本發(fā)明涉及一種生物樣品中列汀類藥物的分析檢測方法，尤其涉及一種人血漿中沙格列汀和5-羥基沙格列汀的lc-ms/ms高通量檢測方法。

背景技術(shù)：

近年來，我國糖尿病的患病率有明顯上升趨勢，其中以2型糖尿病為主，沙格列汀是一種二肽基肽酶4(dpp4)競爭性抑制劑，可降低腸促胰島激素的失活速率，增高其血液濃度，從而以葡萄糖依賴性的方式降低2型糖尿病患者空腹和餐后的血糖濃度；從目前查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻看來，測定生物樣品中列汀類藥物的分析方法主要有高效液相紫外檢測法(hplc-uv)和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(lc-ms/ms)，其中hplc-uv具有操作簡單和測試成本低廉等特點，但是該類方法靈敏度較低，無法用于低劑量的藥代動力學和生物等效性研究；lc-ms/ms是以質(zhì)譜為檢測手段的色譜技術(shù)，它將高效液相色譜的分離能力與質(zhì)譜儀的檢測和結(jié)構(gòu)分析功能巧妙結(jié)合，具有其它儀器不可比擬的高靈敏度和高選擇性，在運行多級反應(yīng)監(jiān)測(mrm)模式時最佳，測定藥物濃度可達到pg水平，已成為國內(nèi)外進行藥代動力學和生物等效性研究最強有力的分析工具之一。

目前有數(shù)篇文獻使用lc-ms/ms技術(shù)檢測血漿中沙格列汀和5-羥基沙格列汀濃度，檢測方法主要應(yīng)用于臨床及非臨床藥動學研究，樣品提取方法涵蓋了蛋白沉淀法、固相萃取法和液-液提取法，靈敏度最低可達50pg/ml；另外，有文獻報道沙格列汀在血漿中與血漿中的二肽基肽酶4(dpp4)結(jié)合，產(chǎn)生特異性吸附，這種吸附在低藥物濃度血漿樣品比較明顯，容易導致人血漿中測得的沙格列汀濃度偏低，因此，亟待開發(fā)一種簡便快速、精確度高的樣品前處理方法，結(jié)合lc-ms/ms色譜技術(shù)，縮短運行時間的同時實現(xiàn)高通量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供了一種簡便快速、精度高，適合大批量樣品檢測的人血漿中沙格列汀和5-羥基沙格列汀的lc-ms/ms高通量檢測方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種人血漿中沙格列汀和5-羥基沙格列汀的lc-ms/ms高通量檢測方法，包括以下步驟：

s1、血漿樣品前處理：取待測血漿樣品混入內(nèi)標溶液，加入chaps水溶液后渦流并加熱，再加入乙腈后渦流并離心，取上清液，氮氣吹干后，加入復溶液進行復溶，得到待測樣品；所述內(nèi)標溶液為以乙腈：水(50:50，v/v)制成的同位素標記物¹³cd2-沙格列汀和¹³cd2-5-羥基沙格列汀濃度分別為5.00和10.0ng/ml的混合溶液，所述復溶液為乙腈：水：甲酸體積比為95:5:0.1的混合液；

s2、采用lc-ms/ms法測定待測樣品中沙格列汀、5-羥基沙格列汀、¹³cd2-沙格列汀和¹³cd2-5-羥基沙格列汀的濃度：

i.lc條件：hilic親水色譜柱：100mm×3.0m，3μm；柱溫：40℃；進樣體積：5μl；流動相a：含有0.2％甲酸的5mm醋酸銨水溶液；流動相b：乙腈，采用體積比為10：90的a：b相等梯度洗脫；

ii.ms條件：離子源：大氣壓化學電離源apci；霧化電流：3.0μa；離子源溫度：500℃；cur：30psi；掃描模式：正離子多反應(yīng)監(jiān)測+mrm。

s3、標準曲線樣品的配制：稱取沙格列汀和5-羥基沙格列汀，沙格列汀以乙腈溶解并定容，5-羥基沙格列汀以乙腈：水(50:50，v/v)溶解并定容，配制成濃度約為1.00mg/ml的貯備液，以乙腈：水(3:1，v/v)逐級稀釋得到混合標準系列工作溶液，以人空白血漿稀釋該工作溶液，制成標準曲線樣品，以上述lc-ms-ms條件檢測，并根據(jù)檢測結(jié)果繪制相應(yīng)的沙格列汀和5-羥基沙格列汀的標準曲線。

進一步的，所述步驟s1中所述的chaps水溶液為5％chaps水溶液。

進一步的，所述步驟s1中渦流的時間均為2min，室溫下渦流的轉(zhuǎn)速均為4500rpm。

進一步的，所述步驟s1中加熱的時間為5min，加熱的溫度為55℃。

進一步的，所述步驟s2中的lc條件還包括自動進樣器溫度為室溫，流動相的流速為0.7ml/min。

進一步的，所述步驟s2中正離子多反應(yīng)監(jiān)測的沙格列汀m/z316.3→180.0，¹³cd2-沙格列汀m/z319.4→180.0，5-羥基沙格列汀m/z332.3→196.0，¹³cd2-5-羥基沙格列汀m/z335.4→196.0，碰撞能量ce均為31ev。

本發(fā)明提供的人血漿中沙格列汀和5-羥基沙格列汀的lc-ms/ms高通量檢測方法中的血漿樣品經(jīng)過chaps和加熱處理，縮短了前處理的時間，提高檢測方法的靈敏度和檢測的準確性，另外，單個樣品色譜分析時間縮短為3分鐘，而且解決了梯度洗脫帶來的殘留問題；本發(fā)明提供的人血漿中沙格列汀和5-羥基沙格列汀的lc-ms/ms高通量檢測方法簡便快速、色譜運行時間短而且通量高，為沙格列汀片生物等效性研究血漿樣品的測定提供了簡單、準確、實用的方法。

上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實施，以下以本發(fā)明的較佳實施例詳細說明如后。

附圖說明

圖1是本發(fā)明提供的人血漿中沙格列汀和5-羥基沙格列汀的lc-ms/ms高通量檢測方法中沙格列汀的離子掃描質(zhì)譜圖；

圖2本發(fā)明提供的人血漿中沙格列汀和5-羥基沙格列汀的lc-ms/ms高通量檢測方法中¹³cd2-沙格列汀的離子掃描質(zhì)譜圖；

圖3本發(fā)明提供的人血漿中沙格列汀和5-羥基沙格列汀的lc-ms/ms高通量檢測方法中5-羥基沙格列汀的離子掃描質(zhì)譜圖；

圖4本發(fā)明提供的人血漿中沙格列汀和5-羥基沙格列汀的lc-ms/ms高通量檢測方法中¹³cd2-5-羥基沙格列汀的離子掃描質(zhì)譜圖；

圖5是實施例一中空白血漿樣品中沙格列汀和5-羥基沙格列汀mrm色譜圖；

圖6是實施例一中l(wèi)loq血漿樣品中沙格列汀和5-羥基沙格列汀mrm色譜圖；

圖7是實施例一中沙格列汀血漿樣品的標準曲線；

圖8是實施例一中5-羥基沙格列汀血漿樣品的標準曲線；

圖9是實施例二中空腹給藥的24名健康受試者單次口服5mg受試制劑和參比制劑平均藥物濃度-時間曲線；

圖10是實施例二中餐后給藥的24名健康受試者單次口服5mg受試制劑和參比制劑平均藥物濃度-時間曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實施例一人血漿中沙格列汀及其代謝產(chǎn)物5-羥基沙格列汀含量lc-ms/ms測定方法的建立

1、溶液及樣品的配制

1.1標準系列樣品：精密稱取各對照品適量，沙格列汀以乙腈溶解并定容，5-羥基沙格列汀以乙腈：水(50:50，v/v)溶解并定容，配制成濃度約為1.00mg/ml的貯備液，精密吸取各自貯備液適量，以乙腈：水(3:1，v/v)逐級稀釋得到混合標準系列工作溶液，以人空白血漿稀釋該工作溶液，得到混合標準系列樣品沙格列汀和5-羥基沙格列汀濃度范圍分別為0.200～50.0和0.298-74.4ng/ml，用于繪制標準曲線；

1.2質(zhì)控樣品：采用與標準系列樣品相似方法配制沙格列汀和5-羥基沙格列汀四個濃度水平混合質(zhì)控樣品，定量下限(lowerlimitofquantification，lloq)濃度為0.200/0.298ng/ml，低質(zhì)控(lowqualitycontrol，lqc)濃度為0.600/0.893ng/ml，中質(zhì)控(mediumqualitycontrol，mqc)濃度為5.00/59.5ng/ml，高質(zhì)控(highqualitycontrol，mqc)濃度為40.0/59.5ng/ml；

1.3內(nèi)標溶液：精密稱取各內(nèi)標對照品，分別以乙腈和乙腈：水(50：50，v/v)溶解并定容，配制成¹³cd2-沙格列汀和¹³cd2-5-羥基沙格列汀濃度均約為0.700mg/ml的內(nèi)標貯備液，精密吸取上述各內(nèi)標貯備液適量，加乙腈：水(1：3，v/v)稀釋，獲得¹³cd2-沙格列汀和¹³cd2-5-羥基沙格列汀濃度分別為5.00和10.0ng/ml的混合內(nèi)標溶液。

2、血漿樣品前處理

向96孔板中加入100μl血漿樣品，50.0μl內(nèi)標溶液和5％chaps水溶液10.0μl，渦流2min后，55℃加熱5min，所有樣品中加入500μl的乙腈，渦流2min，在室溫下以4500rpm離心10min，取400μl上清液于40℃氮氣條件下吹干，殘留物以乙腈：水：甲酸(95:5:0.1，v/v/v)溶解，渦流混勻，置于自動進樣器內(nèi)，進行l(wèi)c-ms/ms分析，進樣體積為5.0μl。

3、檢測儀器及分析條件

3.1日本島津公司lc-30ad快速液相色譜系統(tǒng)，串聯(lián)配有大氣壓化學電離源(apci)的加拿大sciex公司提供的5500型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀。

3.2分析條件

3.2.1色譜條件：色譜柱采用菲羅門lunahilic(100mm×3.0m,3μm)，柱溫40℃，自動進樣器設(shè)置為室溫，流動相a為5mm醋酸銨水溶液(含0.2％甲酸)，流動相b為乙腈，采用90％b相等度洗脫，流速0.7ml/min；

3.2.2質(zhì)譜條件：大氣壓化學電離源(apci)；霧化電流為3.0μa，離子源溫度為500℃，氣簾氣(n2)壓力為30psi，掃描模式為正離子多反應(yīng)監(jiān)測(+mrm)，監(jiān)測離子反應(yīng)分別為：沙格列汀m/z316.3→180.0，¹³cd2-沙格列汀m/z319.4→180.0，5-羥基沙格列汀m/z332.3→196.0，¹³cd2-5-羥基沙格列汀m/z335.4→196.0；碰撞能量(collisionenergy，ce)均為31ev。

4、方法學驗證

按照中國藥典及美國fda指導原則對本方法進行了方法學驗證，內(nèi)容包括穩(wěn)定性、選擇性、線性、準確度、精密度、殘留效應(yīng)、回收率、基質(zhì)效應(yīng)和稀釋可靠性。

4.1選擇性

取六個來源不同的空白血漿及各自配制的lloq樣品處理后進樣分析，獲得空白血漿樣品中沙格列汀和5-羥基沙格列汀mrm色譜圖圖5和lloq樣品沙格列汀和5-羥基沙格列汀mrm色譜圖圖6，色譜共流出干擾物的峰面積均小于lloq待測物峰面積的20％，小于內(nèi)標峰面積的5％。

4.2精密度和準確度

方法驗證分析每一批測定四個濃度的質(zhì)控樣本各六個樣本，連續(xù)測定三批，計算批內(nèi)和批間精密度和準確度，lloq日內(nèi)、日間精密度以相對標準差(rsd)計算小于20％方可接受，準確度以相對偏差計算(re)在±20％之間方可接受，其余各濃度水平的qc樣品各成分日內(nèi)、日間精密度需小于15％方可接受，準確度在±15％之間方可接受，結(jié)果見表1和表2。

表1.沙格列汀的精密度和準確度

表2.5-羥基沙格列汀的精密度和準確度

4.3標準曲線

以待測物理論濃度為橫坐標(x)，待測物與內(nèi)標物的峰面積比為縱坐標(y)，用加權(quán)(w＝1/x²)最小二乘法進行回歸運算，求得的直線回歸方程即為標準曲線,方法驗證每一分析批對標準曲線樣品雙樣本分析，獲得沙格列汀血漿樣品標準曲線圖7和5-羥基沙格列汀血漿樣品標準曲線圖8，圖7得到的線性方程式y(tǒng)＝0.401x+0.00458(r＝0.9994)表示沙格列汀在0.200～50.0ng/ml的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，圖8得到的線性方程式y(tǒng)＝0.121x+0.00256(r＝0.9982)表示5-羥基沙格列汀在0.298～74.4ng/ml的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

4.4殘留效應(yīng)

殘留效應(yīng)驗證為在高濃度樣本檢測后以空白樣本進樣，分析待測物和內(nèi)標出峰時間處儀器的響應(yīng)值。在定量上限樣品后進樣空白血漿樣品，空白樣品待測物保留時間處的色譜峰面積均小于當日標準曲線定量下限峰面積的20％，內(nèi)標保留時間處色譜峰面積均小于當日標曲定量下限內(nèi)標峰面積的5％。

4.5提取回收率

取空白血漿100μl(n＝18)，提取后(不加內(nèi)標溶液)取全部乙腈層液體分別加入和lqc、mqc和hqc相同濃度的待測物溶液和內(nèi)標溶液，渦流混勻后，取400μl于氮氣流下吹干，殘留物加入150μl溶解相，進樣測定，另提取lqc、mqc和hqc各6份，進樣測定，以2種處理方法的峰面積比值計算提取回收率。

在低中高三個濃度水平下沙格列汀的提取回收率分別為93.6％、97.2％和93.3％，內(nèi)標的提取回收率為99.4％；5-羥基沙格列汀的提取回收率分別為101％、99.9％和97.2％，內(nèi)標的提取回收率為105％。

4.6基質(zhì)效應(yīng)

取溶血血漿、餐后高脂血漿及不同來源空白血漿(n＝6)，提取后(不加內(nèi)標溶液)，取全部乙腈層液體加入和lqc和hqc相同濃度的待測物溶液和內(nèi)標溶液渦流混勻后，取400μl于氮氣流下吹干，殘留物加入150μl溶解相，進樣測定，另取去離子水代替血漿，按上述方法處理，以兩種方法獲得的峰面積比值計算基質(zhì)因子，通過基質(zhì)因子的rsd評估基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)因子小于15％方可接受。

低濃度和高濃度兩個水平下沙格列汀的基質(zhì)因子分別為103％和95.7％，絕對基質(zhì)因子在100-115％之間，rsd均不大于2.9％％；5-羥基沙格列汀基質(zhì)因子分別為103％和96.4％，絕對基質(zhì)因子在78.1～91.8％之間，rsd均不大于4.1％。以上結(jié)果表明，基質(zhì)不干擾待測物定量分析。

4.7穩(wěn)定性

穩(wěn)定性考核覆蓋整個樣本的檢測過程，設(shè)置低濃度2.00ng/ml和高濃度800ng/ml兩個濃度，每一個濃度重復3個樣本，考察血漿樣本的室溫20小時穩(wěn)定性、-70℃放置90天穩(wěn)定性、8次反復凍融穩(wěn)定性、提取后樣本室溫放置穩(wěn)定性以及儲備液長期穩(wěn)定性。結(jié)果見表3。

表3.沙格列汀和5-羥基沙格列汀穩(wěn)定性(n＝3，均值，％偏差)

4.8.稀釋可靠性

5倍稀釋：制備沙格列汀和5-羥基沙格列汀濃度分別為200和298ng/ml的血漿樣品，用空白血漿稀釋五倍后，取100μl稀釋后血漿進行預(yù)處理，處理完畢后進樣分析，每個濃度制備6個樣本，測得沙格列汀稀釋質(zhì)控樣品的精密度和準確度偏差為1.6％和7.2％，5-羥基沙格列汀稀釋質(zhì)控樣品的精密度和準確度偏差為1.7％和5.1％。

實施例二測定人血漿中的沙格列汀及其代謝產(chǎn)物5-羥基沙格列汀

應(yīng)用建立的人血漿中沙格列汀及其代謝產(chǎn)物5-羥基沙格列汀含量lc-ms/ms測定方法測定血漿中沙格列汀及5-羥基沙格列汀的濃度，用于評價沙格列汀片生物等效性研究。

48名健康受試者，入組，男女各半，其中24名空腹給藥，24名餐后給藥，空腹給藥組受試者以站立位空腹服用受試或者參比制劑，餐后給藥組從開始進餐計時30min后依次以站立位空腹服用受試或者參比制劑，于給藥前及給藥后0.25h、0.5h、0.75h、1.0h、1.5h、2.0h、3.0h、4.0h、6.0h、8.0h、12.0h、16.0h、24.0h、36.0h、48.0h采集靜脈血約4ml，血樣采集后置于事先已經(jīng)貼好標簽的試管內(nèi)，分離出血漿后轉(zhuǎn)移至聚乙烯塑料管中置于-70℃冰箱保存待測。通過建立的人血漿中沙格列汀及其代謝產(chǎn)物5-羥基沙格列汀含量lc-ms/ms測定方法測定受試者血漿樣品，根據(jù)測定結(jié)果繪制受試者藥物濃度-時間曲線。圖9是空腹給藥的24名健康受試者單次口服5mg受試制劑和參比制劑平均藥物濃度-時間曲線，圖10是餐后給藥的24名健康受試者單次口服5mg受試制劑和參比制劑平均藥物濃度-時間曲線，圖9和圖10中1代表受試制劑，2代表參比制劑。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。