酸的水溶液為流動(dòng)相b；按如下條件進(jìn)行梯度洗脫：4)依據(jù)所述對(duì)照品色譜圖與供試品色譜圖中各自的銀杏酸峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算所述待測(cè)銀杏葉提取液中總銀杏酸的含量。其中，所述梯度洗脫中，0～35min，“75→90”代表的含義是，流動(dòng)相a的比例由75％逐漸增加至90％，“25→10”代表的含義是，流動(dòng)相b的比例由25％逐漸降低至10％；其他時(shí)間段的含義與之類似。該梯度洗脫條件，可將供試品溶液中總銀杏酸中的5個(gè)銀杏酸成分有效分離，同時(shí)可避免梯度變化對(duì)色譜基線的影響?？傘y杏酸包含了銀杏酸c15∶0、銀杏酸c17∶1、銀杏酸c13∶0、銀杏酸c15∶1、銀杏酸c17∶2等。由于樣品中待測(cè)定的總銀酸非單一成分，是一類酚酸類物質(zhì)；供試品中除了含有黃酮類、內(nèi)酯類，可能還涉及很多其他成分，而白果新酸對(duì)照品及總銀杏酸對(duì)照品的成分固定，又是固體粉末狀態(tài)，只需直接溶解即可，因此對(duì)照溶液與供試品溶液的制備方法有所不同。供試品溶液的制備過(guò)程不僅可使供試品中總銀杏酸完全溶解，又可降低供試品中的其他成分對(duì)檢測(cè)的影響。步驟4)中所述銀杏酸峰面積，其中供試品色譜圖中指總銀杏酸峰面積；對(duì)照品色譜圖中指白果新酸峰面積。所述外標(biāo)法采用如下計(jì)算公式：式中：a供：為供試品溶液中總銀杏酸成分的總峰面積；a對(duì)：為白果新酸對(duì)照品溶液的峰面積；m對(duì)：為白果新酸對(duì)照品的稱樣量，mg；v對(duì)：為白果新酸對(duì)照品稀釋體積，ml；v供：為供試品的稀釋體積，ml；v：用于制粉的銀杏葉提取液體積，ml；w供：為供試品溶液制備過(guò)程中稱取銀杏葉提取粉樣品重量，g；w：銀杏葉提取液制成粉的總重量，g；t：銀杏葉提取液中總黃酮醇苷含量，mg/ml；在檢測(cè)過(guò)程中，白果新酸對(duì)照品與供試品溶液色譜圖的總銀杏酸峰面積是供后續(xù)計(jì)算總銀杏酸含量的重要依據(jù)，因此需要充分注重色譜圖中各個(gè)峰的整體形狀特征；發(fā)明人針對(duì)銀杏葉提取液中總銀杏酸的檢測(cè)方法進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)溶劑效應(yīng)，導(dǎo)致色譜峰的峰形不好，峰面積的重復(fù)性不好。發(fā)明人經(jīng)過(guò)研究，最終確定了溶劑甲醇溶液的體積百分比為70％-90％，優(yōu)選80％的甲醇水溶液。該體積比的甲醇效果可消除溶劑效應(yīng)，可使色譜峰的峰形尖銳、峰面積的重復(fù)性好，保證色譜圖的穩(wěn)定性。本發(fā)明進(jìn)一步還包括所述銀杏葉提取是以銀杏葉為原料，采用如下方式制備：用乙醇提取銀杏葉，樹(shù)脂吸附，乙醇洗脫，回收乙醇，水稀釋，即得；優(yōu)選地，所述銀杏葉提取液的制備方法為：銀杏葉采用乙醇回流提取，回收乙醇，加水定容，采用樹(shù)脂吸附，乙醇洗脫，過(guò)濾取濾液，回收乙醇，濃縮、醇沉、濾過(guò)，回收乙醇，加水稀釋，即得。具體制備銀杏葉提取液工藝為：取銀杏葉，凈選，采用乙醇回流提取，調(diào)節(jié)ph值后靜置，過(guò)濾，取濾液將乙醇回收至無(wú)醇味，再加水定容；調(diào)節(jié)ph值，離心分取上清液；采用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)所述上清液進(jìn)行吸附，使用純化水沖洗樹(shù)脂柱，使用乙醇對(duì)樹(shù)脂柱進(jìn)行洗脫；將洗脫液過(guò)濾，取濾液將乙醇回收至無(wú)醇味，濃縮，醇沉，調(diào)節(jié)ph值，靜置；過(guò)濾，取濾液將乙醇回收至無(wú)醇味，加入注射用水稀釋，即得銀杏葉提取液。本發(fā)明進(jìn)一步還包括制備定位用對(duì)照品溶液，具體為：取總銀杏酸對(duì)照品，以甲醇水溶液為溶劑溶解，即得；采用步驟3)所述高效液相色譜法檢測(cè)所述定位用對(duì)照品溶液，獲得定位用對(duì)照品色譜圖；所述步驟4)依據(jù)所述對(duì)照品色譜圖、所述供試品色譜圖以及所述定位用對(duì)照品色譜圖中各自的銀杏酸峰及峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算所述待測(cè)銀杏葉提取液中總銀杏酸的含量；優(yōu)選地，所述步驟4)依據(jù)所述定位用對(duì)照品色譜圖，確定所述供試品色譜圖中總銀杏酸峰。實(shí)際待檢測(cè)樣品中可能包含多種成分，這類成分需要用總銀杏酸對(duì)照品來(lái)進(jìn)行定位，即通過(guò)色譜圖上各峰的比對(duì)進(jìn)行定位；再根據(jù)供試品色譜圖中總銀杏酸成分的色譜峰面積總和與白果新酸對(duì)照品色譜圖的峰面積進(jìn)行比較，采用外標(biāo)法計(jì)算這類成分的含量。本發(fā)明進(jìn)一步包括所述供試品溶液的濃度為40～65mg/ml；所述對(duì)照品溶液的濃度為0.5～2μg/ml；優(yōu)選地，所述供試品溶液的濃度為50mg/ml；所述對(duì)照品溶液的濃度為1μg/ml。另外需要制備定位用對(duì)照溶液，該溶液的濃度是白果新酸對(duì)照品溶液的20倍，即對(duì)照品溶液中白果新酸c13∶0對(duì)照品溶解在所述80％甲醇中的濃度為1μg/ml，則定位用對(duì)照溶液中總銀杏酸對(duì)照品溶解在所述80％甲醇中的濃度為20μg/ml。本發(fā)明進(jìn)一步包括所述采用高效液相色譜法時(shí)，所述供試品溶液與對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量均為50μl。本發(fā)明進(jìn)一步包括步驟1)所述加工采用噴霧干燥法。由于所檢測(cè)銀杏葉提取液樣品是液體，并且銀杏酚酸類物質(zhì)本身在樣品中的含量就極低；實(shí)驗(yàn)室采用的熱濃縮法或者其他類似溶解方法，經(jīng)常會(huì)造成樣品損失，導(dǎo)致檢測(cè)的數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量研究，發(fā)現(xiàn)若將樣品制成固體粉末，可明顯增強(qiáng)樣品的溶解效果，所述固體粉末可達(dá)到待測(cè)成分濃縮富集作用。因此發(fā)明人想到采用噴霧干燥法使提取液轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w粉末，所述噴霧干燥法不僅大大降低了樣品的損失，并且在噴霧過(guò)程中，液體成霧狀會(huì)大大增加比表面積，顯著提高溶解的效率和溶解率。本發(fā)明進(jìn)一步包括步驟3)所述檢測(cè)條件還包括：檢測(cè)波長(zhǎng)220nm-240nm、300nm-320nm；和/或，柱溫為25℃-35℃；流速為0.8-1.2ml/min。優(yōu)選地，所述檢測(cè)波長(zhǎng)為310nm；柱溫為30℃。本發(fā)明進(jìn)一步包括所述色譜柱尺寸為：柱長(zhǎng)150mm-200mm、250mm，柱內(nèi)徑4mm-5mm；優(yōu)選地，所述柱長(zhǎng)為150mm，柱內(nèi)徑4.6mm；所述填充劑的粒徑為3.5-5μm，優(yōu)選為5μm。本發(fā)明的檢測(cè)過(guò)程優(yōu)先采用agilentzorbaxxdbc18色譜柱，由實(shí)施例方法學(xué)考察8中，不同廠家色譜柱考察的結(jié)果可以看出agilent色譜柱的效果最好，分離效果好于另外兩根色譜柱。作為優(yōu)選方案，提供一種檢測(cè)銀杏葉提取液總銀杏酸的方法，其中，包括以下步驟：1)取待測(cè)銀杏葉提取液，采用噴霧干燥法加工成粉末，得供試品；以百分比為70％～90％的甲醇水溶液為溶劑充分溶解，過(guò)濾，取濾液，即得供試品溶液；2)取白果新酸對(duì)照品，以百分比為70％～90％的甲醇水溶液為溶劑溶解，即得對(duì)照品溶液；取總銀杏酸對(duì)照品，以百分比為70％～90％的甲醇水溶液為溶劑溶解，即得定位用對(duì)照品溶液；3)采用高效液相色譜法，分別對(duì)所述供試品溶液、對(duì)照品溶液及定位用對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測(cè)，分別獲得供試品色圖譜、對(duì)照品色譜圖及定位用對(duì)照品色譜圖；所述檢測(cè)的條件具體為：色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相由流動(dòng)相a和流動(dòng)相b組成，其中，含0.1％-0.2％三氟乙酸的乙腈為流動(dòng)相a，0.1％-0.2％三氟乙酸的水溶液為流動(dòng)相b；按如下條件進(jìn)行梯度洗脫：0～35min：流動(dòng)相a占流動(dòng)相總體積的百分比由75％增加至90％；35～36min：流動(dòng)相a占流動(dòng)相總體積的百分比為90％；36～45min：流動(dòng)相a占流動(dòng)相總體積的百分比為90％減少至75％；所述檢測(cè)波長(zhǎng)為310nm；所述柱溫為30℃；所述柱長(zhǎng)為150mm，柱內(nèi)徑4.6mm；所述填充劑的粒徑為5μm。4)依據(jù)所述定位用對(duì)照品色譜圖與供試品色譜圖，確定供試品溶液中總銀杏酸峰及其峰面積，再與對(duì)照品色譜圖中白果新酸峰面積比較，采用外標(biāo)法計(jì)算所述待測(cè)銀杏葉提取液中總銀杏酸的含量。本發(fā)明所提供的檢測(cè)方法，是一種采用通過(guò)快速溶解、定容樣品，準(zhǔn)確、便捷的檢測(cè)銀杏葉提取液中總銀杏酸含量的方法。本發(fā)明中制備樣品溶液的方法操作簡(jiǎn)便、快捷；不僅大大提高了溶解率，幾乎對(duì)樣品中的銀杏酸不會(huì)造成任何損失。發(fā)明人通過(guò)優(yōu)化梯度洗脫條件以及色譜儀的檢測(cè)條件，從而達(dá)到增加檢測(cè)的準(zhǔn)確性、便捷性，從而快速、準(zhǔn)確的反應(yīng)出待測(cè)樣品中真實(shí)情況。本發(fā)明的檢測(cè)方法能夠有效地判斷銀杏葉提取液樣品中總銀杏酸的含量，本發(fā)明保證其檢測(cè)的穩(wěn)定、均一、可控，具有方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、精密度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。附圖說(shuō)明圖1為總銀杏酸對(duì)照品色譜圖圖2為供試品色譜圖圖3為白果新酸對(duì)照品色譜圖(檢測(cè)限)圖4為白果新酸對(duì)照品色譜圖(定量限)圖5為銀杏酸線性關(guān)系圖圖6為1#柱總銀杏酸對(duì)照品色譜圖圖7為2#柱總銀杏酸對(duì)照品色譜圖圖8為3#柱總銀杏酸對(duì)照品色譜圖圖9為流速為0.8ml/min的總銀杏酸對(duì)照品色譜圖圖10為流速為1ml/min的總銀杏酸對(duì)照品色譜圖圖11流速為1.2ml/min的總銀杏酸對(duì)照品色譜圖圖12為柱溫為25℃的總銀杏酸對(duì)照品色譜圖圖13為柱溫為30℃的總銀杏酸對(duì)照品色譜圖圖14為柱溫為35℃的總銀杏酸對(duì)照品色譜圖具體實(shí)施方式為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明為達(dá)成預(yù)定發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段及功效,以下結(jié)合附圖及較佳實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明；以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明實(shí)施例采用的儀器和試劑如下：1、樣品及來(lái)源銀杏葉提取液：黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司雞西分公司批號(hào)：b20160301(提取液457.92g，制粉5.87g)批號(hào)：b20160302(提取液455.24g，制粉6.24g)批號(hào)：b201603032、儀器噴霧干燥機(jī)(型號(hào)：dc1500廠家：上海達(dá)程實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)高效液相色譜儀(型號(hào)：agilent1260vl廠家：美國(guó)安捷倫公司)高效液相色譜儀(型號(hào)：waterse2685/2489廠家：美國(guó)沃特世公司)超聲波清洗器(型號(hào)：p180h廠家：elma公司)電子天平(百萬(wàn)分之一)(型號(hào)：mse6.6s-oce，廠家：德國(guó)賽多利斯公司)電子天平(萬(wàn)分之一)(型號(hào)：bs224s，廠家：德國(guó)賽多利斯公司)電子天平(百分之一)(型號(hào)：jd2000-2，廠家：沈陽(yáng)龍騰電子有限公司)色譜柱：1#/agilentzorbaxxdbc18150×4.6mm5μm(廠家：美國(guó)安捷倫公司)2#/waterssymmtryc18150×4.6mm5μm(廠家：美國(guó)沃特世公司)3#/phenomenexgeminic18150×4.6mm5μm(廠家：美國(guó)菲羅門公司)3、試劑、對(duì)照品三氟乙酸(級(jí)別：hplc，廠家：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)乙腈(級(jí)別：hplc，廠家：dikma)冰醋酸(級(jí)別：hplc，廠家：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)甲醇(級(jí)別：hplc，廠家：dikma)甲醇(級(jí)別：a.r，廠家：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)白果新酸對(duì)照品(批號(hào)：111690-201403，中國(guó)食品藥品檢定研究院)總銀杏酸對(duì)照品(批號(hào)：111594-201304，中國(guó)食品藥品檢定研究院)以下實(shí)施例中涉及到的樣品提取粉均是采用噴霧干燥法制成固體粉末，并詳細(xì)記錄銀杏葉提取液的噴入量和制粉量。實(shí)施例1取黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司雞西分公司生產(chǎn)的批號(hào)為b20160301的銀杏葉提取液，檢測(cè)銀杏葉提取液中總銀杏酸的檢測(cè)方法，包括以下步驟：1)對(duì)照品溶液的制備：精密稱取白果新酸對(duì)照品適量，加入體積百分比為80％的甲醇溶液內(nèi)，其中添加比例為：每1ml80％甲醇溶液中加入1μg的白果新酸對(duì)照品。另外再制備定位用對(duì)照品溶液：精密稱取總銀杏酸對(duì)照品適量，加入體積百分比為80％的甲醇溶液內(nèi)，其中添加比例為：每lml80％甲醇溶液中加入20μg總銀杏酸對(duì)照品，作為定位用對(duì)照溶液。2)供試品溶液的制備：樣品銀杏葉提取液采用噴霧干燥法制成固體粉末，精密稱取樣品粉末0.5g，置于具塞錐形瓶中，加入體積百分比為80％的甲醇10ml，稱定重量并記錄，采用超聲使其溶解，自然放置常溫，用體積百分比為80％的甲醇補(bǔ)足溶解過(guò)程中缺失的重量，使其重量與前述所記錄的重量一致；搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。3)高效液相色譜法測(cè)定色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑，其中色譜柱長(zhǎng)為150mm，柱內(nèi)徑為4.6mm，填充劑的粒徑為5μm；檢測(cè)波長(zhǎng)為310nm；流動(dòng)相a為含0.1％三氟乙酸的乙腈，流動(dòng)相b為含0.1％三氟乙酸的水，按如下條件進(jìn)行梯度洗脫：精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液及定位用對(duì)照品溶液各50μ1,注入液相色譜儀，獲得供試品、對(duì)照品及定位用對(duì)照品色譜圖。4)、計(jì)算總銀杏酸含量；依據(jù)定位用對(duì)照品色譜圖的總銀杏酸峰，確定供試品色譜圖中總銀杏酸峰及峰面積；以白果新酸色譜圖的峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算供試品溶液中與總銀杏酸對(duì)照品相應(yīng)色譜峰的總峰面積，計(jì)算待測(cè)樣品中總銀杏酸含量。經(jīng)檢測(cè)，未檢出樣品中含有銀杏酸。采用相同的方法分別檢測(cè)批號(hào)b20160302和批號(hào)b20160303的銀杏提取液中銀杏酸，均未檢出。實(shí)施例2分別選擇百分比為70％的甲醇溶液、百分比為80％的甲醇溶液、百分比為90％的甲醇溶液以及純甲醇做為溶劑，進(jìn)行溶劑的實(shí)驗(yàn)對(duì)比；采用實(shí)施例1相同的實(shí)驗(yàn)方法，制備白果新酸對(duì)照品溶液及供試品溶液，僅有甲醇溶液的百分比不同，采用高效液相色譜法檢測(cè)。通過(guò)測(cè)定對(duì)照品溶液的響應(yīng)因子及色譜峰的對(duì)稱性來(lái)考察上述不同百分比的甲醇溶劑，如表1所示：表1不同濃度甲醇的對(duì)比由上述數(shù)值可知，70％的甲醇溶液、80％的甲醇溶液及90％的甲醇溶液的供試品溶液峰形都對(duì)稱。方法學(xué)考察1、專屬性試驗(yàn)取總銀杏酸對(duì)照品溶液與供試品溶液進(jìn)樣，銀杏葉提取粉供試品色譜圖(如圖2所示)與總銀杏酸對(duì)照品色譜圖(如圖1所示)比較，供試品色譜圖中無(wú)與總銀杏酸對(duì)照品的5個(gè)色譜峰保留時(shí)間相同的色譜峰，且無(wú)其它峰干擾測(cè)定，本法專屬性良好。2、檢測(cè)限與定量限采用信噪比法確定檢測(cè)限與定量限，取白果新酸對(duì)照品溶液稀釋至適宜濃度，注入液相色譜儀，考察其峰高與基線噪音的比值(即信噪比s/n)，如圖3及圖4所示，當(dāng)s/n為3∶1時(shí)，此時(shí)的濃度為檢測(cè)限；當(dāng)s/n為10∶1時(shí)，此時(shí)的濃度為定量限。結(jié)果：本法的檢測(cè)限為3.04ng、定量限為11.16ng。3、線性關(guān)系考察制備濃度為10μg/ml的白果新酸對(duì)照品溶液：精密稱取白果新酸對(duì)照品適量，加入體積百分比為80％的甲醇內(nèi)，充分溶解，過(guò)濾，取濾液，即得白果新酸對(duì)照品溶液；其中添加比例為，每1ml甲醇水溶液中加入10μg的白果新酸對(duì)照品。分別吸取對(duì)照品溶液1μl、2μl、5μl、8μl、10μl、15μl、20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；如圖5所示，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：y＝bx+a，結(jié)果見(jiàn)表2。表2白果新酸線性關(guān)系考察結(jié)果結(jié)果表明：銀杏酸進(jìn)樣量在10.15ng～203.00ng之間，峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。4、精密度考察取白果新酸對(duì)照品溶液，并按照上述高效液相色譜法的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積平均值及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表3。表3進(jìn)樣精密度考察結(jié)果(n＝6)進(jìn)樣次數(shù)峰面積130.702230.821331.000431.196531.000630.552平均值30.879rsd％0.76結(jié)果表明：連續(xù)6次進(jìn)樣銀杏酸峰面積的rsd值為0.76％，說(shuō)明儀器進(jìn)樣精密度良好。5、重復(fù)性考察取本品制備供試品溶液，平行制備六份，按上述高效液相色譜法的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表4。表4銀杏葉提取液重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)結(jié)果表明：六份平行銀杏葉提取液樣品總銀杏酸含量結(jié)果均未檢出，重復(fù)性試驗(yàn)良好。6、穩(wěn)定性試驗(yàn)取對(duì)照品溶液及供試品溶液，按上述高效液相色譜法的色譜條件分別在0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、16小時(shí)、20、24小時(shí)進(jìn)樣測(cè)定其峰面積，考察供試品溶液的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表5、表6。表5白果新酸溶液穩(wěn)定性考察結(jié)果時(shí)間(小時(shí))峰面積030.778231.182430.619631.031831.2261230.9981630.7842030.9502431.307平均值30.986rsd％0.26結(jié)果表明：不同進(jìn)樣時(shí)間銀杏酸峰面積的rsd值為0.26％，對(duì)照品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。表6銀杏葉提取液供試品溶液穩(wěn)定性考察結(jié)果結(jié)果表明：六份平行銀杏葉提取液樣品總銀杏酸含量結(jié)果均未檢出。7、回收率試驗(yàn)制備白果新酸對(duì)照品溶液：精密稱取白果新酸對(duì)照品10.15mg，置于100ml量瓶中，加入甲醇使用溶解并定容至量瓶刻度，制成每1ml甲醇中含銀杏酸0.1mg的對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液1ml，置于100ml量瓶中，加適量甲醇及20ml水混勻后用甲醇稀釋至量瓶刻度混勻，即得濃度為1.015μg/ml的白果新酸對(duì)照品溶液。其中，銀杏葉提取液(批號(hào)b20160302)：455.24g制粉量6.24g，總銀杏酸含量(ng/g)：未檢出加樣回收供試品溶液制備：取銀杏葉提取物粉0.25g,精密稱定，置具塞錐形瓶中，平行操作12份；其中6份分別精密加入10ml濃度為1.015μg/ml的白果新酸對(duì)照品溶液，稱定重量，超聲溶解，冷卻至室溫，采用體積百分比為80％甲酵補(bǔ)足在前述操作中缺失的重量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得；其中3份分別精密加入5ml濃度為1.015μg/ml的白果新酸對(duì)照品溶液，再精密加入5ml體積百分比為80％的甲醇,稱定重量，超聲溶解，冷卻至室溫，采用體積百分比為80％甲酵補(bǔ)足在前述操作中缺失的重量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得；其中3份分別精密加入2ml濃度為1.015μg/ml的白果新酸對(duì)照品溶液，再精密加入8ml體積百分比為80％的甲醇,稱定重量，超聲溶解，冷卻至室溫，采用體積百分比為80％甲酵補(bǔ)足在前述操作中缺失的重量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得；按上述高效液相色譜法的色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定回收率，結(jié)果見(jiàn)表7。表7銀杏葉提取物粉白果新酸加樣回收試驗(yàn)(n＝6)結(jié)果表明：銀杏葉提取物粉白果新酸加樣回收樣品平均回收率為：96.7％，12個(gè)樣品rsd值為3.10％，該方法測(cè)定總銀杏酸準(zhǔn)確度良好。8、不同廠家色譜柱考察分別采用三種不同廠家填料的色譜柱，取總銀杏酸對(duì)照品溶液按上述高效液相色譜法的色譜條件的方法進(jìn)樣，考察對(duì)照品五個(gè)峰與相臨色譜峰的最小分離度。(如圖6-8所示))表8不同廠家色譜柱考察色譜柱峰1(銀杏酸)峰2峰3峰4峰51#2.602.604.131.551.552#1.361.363.3611.6611.663#1.441.442.580.810.81結(jié)果表明：2#色譜柱和3#色譜柱對(duì)總銀杏酸五個(gè)成分分離情況不如1#柱理想，故標(biāo)準(zhǔn)方法使用1#色譜柱效果最好。9、流速考察取總銀杏酸對(duì)照品溶液按上述高效液相色譜法的色譜條件的方法進(jìn)樣，其中色譜柱采用1#色譜柱。流動(dòng)相流速分別為0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min，進(jìn)樣考察流速的變化對(duì)總銀杏酸對(duì)照品五個(gè)峰與相臨色譜峰分離度的影響。(如圖9-11所示)表9流速考察流速峰1(白果新酸)峰2峰3峰4峰50.82.552.554.081.451.451.02.642.644.181.551.551.22.662.664.211.611.61結(jié)果表明：使用1#色譜柱，在0.8ml/min～1.2ml/min流速下能夠?qū)⒖傘y杏酸對(duì)照品五個(gè)成分較好分離。10、柱溫考察取總銀杏酸對(duì)照品溶液按上述高效液相色譜法的色譜條件的方法進(jìn)樣，其中柱溫分別設(shè)置為25℃、30℃、35℃，進(jìn)樣考察柱溫的變化對(duì)總銀杏酸對(duì)照品五個(gè)峰與相臨色譜峰分離度的影響。(如圖12-14所示)表10柱溫考察柱溫峰1(白果新酸)峰2峰3峰4峰525℃2.542.544.151.291.2930℃2.632.634.151.551.5535℃2.682.684.141.751.75結(jié)果表明：柱溫為25℃時(shí)總銀杏酸對(duì)照品五個(gè)成分峰分離較稍差；柱溫為30℃時(shí)效果最優(yōu)11、中間精密度考察上述實(shí)驗(yàn)由化驗(yàn)員a完成，再安排化驗(yàn)員b于不同日期，使用另外一臺(tái)液相色譜儀(與上述化驗(yàn)員a使用的不是同一臺(tái))，按照上述方法，考察總銀杏酸對(duì)照品五個(gè)峰與相臨色譜峰的最小分離度。表11中間精密度考察條件峰1(銀杏酸)峰2峰3峰4峰5人員a/安儀器2.632.634.151.551.55人員b/沃儀器2.962.964.791.681.68結(jié)果表明：所檢測(cè)的總銀杏酸對(duì)照品中，五個(gè)成分峰分離度無(wú)明顯差異，表明隨機(jī)變動(dòng)因素對(duì)精密度影響較小，該方法準(zhǔn)確可靠。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明、具體實(shí)施方式及試驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12