本發(fā)明屬于環(huán)境健康風險評價領域，更具體地說，涉及一種分析微塑料攜帶鄰苯二甲酸酯類化合物在生物體內(nèi)富集含量的方法。

背景技術：

近些年微塑料污染問題受到越來越多的關注，越來越多的環(huán)境介質(zhì)中檢測出微塑料。與此同時，眾多科學研究表明，微塑料能夠被不同營養(yǎng)級的生物攝入體內(nèi)并在體內(nèi)保留不同時間。當這些微塑料被生物體攝入體內(nèi)會引發(fā)很多健康風險，研究表明蚌攝入微塑料會造成生物體內(nèi)氧化應激，降低繁殖能力；斑馬魚攝入微塑料會造成肝臟代謝損傷；鯽魚攝入微塑料會造成神經(jīng)損傷；但是微塑料在環(huán)境中不是單獨存在，環(huán)境中的一些有機污染物會和微塑料相互作用，但是對微塑料與環(huán)境污染物相互作用的健康風險研究處于剛剛起步階段。中國專利申請?zhí)枮?01610045344.3，申請公布日為2016年6月15日的專利申請文件公開了一種定量分析微塑料在哺乳動物體內(nèi)富集和分布的方法，該方法是一種基于熒光標記技術來定量分析微塑料在哺乳動物體內(nèi)富集和分布規(guī)律的方法，屬于環(huán)境健康風險評價領域。其步驟為：合成具有熒光標記的微塑料；選取模式動物進行灌胃實驗；解剖模式動物采集肝臟，腎臟和小腸組織等主要器官；冷凍干燥組織；取一定質(zhì)量的凍干組織，采取濕發(fā)消解；配置不同濃度梯度的熒光微塑料懸濁溶液，根據(jù)熒光光譜儀測定的熒光值得到標準曲線；分別測定各個組織樣品消解液的熒光值，依據(jù)標準曲線得到單位組織樣品中微塑料含量；最終確定進入組織的微塑料含量。

目前對微塑料與環(huán)境污染物聯(lián)合作用的健康風險研究較多集中在終端毒性評估上，少有對微塑料上吸附的有機污染物含量進行評估，這是因為迄今為止人們對微塑料危害認知還只停留在微塑料本身具有的毒性這個層次上，因此缺乏對微塑料上吸附的污染物進入生物體的含量進行系統(tǒng)的定量分析，更無法獲知微塑料上吸附的污染物在哺乳動物體內(nèi)主要器官中的富集和分布規(guī)律，這為后期微塑料和污染物聯(lián)合作用的毒性評估帶來諸多不確定性。

盡管目前有多種方法可以檢測環(huán)境樣品(水、土壤和大氣顆粒)中鄰苯二甲酸酯含量，但是目前為止缺乏一個完整的方法去評估微塑料作為新型環(huán)境載體攜帶領苯二甲酸酯的能力，及其進入生物體內(nèi)后含量的定性和定量研究方法，因此，建立一種易操作，準確性高的定量分析微塑料上吸附環(huán)境污染物含量以及微塑料上吸附的污染物進入生物體的分布和富集規(guī)律的方法顯得尤為重要。本發(fā)明基于氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術和有機物萃取技術，可以簡單有效的定量分析微塑料上吸附污染物的含量，同時用預吸附污染物的微塑料進行哺乳動物染毒實驗，準確檢測哺乳動物體內(nèi)污染物的含量，為后期微塑料與污染物聯(lián)合作用的健康風險評估提供可靠的基礎數(shù)據(jù)。

技術實現(xiàn)要素：

1.要解決的問題

由于目前普遍缺乏對微塑料吸附鄰苯二甲酸酯類化合物能力定量分析和微塑料預吸附鄰苯二甲酸酯類化合物在生物體內(nèi)分布及其含量定量分析方法，本發(fā)明提供一種基于氣象色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術和有機物萃取技術分析微塑料與鄰苯二甲酸酯類化合物聯(lián)合作用規(guī)律，并準確定量分析預吸附于微塑料上的鄰苯二甲酸酯進生物體內(nèi)含量，為后期微塑料與鄰苯二甲酸酯聯(lián)合作用的毒性作用提供基礎數(shù)據(jù)。

2.技術方案

為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術方案如下：

一種分析微塑料攜帶鄰苯二甲酸酯化合物在生物體內(nèi)富集含量的方法，其步驟包括：

(1)預吸附鄰苯二甲酸酯化合物的微塑料的制備：首先配置濃度為5-50μg/l的鄰苯二甲酸酯化合物溶液，然后按照體積與質(zhì)量比為10：1(單位是l:g)稱取粒徑1-50μm聚乙烯微塑料加入上述污染物溶液中，并在搖床中震蕩48-96小時，上述反應結束后，分離出溶液中的微塑料，并用超純水重新配置濃度0.1-0.5mg/ml微塑料溶液；

(2)微塑料上鄰苯二甲酸酯類化合物吸附量檢測：用有機溶劑對過濾出微塑料后的反應溶液進行液液萃取，并用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測萃取中鄰苯二甲酸酯類化合物的濃度；

(3)模式動物暴露實驗：選擇上述預吸附鄰苯二甲酸酯化合物的微塑料作為受試樣品，選取模式動物進行灌胃染毒實驗，以健康的模式動物作為空白組；

(4)樣品采集：預吸附鄰苯二甲酸酯化合物的微塑料染毒實驗周期結束后，解剖模式動物，并采集相應的組織樣品；

(5)冷凍干燥組織樣品：使用冷凍干燥儀，分別冷凍干燥空白組和染毒組的組織樣品至恒重；

(6)有機溶劑液萃取組織中鄰苯二甲酸酯化合物：稱取一定量的凍干組織樣品，分別加入有機溶劑進行萃取組織中的鄰苯二甲酸酯化合物；

(7)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測組織提取液中的鄰苯二甲酸酯化合物的含量：首先配置不同濃度的鄰苯二甲酸酯化合物溶液，建立相應的標準曲線；其次，分別檢測空白組和染毒組的生物組織提取液中鄰苯二甲酸酯化合物含量。

更進一步地，所述的步驟(1)中，搖床在條件為25℃溫度，200轉(zhuǎn)/分鐘震蕩48小時，分離微塑料條件為使用0.22μm孔徑的親水玻璃纖維膜ptef過濾出微塑料，然后使用超純水重新配置濃度0.1-0.5mg/ml微塑料溶液。

更進一步地，所述的步驟(2)中液液萃取的條件為：往反應溶液中加入5ml正己烷和丙酮體積比為1:1混合有機溶劑后，震蕩30分鐘后，轉(zhuǎn)移上層有機萃取液，同時再加入同等體積的上述萃取液，重復操作一次；萃取液過無水硫酸鈉柱去除水后，氮吹有機萃取液至500μl左右，轉(zhuǎn)移到氣相小瓶中并定容至1ml，同時建立標準曲線，然后氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用檢測反應液中所剩鄰苯二甲酯類化合物含量。

更進一步地，所述的步驟(3)中，模式動物為sd大鼠或者cd-1小鼠，暴露周期為30-120天。

更進一步地，步驟(4)中采集的模式動物的組織樣品為小腸、腎臟和肝臟或者其組合。

更進一步地，步驟(5)中組織樣品在條件為-80℃和0.02mbar下，冷凍干燥組織至恒重。

更進一步地，步驟(6)中具體機萃取條件為：每0.1g組織樣品中加入5ml正己烷和丙酮體積比為1:1混合有機溶劑后，渦旋2分鐘充分混合，轉(zhuǎn)移至超聲儀中超聲30分鐘，超聲結束后取上層有機萃取液，0.22μm孔徑有機膜過濾，并氮吹濃縮過濾后的有機溶劑至1ml。

更進一步地，所述步驟(2)和步驟(7)中采用的色譜與質(zhì)譜聯(lián)用檢測的條件分別為：

氣相色譜條件為：

載氣：高純氦氣；

柱流量：1.0ml/min；

進口溫度：280℃；

進樣方式：不分流進樣；

進樣量：1μl；

升溫程序：60℃保溫2min，然后按照8℃/min的速度升至300℃，保溫15min；

質(zhì)譜條件為：

質(zhì)譜掃描范圍：120-180amu；

離子源溫度：250℃；

界面?zhèn)鬏敎囟龋?50℃；

掃描時間：1s/次或者更少，每個峰至少5次掃描。

3.有益效果

相比于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果為：

(1)本發(fā)明基于色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術和有機物萃取技術，提供一種基于氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合檢測技術和有機物萃取組織中污染物技術分析微塑料上吸附鄰苯二甲酸酯類化合物含量以及微塑料上吸附的鄰苯二甲酸酯類化合物進入生物體內(nèi)的含量的方法，填補了至今無簡便、準確定量分析微塑料上吸附鄰苯二甲酸酯類化合物含量以及微塑料上吸附的鄰苯二甲酸酯類化合物進入生物體內(nèi)的含量的方法，為后續(xù)微塑料與鄰苯二甲酯類化合物聯(lián)合作用的環(huán)境健康風險評估提供不可或缺的基礎數(shù)據(jù)；

(2)本發(fā)明與專利201610045344.3最大的區(qū)別是，本發(fā)明是建立一種方法檢測由微塑料攜帶環(huán)境污染物鄰苯二甲酸酯類化合物進入體內(nèi)含量的方法，為評估微塑料與環(huán)境污染物復合毒性的提供基礎支撐，然而現(xiàn)有專利201610045344.3是一種通過使用熒光標記材料和熒光光譜檢測技術定性定量分析微塑料進入生物體內(nèi)的含量，所以兩者具有本質(zhì)區(qū)別，從專利201610045344.3不易想到本發(fā)明的技術方法，理由如下(1)迄今為止，微塑料的研究重點在于微塑料的本身毒性，如能否進入生物體內(nèi)，粒徑大小是否影響毒性大小，等等；(2)把微塑料與環(huán)境中已經(jīng)存在污染物作為一個復合污染物是一個非常新穎的研究微塑料在環(huán)境中行為、毒性遷移變化的全新角度，同時也具有一定的復雜性；

(3)本發(fā)明能夠簡單有效的分析微塑料攜帶鄰苯二甲酸酯類化合物進入哺乳動物小鼠和大鼠體內(nèi)含量，解決當前相關檢測技術的空白，為準確評價微塑料與鄰苯二甲酸酯類化合物聯(lián)合作用的健康風險提供技術支持。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的流程圖；

圖2為本發(fā)明的微塑料上吸附鄰苯二甲酸二辛酯(diethylhexylphthalate，dehp)的含量和暴露組小鼠各組織器官中鄰苯二甲酸二辛酯(dehp)含量；

圖3為本發(fā)明的微塑料上吸附鄰苯二甲酸二丁酯(di-n-butylphthalate，dbp)的含量和暴露組小鼠各組織器官中鄰苯二甲酸二丁酯(dbp)含量；

圖4為本發(fā)明的微塑料上吸附鄰苯二甲酸二乙酯(diethylphthalate,dep)的含量和暴露組大鼠各組織器官中的鄰苯二甲酸二乙酯(dep)含量。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明進一步進行描述。

實施例1

基于色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析技術和有機物萃取技術來定量分析微塑料攜帶鄰苯二甲酸酯進入實驗小鼠(cd-1)內(nèi)含量的方法，定量分析粒徑為40-50μm聚乙烯材質(zhì)(pe)的微塑料攜帶鄰苯二甲酸二辛酯(diethylhexylphthalate，dehp)進入小鼠體內(nèi)含量，分析流程如圖1所示，具體步驟如下：

(1)預吸附dehp的pe微塑料的制備：首先配置濃度為50μg/l的dehp溶液50ml，然后稱取10mg粒徑40-50μm聚乙烯微塑料(pe-mps)加入上述污染物溶液中，并在搖床中震蕩48小時，搖床在條件為25℃溫度，200轉(zhuǎn)/分鐘。上述反應結束后，使用0.22μm孔徑的親水玻璃纖維膜(ptef)分離出溶液中的微塑料，并用超純水重新配置濃度0.1mg/mlpe微塑料溶液。

(2)pe微塑料上dehp吸附量檢測：5ml正己烷和丙酮混合有機溶劑(1:1)，后加入50ml反應液中震蕩30分鐘后，轉(zhuǎn)移上層有機萃取液，同時再加入同等體積的上述萃取液，重復操作一次。萃取液過無水硫酸鈉柱去除水后，氮吹有機萃取液至500μl左右，轉(zhuǎn)移到氣相小瓶中并定容至1ml。同時建立dehp的標準曲線，然后氣相色譜質(zhì)譜(gc-ms，agilenttechnologies,usa)聯(lián)用檢測反應液中所剩dehp含量，檢測結果如圖2所示，其中氣相色譜條件為：

載氣：高純氦氣；

柱流量：1.0ml/min；

進口溫度：280℃；

進樣方式：不分流進樣；

進樣量：1μl；

升溫程序：60℃保溫2min，然后按照8℃/min的速度升至300℃，保溫15min；

質(zhì)譜條件為：

質(zhì)譜掃描范圍：120-180amu；

離子源溫度：250℃；

界面?zhèn)鬏敎囟龋?50℃；

掃描時間：1s/次，每個峰8次掃描。

(3)實驗小鼠暴露實驗：選擇上述預吸附dehp的pe微塑料水溶液(0.1mg/ml,pe-mps)作為受試樣品，選取cd-1雄性小鼠進行灌胃染毒實驗(每天1ml)，同時選取健康cd-1雄性小鼠作為空白組，每個實驗組組10只模式哺乳動物，灌胃染毒30天；

(4)樣品采集：染毒實驗周期結束后，解剖小鼠，并采集腸道、腎臟和肝臟等組織樣品，放入液氮中保存；

(5)冷凍干燥組織樣品：從液氮中取出組織樣品，使用冷凍干燥儀(labconco,usa)，設置條件為-80℃和0.02mbar，分別冷凍干燥空白組和染毒組的小鼠組織樣品至恒重；

(6)有機溶劑液萃取組織中dehp：稱取0.1g干燥組織樣品中加入5ml正己烷和丙酮混合有機溶劑(1:1)后，渦旋2分鐘充分混合，轉(zhuǎn)移至超聲儀中超聲30分鐘，超聲結束后取上層有機萃取液，0.22μm孔徑有機膜過濾，氮吹濃縮過濾后的有機溶劑至1ml。

(7)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測組織提取液中的dehp含量：首先配置不同濃度的dehp溶液，建立相應的標準曲線；其次，分別檢測空白組和染毒組的小鼠不同組織提取液中dehp含量，檢測結果如圖2所示。具體檢測條件為：

載氣：高純氦氣；

柱流量：1.0ml/min；

進口溫度：280℃；

進樣方式：不分流進樣；

進樣量：1μl；

升溫程序：60℃保溫2min，然后按照8℃/min的速度升至300℃，保溫15min；

質(zhì)譜條件為：

質(zhì)譜掃描范圍：120-180amu；

離子源溫度：250℃；

界面?zhèn)鬏敎囟龋?50℃；

掃描時間：1s/次，每個峰8次掃描。

實施例2

基于色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析技術和有機物萃取技術來定量分析微塑料攜帶鄰苯二甲酸酯進入實驗小鼠(cd-1)體內(nèi)含量的方法，定量分析粒徑為1-5μm聚乙烯材質(zhì)(pe)的微塑料攜帶鄰苯二甲酸二丁酯(di-n-butylphthalate，dbp)進入小鼠體內(nèi)含量，分析流程如圖1所示，具體步驟如下：

(1)預吸附dbp的pe微塑料的制備：首先配置濃度為5μg/l的dbp溶液50ml，然后稱取10mg粒徑1-5μm聚乙烯微塑料(pe-mps)加入上述污染物溶液中，并在搖床中震蕩96小時，搖床在條件為25℃溫度，200轉(zhuǎn)/分鐘。上述反應結束后，使用0.22μm孔徑的親水玻璃纖維膜(ptef)分離出溶液中的微塑料，并用超純水重新配置濃度0.5mg/mlpe微塑料溶液。

(2)pe微塑料上dbp吸附量檢測：5ml正己烷和丙酮混合有機溶劑(1:1)，后加入50ml反應液中震蕩30分鐘后，轉(zhuǎn)移上層有機萃取液，同時再加入同等體積的上述萃取液，重復操作一次。萃取液過無水硫酸鈉柱去除水后，氮吹有機萃取液至500μl左右，轉(zhuǎn)移到氣相小瓶中并定容至1ml。同時建立dbp的標準曲線，然后氣相色譜質(zhì)譜(gc-ms，agilenttechnologies,usa)聯(lián)用檢測反應液中所剩dbp含量，檢測結果如圖3所示，其中氣相色譜條件為：

載氣：高純氦氣；

柱流量：1.0ml/min；

進口溫度：280℃；

進樣方式：不分流進樣；

進樣量：1μl；

升溫程序：60℃保溫2min，然后按照8℃/min的速度升至300℃，保溫15min；

質(zhì)譜條件為：

質(zhì)譜掃描范圍：120-180amu；

離子源溫度：250℃；

界面?zhèn)鬏敎囟龋?50℃；

掃描時間：1s/次，每個峰8次掃描。

(3)實驗小鼠暴露實驗：選擇上述預吸附dbp的pe微塑料水溶液(0.5mg/ml，pe-mps)作為受試樣品，選取cd-1雄性小鼠進行灌胃染毒實驗(每天1ml)，同時選取健康cd-1雄性小鼠作為空白組，每個實驗組組10只模式哺乳動物，灌胃染毒90天；

(4)樣品采集：染毒實驗周期結束后，解剖小鼠，并采集腸道、腎臟和肝臟等組織樣品，放入液氮中保存；

(5)冷凍干燥組織樣品：從液氮中取出組織樣品，使用冷凍干燥儀(labconco,usa)，設置條件為-80℃和0.02mbar，分別冷凍干燥空白組和染毒組的小鼠組織樣品至恒重；

(6)有機溶劑液萃取組織中dbp：稱取0.1g干燥組織樣品中加入5ml正己烷和丙酮混合有機溶劑(1:1)后，渦旋2分鐘充分混合，轉(zhuǎn)移至超聲儀中超聲30分鐘，超聲結束后取上層有機萃取液，0.22μm孔徑有機膜過濾，氮吹濃縮過濾后的有機溶劑至1ml。

(7)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測組織提取液中的dbp含量：首先配置不同濃度的dbp溶液，建立相應的標準曲線；其次，分別檢測空白組和染毒組的小鼠不同組織提取液中dbp含量，檢測結果如圖3所示。具體檢測條件為：

載氣：高純氦氣；

柱流量：1.0ml/min；

進口溫度：280℃；

進樣方式：不分流進樣；

進樣量：1μl；

升溫程序：60℃保溫2min，然后按照8℃/min的速度升至300℃，保溫15min；

質(zhì)譜條件為：

質(zhì)譜掃描范圍：120-180amu；

離子源溫度：250℃；

界面?zhèn)鬏敎囟龋?50℃；

掃描時間：1s/次，每個峰8次掃描。

實施例3

基于色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析技術和有機物萃取技術來定量分析微塑料攜帶鄰苯二甲酸酯進入實驗大鼠(sd)體內(nèi)含量的方法，定量分析粒徑為10-30μm聚乙烯材質(zhì)(pe)的微塑料攜帶鄰苯二甲酸二乙酯(diethylphthalate,dep)進入大鼠體內(nèi)含量，分析流程如圖1所示，具體步驟如下：

(1)預吸附dep的pe微塑料的制備：首先配置濃度為25μg/l的dep溶液50ml，然后稱取10mg粒徑10-30μm聚乙烯微塑料(pe-mps)加入上述污染物溶液中，并在搖床中震蕩72小時，搖床在條件為25℃溫度，200轉(zhuǎn)/分鐘。上述反應結束后，使用0.22μm孔徑的親水玻璃纖維膜(ptef)分離出溶液中的微塑料，并用超純水重新配置濃度0.25mg/mlpe微塑料溶液。

(2)pe微塑料上dep吸附量檢測：5ml正己烷和丙酮混合有機溶劑(1:1)，后加入50ml反應液中震蕩30分鐘后，轉(zhuǎn)移上層有機萃取液，同時再加入同等體積的上述萃取液，重復操作一次。萃取液過無水硫酸鈉柱去除水后，氮吹有機萃取液至500μl左右，轉(zhuǎn)移到氣相小瓶中并定容至1ml。同時建立dep的標準曲線，然后氣相色譜質(zhì)譜(gc-ms，agilenttechnologies,usa)聯(lián)用檢測反應液中所剩dep含量，檢測結果如圖4所示，其中氣相色譜條件為：

載氣：高純氦氣；

柱流量：1.0ml/min；

進口溫度：280℃；

進樣方式：不分流進樣；

進樣量：1μl；

升溫程序：60℃保溫2min，然后按照8℃/min的速度升至300℃，保溫15min；

質(zhì)譜條件為：

質(zhì)譜掃描范圍：120-180amu；

離子源溫度：250℃；

界面?zhèn)鬏敎囟龋?50℃；

掃描時間：1s/次，每個峰8次掃描。

(3)實驗大鼠暴露實驗：選擇上述預吸附dep的pe微塑料水溶液(0.25mg/ml，pe-mps)作為受試樣品，選取sd雄性大鼠進行灌胃染毒實驗(每天1ml)，同時選取健康cd-1雄性小鼠作為空白組，每個實驗組組10只模式哺乳動物，灌胃染毒120天；

(4)樣品采集：染毒實驗周期結束后，解剖sd大鼠，并采集腸道、腎臟和肝臟等組織樣品，放入液氮中保存；

(5)冷凍干燥組織樣品：從液氮中取出組織樣品，使用冷凍干燥儀(labconco,usa)，設置條件為-80℃和0.02mbar，分別冷凍干燥空白組和染毒組的大鼠組織樣品至恒重；

(6)有機溶劑液萃取組織中dep：稱取0.1g干燥組織樣品中加入5ml正己烷和丙酮混合有機溶劑(1:1)后，渦旋2分鐘充分混合，轉(zhuǎn)移至超聲儀中超聲30分鐘，超聲結束后取上層有機萃取液，0.22μm孔徑有機膜過濾，氮吹濃縮過濾后的有機溶劑至1ml。

(7)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測組織提取液中的dep含量：首先配置不同濃度的dep溶液，建立相應的標準曲線；其次，分別檢測空白組和染毒組的大鼠不同組織提取液中dep含量，檢測結果如圖4所示。具體檢測條件為：

載氣：高純氦氣；

柱流量：1.0ml/min；

進口溫度：280℃；

進樣方式：不分流進樣；

進樣量：1μl；

升溫程序：60℃保溫2min，然后按照8℃/min的速度升至300℃，保溫15min；

質(zhì)譜條件為：

質(zhì)譜掃描范圍：120-180amu；

離子源溫度：250℃；

界面?zhèn)鬏敎囟龋?50℃；

掃描時間：1s/次，每個峰8次掃描。

綜上所述，結合附圖和具體實施例對本發(fā)明的實施方式做了詳細的說明，但是本發(fā)明不限于上述實施方式，在所屬技術領域普通技術人員所具備的知識范圍內(nèi)，還可以在不脫離本發(fā)明宗旨的前提下做出相應變化。