本發(fā)明屬于化學(xué)分析檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種測(cè)定乳制品中莫奈太爾及其代謝物殘留量的方法。
背景技術(shù)：
：近年來，營(yíng)養(yǎng)豐富的乳制品備受消費(fèi)者的青睞，在各類食品中占有絕對(duì)的市場(chǎng)份額,隨著銷量的增加，其質(zhì)量問題也越來越受到關(guān)注。寄生蟲感染是危害畜禽生產(chǎn)和畜牧業(yè)發(fā)展的重要疾病，其防治以藥物為主。作為新型氨基乙腈衍生物類驅(qū)蟲藥莫奈太爾(monepantel，mop)口服液(商品名)2009年9月首先在歐洲批準(zhǔn)上市，用于治療和控制羊腸道蠕蟲感染。隨后，該藥在澳大利亞、新西蘭和巴西等國(guó)家上市。該藥物特定地作用于線蟲特有的煙堿乙酰膽堿受體亞科acr－23蛋白，具有快速、高效和滲透性神經(jīng)肌肉效應(yīng)，通過引起體壁肌肉過度收縮導(dǎo)致咽前部麻痹、痙攣性收縮并最終死亡，可以有效殺滅耐受其他類別藥物的線蟲。由于哺乳動(dòng)物中沒有該受體，因此莫奈太爾對(duì)除線蟲之外的其他有機(jī)體均表現(xiàn)為低毒性。莫奈太爾經(jīng)口給藥后，在動(dòng)物體內(nèi)被快速吸收并快速氧化為亞砜，亞砜又進(jìn)一步被氧化為砜。國(guó)外已有大量研究表明該藥具有較好的驅(qū)蟲效果，同時(shí)還制定了莫奈太爾的最大殘留限量。歐盟37/2010規(guī)定：莫奈太爾的最大殘留限量為：牛羊奶0.17mg/kg。該法規(guī)已于2013年6月29日生效。我國(guó)尚未制定出乳制品中的莫奈太爾的最大殘留限量。經(jīng)查閱，我國(guó)在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和各行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中尚未有關(guān)于乳制品中莫奈太爾及其代謝物殘留量的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)乳制品中莫奈太爾及其代謝物殘留檢測(cè)的公開文獻(xiàn)。為了更好的進(jìn)行監(jiān)管，促進(jìn)我國(guó)進(jìn)出口貿(mào)易更好的發(fā)展，保障我國(guó)進(jìn)出口食品的安全，保障我國(guó)消費(fèi)者的健康，建立乳制品中莫奈太爾及其代謝物殘留量的檢測(cè)方法是非常必要的，具有重要的實(shí)踐和應(yīng)用價(jià)值。目前，尚未有檢測(cè)在乳制品中的莫奈太爾、莫奈太爾亞砜和莫奈太爾砜的相關(guān)研究及報(bào)道。因此，建立快速準(zhǔn)確測(cè)定乳制品中的莫奈太爾及其代謝物殘留量的檢測(cè)方法已迫在眉睫，以保障食品安全，尤其是孕婦和嬰幼兒等敏感群體的健康。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對(duì)以上要解決的技術(shù)問題，提供一種操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)、定性定量準(zhǔn)確、回收率和重復(fù)性良好的測(cè)定乳制品中莫奈太爾及其代謝物殘留量的方法。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：一種測(cè)定乳制品中莫奈太爾及其代謝物殘留量的方法，其包括以下步驟：步驟1：配制標(biāo)準(zhǔn)溶液；步驟2：處理并凈化乳制品樣品；步驟3：使用高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定。所述的莫奈太爾及其代謝物包括莫奈太爾、莫奈太爾亞砜和/或莫奈太爾砜，所述的乳制品包括但不限于液態(tài)奶(包括但不限于牛奶和酸奶)和奶粉。莫奈太爾的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：莫奈太爾亞砜的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：莫奈太爾砜的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述乳制品包括但不限于酸奶、牛奶和奶粉。作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟1包括配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、混合標(biāo)準(zhǔn)中間液、標(biāo)準(zhǔn)工作液和定容液。進(jìn)一步，配制所述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的步驟為：分別準(zhǔn)確稱取適量莫奈太爾、莫奈太爾亞砜和莫奈太爾砜標(biāo)準(zhǔn)品置于100ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度配制成100mg/l的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。進(jìn)一步，配制所述標(biāo)準(zhǔn)中間液的步驟為：分別吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至50ml容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，配制濃度為10mg/l標(biāo)準(zhǔn)中間液。進(jìn)一步，配制所述標(biāo)準(zhǔn)工作液的步驟為：吸取一定量的10mg/l標(biāo)準(zhǔn)中間液，用甲醇逐級(jí)稀釋配制成100μg/l的標(biāo)準(zhǔn)工作液。進(jìn)一步，配制所述定容液的步驟為：以90ml甲醇和10ml0.5mmol/l乙酸銨溶液的比例，將二者混合搖勻。作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟2中，所述乳制品為液態(tài)奶，處理并凈化所述液態(tài)奶的具體操作如下：稱取所述液態(tài)奶試樣2.00g至50ml的離心管a中，加入5ml飽和氯化鈉，渦旋振蕩2min,加入10ml乙腈，渦旋振蕩10min,超聲10min,提取液以4000r/min離心5min；上清液轉(zhuǎn)移至另一50ml離心管b中。離心管a中加入8ml乙腈重復(fù)提取一次，4000r/min離心5min，上清液合并至離心管b中，用乙腈定容至20ml刻度，搖勻，得到樣品提取液；吸取2ml所述樣品提取液過中性氧化鋁固相萃取柱，收集流出液，再用2ml乙腈淋洗固相萃取柱，合并收集流出液，至10ml試管中，50℃吹氮濃縮至干，得到殘?jiān)?；將所述殘?jiān)?.0ml定容液溶解，渦旋振蕩1min，超聲5min；經(jīng)0.2μm濾膜過濾后，供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)定。作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟2中，所述乳制品為奶粉，處理并凈化所述奶粉的具體操作如下：稱取所述奶粉試樣0.50g至50ml的離心管a中，加入2ml水渦旋振蕩至溶解樣品完全，加入5ml飽和氯化鈉，渦旋振蕩2min,加入10ml乙腈，渦旋振蕩10min,超聲10min,提取液以4000r/min離心5min；上清液轉(zhuǎn)移至另一50ml離心管b中；離心管a中加入8ml乙腈重復(fù)提取一次，4000r/min離心5min，上清液合并至離心管b中，用乙腈定容至20ml刻度，搖勻，得到樣品提取液；吸取8ml樣品提取液過中性氧化鋁固相萃取柱，收集流出液，再用2ml乙腈淋洗固相萃取柱，合并收集流出液，至20ml試管中，50℃吹氮濃縮至干，得到殘?jiān)?；所述殘?jiān)?.0ml定容液溶解，渦旋振蕩1min，超聲5min；經(jīng)0.2μm濾膜過濾后，供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)定。作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟3中的液相色譜條件如下：色譜柱條件為inertsilc8-3，2.1mm×100mm，3μm；流動(dòng)相為：甲醇為a相，0.5mmol/l乙酸銨溶液為b相；梯度洗脫條件：0～3min時(shí)，a由10％升至95％，保持2min；5～5.1min時(shí)，a由95％降至10％，保持4.9min；流速為0.30ml/min；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為5μl。作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟3中的質(zhì)譜條件如下：離子源為電噴霧電離；掃描方式為負(fù)離子掃描；監(jiān)測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；氣簾氣壓力為173kpa；霧化氣壓力為345kpa；輔助加熱氣壓力為449kpa；碰撞氣壓力為76kpa；噴霧電壓為－4500v；離子源溫度為400℃。作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述乳制品中莫奈太爾及其代謝物的檢測(cè)定量限為2.0μg/kg。優(yōu)選地，所述莫奈太爾及其代謝物在乳制品中被檢測(cè)到的質(zhì)量濃度為0.1～5.0μg/l。本發(fā)明的方法針對(duì)的檢測(cè)藥物為莫奈太爾、莫奈太爾亞砜和莫奈太爾砜，適用的基質(zhì)為液態(tài)奶和奶粉，建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，以增強(qiáng)專利的適用性，易于專利的推廣使用。本發(fā)明采用高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜結(jié)合固相萃取等技術(shù)，建立了乳制品中莫奈太爾、莫奈太爾亞砜和莫奈太爾砜的檢測(cè)方法。該方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)，定性定量準(zhǔn)確，能夠?yàn)槿橹破分心翁珷?、莫奈太爾亞砜和莫奈太爾砜的分布狀況的監(jiān)測(cè)工作提供技術(shù)支持。附圖說明圖1是經(jīng)atlantishillic柱分離的莫奈太爾mrm圖。圖2是經(jīng)atlantishillic柱分離的莫奈太爾亞砜mrm圖。圖3是經(jīng)atlantishillic柱分離的莫奈太爾砜mrm圖。圖4是經(jīng)atlantist3柱分離的莫奈太爾mrm圖。圖5是經(jīng)atlantist3柱分離的莫奈太爾亞砜mrm圖。圖6是經(jīng)atlantist3柱分離的莫奈太爾砜mrm圖。圖7是經(jīng)inertsilc8柱分離的莫奈太爾mrm圖。圖8是經(jīng)inertsilc8柱分離的莫奈太爾亞砜mrm圖。圖9是經(jīng)inertsilc8柱分離的莫奈太爾砜mrm圖。圖10是莫奈太爾的二級(jí)離子碎片掃描質(zhì)譜圖。圖11是莫奈太爾亞砜的二級(jí)離子碎片掃描質(zhì)譜圖。圖12是莫奈太爾砜的二級(jí)離子碎片掃描質(zhì)譜圖。圖13是牛奶空白中莫奈太爾mrm色譜圖。圖14是牛奶空白中莫奈太爾亞砜mrm色譜圖。圖15是牛奶空白中莫奈太爾砜mrm色譜圖。圖16是牛奶空白標(biāo)準(zhǔn)添加樣品(添加水平2.0μg/kg)中莫奈太爾mrm色譜圖。圖17是牛奶空白標(biāo)準(zhǔn)添加樣品(添加水平2.0μg/kg)中莫奈太爾亞砜mrm色譜圖。圖18是牛奶空白標(biāo)準(zhǔn)添加樣品(添加水平2.0μg/kg)中莫奈太爾砜mrm色譜圖。圖19是酸奶空白中莫奈太爾mrm色譜圖。圖20是酸奶空白中莫奈太爾亞砜mrm色譜圖。圖21是酸奶空白中莫奈太爾砜mrm色譜圖。圖22是酸奶空白標(biāo)準(zhǔn)添加樣品(添加水平2.0μg/kg)中莫奈太爾mrm色譜圖。圖23是酸奶空白標(biāo)準(zhǔn)添加樣品(添加水平2.0μg/kg)中莫奈太爾亞砜mrm色譜圖。圖24是酸奶空白標(biāo)準(zhǔn)添加樣品(添加水平2.0μg/kg)中莫奈太爾砜mrm色譜圖。圖25是奶粉空白中莫奈太爾mrm色譜圖。圖26是奶粉空白中莫奈太爾亞砜mrm色譜圖。圖27是奶粉空白中莫奈太爾砜mrm色譜圖。圖28是奶粉空白標(biāo)準(zhǔn)添加樣品(添加水平2.0μg/kg)中莫奈太爾mrm色譜圖。圖29是奶粉空白標(biāo)準(zhǔn)添加樣品(添加水平2.0μg/kg)中莫奈太爾亞砜mrm色譜圖。圖30是奶粉空白標(biāo)準(zhǔn)添加樣品(添加水平2.0μg/kg)中莫奈太爾砜mrm色譜圖。圖31是莫奈太爾及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳述，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。材料與試劑牛奶、酸奶和奶粉由廣州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買。莫奈太爾、莫奈太爾亞砜和莫奈太爾砜美國(guó)witega公司；乙腈(色譜純)，美國(guó)tedia公司；乙酸銨(優(yōu)級(jí)純)，印度fluka公司；去離子水由millipore公司超純水機(jī)制得；中性氧化鋁固相萃取柱(1g/3ml)美國(guó)色譜科公司，用3ml乙腈活化，備用。儀器與設(shè)備uflclc-20a超高效液相色譜儀，日本島津公司；api4000qtrap三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配esi離子源，美國(guó)absciex公司；吹氮濃縮儀，美國(guó)zymarkturbovap.lv公司；渦旋振蕩器，德國(guó)ika公司；3-16k型高速離心機(jī)，德國(guó)sigma公司。測(cè)定方法1.標(biāo)準(zhǔn)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：分別準(zhǔn)確稱取適量莫奈太爾、莫奈太爾亞砜和莫奈太爾砜標(biāo)準(zhǔn)品置于100ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度配制成100mg/l的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃冰箱保存?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)中間液(10mg/l)：分別吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至50ml容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，配制濃度為10mg/l標(biāo)準(zhǔn)中間液。標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：準(zhǔn)確吸取一定量的10mg/l標(biāo)準(zhǔn)中間液，用甲醇逐級(jí)稀釋配制成100μg/l的標(biāo)準(zhǔn)工作液。標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制：吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)工作液，用基質(zhì)空白溶液配制成0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0μg/l系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。定容液：量取90ml甲醇和10ml0.5mmol/l乙酸銨溶液，搖勻備用。2.樣品處理與凈化液態(tài)奶(例如牛奶或酸奶)的提取與凈化稱取液態(tài)奶(例如牛奶或酸奶)試樣2g(精確至0.01g)至50ml的離心管a中，加入5ml飽和氯化鈉，渦旋振蕩2min,加入10ml乙腈，渦旋振蕩10min,超聲10min,提取液以4000r/min離心5min。上清液轉(zhuǎn)移至另一50ml離心管b中。離心管a中加入8ml乙腈重復(fù)提取一次，4000r/min離心5min，上清液合并至離心管b中，用乙腈定容至20ml刻度，搖勻。吸取2ml樣品提取液過中性氧化鋁固相萃取柱，收集流出液，再用2ml乙腈淋洗固相萃取柱，合并收集流出液，至10ml試管中，50℃吹氮濃縮至干。殘?jiān)?.0ml定容液溶解，渦旋振蕩1min，超聲5min。經(jīng)0.2μm濾膜過濾后，供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)定。奶粉的提取與凈化稱取奶粉試樣0.5g(精確至0.01g)至50ml的離心管a中，加入2ml水渦旋振蕩至溶解樣品完全，加入5ml飽和氯化鈉，渦旋振蕩2min,加入10ml乙腈，渦旋振蕩10min,超聲10min,提取液以4000r/min離心5min。上清液轉(zhuǎn)移至另一50ml離心管b中。離心管a中加入8ml乙腈重復(fù)提取一次，4000r/min離心5min，上清液合并至離心管b中，用乙腈定容至20ml刻度，搖勻。吸取8ml樣品提取液過中性氧化鋁固相萃取柱，收集流出液，再用2ml乙腈淋洗固相萃取柱，合并收集流出液，至20ml試管中，50℃吹氮濃縮至干。殘?jiān)?.0ml定容液溶解，渦旋振蕩1min，超聲5min。經(jīng)0.2μm濾膜過濾后，供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)定。3.液相色譜條件色譜柱：inertsilc8-3(2.1mm×100mm，3μm)；流動(dòng)相：a:甲醇+b:0.5mmol/l乙酸銨溶液,梯度洗脫條件：0～3min時(shí)，a由10％升至95％，保持2min；5～5.1min時(shí)，a由95％降至10％，保持4.9min；流速：0.30ml/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5μl。4.質(zhì)譜條件離子源：電噴霧電離(electrosprayionization，esi)；掃描方式：負(fù)離子掃描；監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiplereactionmonitoring,mrm)；氣簾氣壓力(cur)：173kpa；霧化氣壓力(gs1)：345kpa；輔助加熱氣壓力(gs2)：449kpa；碰撞氣壓力(cad)：76kpa；噴霧電壓(is)：－4500v；離子源溫度(tem)：400℃；莫奈太爾及其代謝物的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)見表1。監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞能量、去簇電壓、采集時(shí)間和保留時(shí)間。表1莫奈太爾及其代謝物質(zhì)譜參數(shù)注：帶“*”的離子為定量離子。5.液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測(cè)定和確證按照以上液相色譜測(cè)定條件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及樣液等體積參插進(jìn)樣測(cè)定,樣品中待測(cè)物含量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)，如果含量超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)稀釋后測(cè)定。圖31是莫奈太爾及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖。按照液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜條件測(cè)定試樣和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，如果試樣中待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品一致，定性離子對(duì)的相對(duì)豐度，是用相對(duì)于最強(qiáng)離子豐度的強(qiáng)度百分比表示，應(yīng)當(dāng)與濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的相對(duì)豐度一致，相對(duì)豐度允許偏差不超過表2規(guī)定的范圍，則可判斷試樣中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)物。表2定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差相對(duì)離子豐度＞50％＞20％～50％＞10％～20％≤10％允許的相對(duì)偏差±20％±25％±30％±50％6.空白試驗(yàn)除不加試樣外，均按上述操作步驟進(jìn)行。7.結(jié)果計(jì)算和表述用色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)或按式(1)計(jì)算試樣中待測(cè)物的含量，計(jì)算結(jié)果須扣除空白值：。式中：xi——試樣中被測(cè)組分含量，單位為微克每千克(μg/kg)；c——由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的樣液中被測(cè)組分的濃度，單位為納克每毫升(ng/ml)；c0——由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的空白試驗(yàn)中被測(cè)組分的濃度，單位為納克每毫升(ng/ml)；v——樣液最終定容體積，單位為毫升(ml)；m——最終樣液所代表的試樣質(zhì)量，單位為克(g)。計(jì)算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。結(jié)果與討論莫奈太爾幾乎不溶于水，微溶于丙二醇和正辛醇，溶于乙醇，易溶于二氯甲烷和聚乙二醇，發(fā)明人選取乙腈進(jìn)行提取試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈的提取效率最高，牛奶樣品中三種藥物的回收率在85.5％～100.2％之間，奶粉樣品中的提取效率稍低，為65.7％～80.3％。究其原因，乙腈具有沉淀蛋白的作用，加入奶粉樣品后，其蛋白迅速沉淀，導(dǎo)致待測(cè)物質(zhì)被包裹住，乙腈提取難以浸潤(rùn)到基質(zhì)內(nèi)部，降低了提取效率。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)奶粉樣品進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，先用水將奶粉溶解完全后，再加入飽和氯化鈉，不但起到分散的作用，還能沉淀部分蛋白，最后再用乙腈提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，奶粉樣品中各藥物的提取效率在79.3～92.9％；同樣，牛奶樣品加入飽和氯化鈉，再用乙腈提取也得到了很好的回收率，90.3％-104.1％。綜合考慮各因素，本發(fā)明選擇水-飽和氯化鈉-乙腈作為液態(tài)奶和奶粉的提取溶劑。提取液的凈化是樣品前處理過程中關(guān)鍵的一步,直接關(guān)系到方法的定量限和回收率。凈化的方式主要有液液分配和固相萃取(spe)兩種方式。本發(fā)明采用中性氧化鋁二種固相萃取小柱的凈化方式，填料為中性氧化鋁的小柱，凈化效果最佳，同時(shí)保證了較高的回收。此外，本發(fā)明還考察了淋洗體積的選擇。spe是利用選擇性吸附和選擇性洗脫的液相色譜分離原理。本發(fā)明采用中性氧化鋁固相萃取小柱凈化的原理是選擇性吸附雜質(zhì)，而讓被測(cè)化合物流出。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用2ml乙腈進(jìn)行洗脫的回收率比采用0ml乙腈進(jìn)行洗脫的回收率提高了3.9％～9.7％，洗脫體積增加，各藥物的回收率沒有明顯變化，為避免spe小柱上吸附的雜質(zhì)被洗脫下來和減少后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間，洗脫體積為2ml乙腈。在相同的色譜分離條件下分別使用inertsilc8柱、atlantishillic柱和atlantist3柱。結(jié)果如圖1至圖9所示:在采用atlantishillic柱進(jìn)行分離時(shí)，莫奈太爾及其代謝物(莫奈太爾亞砜、莫奈太爾砜)在1.8min初完成了分離，峰形嚴(yán)重拖尾且開叉，峰寬達(dá)0.8min。采用atlantist3柱進(jìn)行分離時(shí)，莫奈太爾及其代謝物(莫奈太爾亞砜、莫奈太爾砜)在8min處開始分離，峰形較差，峰寬達(dá)0.4min～0.55min。而在inertsilc8柱上獲得了理想的分離效果，峰形尖銳對(duì)稱。流動(dòng)相的組成和比例對(duì)被分離組分的色譜峰型及分離度有重要影響。流動(dòng)相的組成與色譜柱及被分離的組分有關(guān),流動(dòng)相的洗脫能力由其極性決定,強(qiáng)極性的流動(dòng)相占據(jù)吸附中心的能力強(qiáng),其洗脫能力強(qiáng),使組分的k值小,保留時(shí)間短。對(duì)于電噴霧質(zhì)譜的負(fù)離子模式，流動(dòng)相只能選擇ph值較高的具有可揮發(fā)性的鹽類或者水。采用甲醇作為有機(jī)相時(shí)莫奈太爾及其代謝物(莫奈太爾亞砜、莫奈太爾砜)的靈敏度優(yōu)于乙腈；當(dāng)水相乙酸銨濃度高于0.5mmol/l時(shí)，莫奈太爾及其代謝物靈敏度下降。此外，采用甲醇-0.5mmol/l乙酸銨體系進(jìn)行分離時(shí)莫奈太爾和莫奈太爾亞砜的靈敏度比甲醇-水體系增強(qiáng)了18％和16％，莫奈太爾砜則沒有明顯變化。綜合考慮分離度、保留時(shí)間和色譜峰形等因素，本發(fā)明采用甲醇-0.5mmol/l乙酸銨作為流動(dòng)相，分離結(jié)果如圖7、圖8、圖9所示。用蠕動(dòng)泵以10μl/min的流速分別連續(xù)注射0.5mg/l的莫奈太爾及其代謝物(莫奈太爾亞砜、莫奈太爾砜)標(biāo)準(zhǔn)溶液入esi離子源中，在負(fù)離子檢測(cè)模式下對(duì)莫奈太爾及其代謝物(莫奈太爾亞砜、莫奈太爾砜)進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，得到莫奈太爾及其代謝物準(zhǔn)分子離子峰(如圖31所示)：莫奈太爾準(zhǔn)分子離子峰(m/z472)和莫奈太爾亞砜準(zhǔn)分子離子峰(m/z488)和莫奈太爾砜準(zhǔn)分子離子峰(m/z504)。分別對(duì)準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，得到碎片離子信息，選取2個(gè)豐度強(qiáng)、穩(wěn)定的碎片離子作為定性與定量離子,以滿足歐盟2002/657/ec[17]對(duì)于lc-ms/ms方法的定性監(jiān)測(cè)的規(guī)定,即滿足1個(gè)母離子、2個(gè)子離子共4個(gè)鑒定點(diǎn)數(shù)的要求。莫奈太爾的特征碎片離子分別為m/z186和m/z166，莫奈太爾亞砜的特征碎片離子分別為m/z186和m/z166，莫奈太爾砜的特征碎片離子分別為m/z186和m/z166，最終選擇響應(yīng)高、基線噪音低的離子對(duì)m/z472/186，m/z488/186和m/z504/186為定量離子對(duì)。莫奈太爾及其代謝物(莫奈太爾亞砜、莫奈太爾砜)的二級(jí)質(zhì)譜圖見圖10至圖12。線性范圍和定量限在上述實(shí)驗(yàn)條件下，取一系列不同濃度的莫奈太爾及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液，以莫奈太爾及其代謝物響應(yīng)峰面積與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)峰面積之比對(duì)莫奈太爾及其代謝物的濃度進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明，當(dāng)莫奈太爾及其代謝物的濃度在0.1～5.0μg/l范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，其回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表3。表3回歸方程、相關(guān)系數(shù)本實(shí)驗(yàn)選擇空白的乳制品樣品，當(dāng)添加水平為2.0μg/kg時(shí)，信噪比大于10，表明其定量限(loq)可達(dá)到2.0μg/kg，空白樣品及定量限色譜圖見圖13至圖30。當(dāng)樣品中的莫奈太爾及其代謝物濃度超過此線性范圍時(shí)，可適當(dāng)加大樣品的稀釋倍數(shù)。方法的回收率和精密度選用未含有莫奈太爾及其代謝物的牛奶、酸奶和奶粉樣品分別進(jìn)行添加回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，添加水平為2.0、4.0、20μg/kg，按1.3節(jié)方法進(jìn)行提取和凈化，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算添加回收率?；厥章屎途芏冉Y(jié)果見表4。三個(gè)添加水平的平均回收率在79.5％～104.4％之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0％～5.3％。表明本方法回收率穩(wěn)定，可滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)要求。表4乳制品中莫奈太爾及其代謝物的加標(biāo)回收率與精密度(n＝6)實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果按照本發(fā)明的方法對(duì)目前市場(chǎng)銷售的18份牛奶、10份酸奶和15份奶粉樣品進(jìn)行了測(cè)定，均沒有檢出。由以上可見，本發(fā)明涉及固相萃取高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定乳制品中的莫奈太爾及其代謝物的方法。該方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于酸奶、牛奶和奶粉等乳制品中莫奈太爾及其代謝物的測(cè)定。當(dāng)前第1頁(yè)12