本發(fā)明屬于毛蕊異黃酮葡萄糖苷的提取領(lǐng)域，尤其是一種ase法萃取黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的方法。
背景技術(shù)：
：《中國(guó)藥典》2015年版一部制備供試品方法：供試品溶液的制備取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約1g，精密稱(chēng)定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50ml，稱(chēng)定重量，加熱回流4小時(shí)，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25ml，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。該方法回流時(shí)間較長(zhǎng)，且對(duì)技術(shù)人員的專(zhuān)業(yè)水平較高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)上述不足，本發(fā)明旨在提供一種ase法萃取黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的方法，該方法提取時(shí)耗時(shí)少，且重復(fù)性好。為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)效果，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是這樣的：一種ase法萃取黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的方法，依次包括下述步驟：步驟1：將黃芪樣品粉碎，過(guò)四號(hào)篩，取1g與1g硅藻土混合；步驟2：將步驟1所得的混合物裝于放有濾膜的ase萃取池中，加硅藻土至與池口平行；步驟3：用甲醇萃取，結(jié)束后，將其蒸干后，再用甲醇定容至10ml，過(guò)濾。優(yōu)選地，步驟3所述的萃取參數(shù)為：壓力為1500psi，溫度為110℃，時(shí)間為5min，次數(shù)為3次，沖洗體積為60％，吹掃時(shí)間為60％。優(yōu)選地，所述的ase萃取池的體積為10ml。優(yōu)選地，步驟3所述的過(guò)濾步驟所使用的濾膜為0.22μm。本發(fā)明與傳統(tǒng)方法相比，具有下述優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明曾對(duì)快速溶劑萃取使用的溶劑進(jìn)行考察，有論文提到使用50％乙醇提取毛蕊異黃酮葡萄糖苷相對(duì)含量較高，雜質(zhì)較少，故對(duì)使用甲醇和50％乙醇進(jìn)行了溶劑考察，結(jié)果顯示甲醇與50％乙醇提取毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量一致，且雜質(zhì)峰基本相同，故采用與藥典一致的提取溶劑。本發(fā)明采用3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)方案l9(33)安排實(shí)驗(yàn)，考察了3個(gè)因素對(duì)加速溶劑萃取黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷過(guò)程的影響。并最終確定最佳的葡萄糖苷的快速溶劑萃取工藝。附圖說(shuō)明圖1為以毛蕊異黃酮葡萄糖苷的濃度(ng)-峰面積進(jìn)行的線(xiàn)性回歸圖；圖2為毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品的色譜圖；圖3為采用ase法萃取所得的樣品供試品溶液的色譜圖；圖4為采用藥典方法提取所得的樣品供試品溶液的色譜圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的權(quán)利要求書(shū)做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制，任何在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍內(nèi)所做的有限次修改，仍在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例11、儀器設(shè)備及試劑1.1儀器：電子分析天平(xa205du)、ase350快速溶劑萃取儀(美國(guó)dionex公司)、thermou3000uhplc液相色譜儀1.2試劑：水：符合gb/t6682規(guī)定的一級(jí)水；甲醇(ch4o)：色譜純(液相色譜用)；醋酸(ch3cooh)：分析純。1.3材料黃芪(產(chǎn)地內(nèi)蒙古，批號(hào)1511100；產(chǎn)地甘肅，批號(hào)15081901；產(chǎn)地內(nèi)蒙古，批號(hào)150718)均購(gòu)于梧州或玉林藥材市場(chǎng)，經(jīng)廣西梧州食品藥品檢驗(yàn)所副主任中藥師黃蘅鑒別。對(duì)照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷由中國(guó)生物制品檢定研究院提供，批號(hào)：111920-201505。2、方法2.1對(duì)照品溶液的制備：取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得。2.2供試品溶液的制備《中國(guó)藥典》2015年版一部制備供試品方法：供試品溶液的制備取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約1g，精密稱(chēng)定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50ml，稱(chēng)定重量，加熱回流4小時(shí)，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25ml，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。快速溶劑萃取法(ase)制備供試品方法：樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)四號(hào)篩，約1g，精密稱(chēng)定，與1g硅藻土混合均勻，待用，移入到預(yù)先放好過(guò)濾膜的ase10ml萃取池中再加入適量硅藻土，輕輕振搖使之與池口在同一水平線(xiàn)上，擰緊萃取池上蓋。萃取結(jié)束后，把萃取液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中蒸干后用甲醇溶解并定容至10ml容量瓶，溶液過(guò)0.22微米濾膜后進(jìn)入hplc測(cè)定。2.3ase萃取條件壓力為1500psi，溫度為110℃，時(shí)間為5min，次數(shù)為3次，沖洗體積為60％，吹掃時(shí)間為60％。2.4色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)a)儀器：agilent1290高效液相色譜儀；b)色譜柱：thermosyncronisdim.(mm)aq，1.7μm，50×2.1mm；c)柱溫：40℃；d)流速：0.3ml/min；e)流動(dòng)相：：甲醇-醋酸-水(35:4:65)；f)檢測(cè)波長(zhǎng)：283nm；以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；理論板數(shù)按毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。2.5測(cè)定法照高效液相色譜法(通則0512)測(cè)定分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。2.6標(biāo)準(zhǔn)限值要求本品按干燥品計(jì)算，含毛蕊異黃酮葡萄糖苷(c22h22o10)不得少于0.020％。2.7計(jì)算(外標(biāo)法)式中cr—對(duì)照品溶液濃度，單位為微克每升(mg/l)；ax—供試品的峰面積；ar—對(duì)照品峰面積。注意：使用前萃取池底部應(yīng)拆卸清理干凈，否則容易引起壓力不穩(wěn)；萃取池底部的濾紙應(yīng)在密封圈內(nèi)，否則引起滲漏；萃取池裝樣時(shí)松緊適中，太松容易導(dǎo)致提取液過(guò)多；開(kāi)機(jī)前檢查氣瓶氣壓是否達(dá)到1mpa；使用結(jié)束后清理干凈，萃取池要及時(shí)晾干(容易生銹)。3、結(jié)果3.1線(xiàn)性關(guān)系取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液(0.06358mg/ml),分別精密吸取該溶液0.1μl、0.3μl、0.5μl、1.0μl、1.2μl進(jìn)入lc測(cè)定，并依照上述方法測(cè)定。以濃度(ng)-峰面積進(jìn)行線(xiàn)性回歸，求得回歸方程：y＝11.334x+22.62、r2＝0.9914,毛蕊異黃酮葡萄糖苷在6.358～76.296ng范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。表1毛蕊異黃酮葡萄糖苷的線(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2重復(fù)性試驗(yàn)取相同批號(hào)的樣品(批號(hào)：1511100)1.0g，共5份，精密稱(chēng)定，按ase提取方法提取供試品溶液，進(jìn)樣量為1μl，以上述的色譜條件平行試驗(yàn)，測(cè)得樣品結(jié)果見(jiàn)表1，rsd為1.9％。表2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果批號(hào)重復(fù)性1重復(fù)性2重復(fù)性3重復(fù)性4重復(fù)性5rsd％15111000.02850.02890.02770.02850.02911.9％3.3精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液(0.06358mg/ml)，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，峰面積rsd為2.3％，表明儀器精密度良好。取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于0，2，4，8，12h依法測(cè)定。結(jié)果黃芪甲苷峰面積的rsd為2.7％，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。3.4樣品不同儀器提取結(jié)果及與藥典方法結(jié)果比較(3批)表3表44、討論：4.1ase提取溶劑的選擇：在實(shí)驗(yàn)中曾對(duì)快速溶劑萃取使用的溶劑進(jìn)行考察，有論文提到使用50％乙醇提取毛蕊異黃酮葡萄糖苷相對(duì)含量較高，雜質(zhì)較少，故對(duì)使用甲醇和50％乙醇進(jìn)行了溶劑考察，結(jié)果顯示甲醇與50％乙醇提取毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量一致，且雜質(zhì)峰基本相同，故采用與藥典一致的提取溶劑。4.2ase提取條件的優(yōu)化在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，我們采用3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)方案l9(33)安排實(shí)驗(yàn)，考察了3個(gè)因素對(duì)加速溶劑萃取黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷過(guò)程的影響。本實(shí)驗(yàn)確定萃取溫度、靜態(tài)萃取時(shí)間、循環(huán)次數(shù)為考察因素(見(jiàn)表5)。確定l從黃芪中提取毛蕊異黃酮葡萄糖苷的最佳快速溶劑萃取工藝，結(jié)果見(jiàn)表6。表5因素水平表6正交實(shí)驗(yàn)極差分析結(jié)果由極差分析可以看出，提取溫度對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量影響最大，其次是提取次數(shù)和提取時(shí)間。最終確定最佳提取工藝組合為提取溫度110℃，提取時(shí)間5min，提取次數(shù)3次。以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡在本發(fā)明的精神和原則范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12