本發(fā)明涉及一種同時測定野菊花中多鐘成分的含量的方法，尤其是一種同時測定野菊花中七種成分的含量的方法，屬于化學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

野菊花為菊科植物野菊Chrysanthemum indicum L.的干燥頭狀花序，具清熱解毒、瀉火平肝之功效，常用于疔瘡癰腫，目赤腫痛，頭痛眩暈。主要成分有黃酮類、萜類、揮發(fā)油、野菊花內(nèi)酯、胡蘿卜苷、氨基酸及微量元素等多種物質(zhì)。實驗研究表明野菊花具有一定的抗炎和鎮(zhèn)痛作用，綠原酸、木犀草苷、芹菜素和蒙花苷為野菊花的抗炎藥效組分。目前多采用高效液相色譜外標法對野菊花中上述成分進行含量測定，戴勝等用HPLC測定野菊花藥材中8種黃酮和有機酸的含量，申海進等用RP-HPLC測定野菊花中槲皮素、木犀草素、芹菜素和刺槐素的含量。

《中國藥典》2015年版野菊花控制指標為蒙花苷，單成分含量難以進行整體質(zhì)量評估，但多成分質(zhì)量控制要求對照品的種類比較多，而部分對照品價格昂貴甚至供應(yīng)量非常少，無法滿足檢測需求。一測多評法(quantitative analysis of multi-components by single-marker,

QAMS)依據(jù)中藥材內(nèi)各有效成分間的某些內(nèi)在關(guān)系，選擇價廉、易得的成分為內(nèi)參物，建立該成分與其他成分間的相對校準因子(relative correction factor,RCF),通過RCF計算其他成分的含量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是同時提供一種同時測定野菊花中七種成分的含量的方法，該方法高效準確、重現(xiàn)性良好。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的：

一種同時測定野菊花中七種成分的含量，其特征在于，依次包括下述步驟：

1)對照品溶液的制備

分別精密稱取綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?、蒙花苷、木犀草素、芹菜素對照品適量，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為0.8469mg.mL^-1、0.5670mg.mL^-1、0.3967mg.mL^-1、0.6738mg.mL^-1、0.1962mg.mL^-1、0.6244mg.mL^-1、1.049mg.mL^-1的對照儲備液，再分別精密吸取7個對照品儲備液0.6、0.9、1.3、0.8、2.5、0.8、0.5mL，置同一25mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得混合對照品溶液A，精密吸取對照品溶液A 1mL至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，制得混合對照品溶液B，避光保存；

2)快速溶劑萃取法制備供試品溶液

取本品粉末0.25g，與1g硅藻土混合均勻填充于5mL萃取池，按快速溶劑萃取儀優(yōu)化的條件進行提取，萃取溶劑為甲醇、萃取溫度100℃、靜態(tài)萃取時間7min、沖洗體積60％、循環(huán)萃取2次，萃取結(jié)束后，將萃取液濃縮至5mL后，轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；

3)將對照品溶液和試品溶液分別注入色譜儀檢測，色譜柱為Syncronis C18，流動相為乙腈-0.5％磷酸水溶液進行梯度洗脫；流速0.5mL.min^-1，檢測波長334nm，柱溫35℃，進樣量2μL；

4)取混合對照品溶液，分別進樣0.2、0.5、1、2、3、4、5μL，在上述色譜條件下測定其峰面積，以各成分進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

進一步的，上述的一種同時測定野菊花中七種成分的含量，所述的梯度洗脫程序為0～4min，10％～20％乙腈，90％～80％磷酸水溶液；4～10min，20％～26％乙腈，80％～74％磷酸水溶液；10～18min，26％～30％乙腈，74％～70％磷酸水溶液；18～20min，30％～40％乙腈，70％～60％磷酸水溶液；20～20.5min，40％～80％乙腈，60％～20％磷酸水溶液；20.5～23min，80％乙腈，20％磷酸水溶液；23.1min，10％乙腈，90％磷酸水溶液。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)勢：

本發(fā)明提供的技術(shù)方案方法采用高效液相色譜法，以綠原酸為內(nèi)參物，建立綠原酸與咖啡酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?、蒙花苷、木犀草素、芹菜素的相對校正因子，并考察了相對校正因子的重現(xiàn)性，分別采用外標法和一測多評法進行野菊花中7種成分的含量測定。建立的校正因子重現(xiàn)性良好，野菊花藥材采用一測多評法計算的含量值與外標法實測值之間沒有明顯差異，同時測定7種成分的一測多評法控制野菊花藥材的質(zhì)量是可行的、準確的。

附圖說明

圖1混合對照品的HPLC圖

圖2是野菊花樣品的HPLC圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的權(quán)利要求書做進一步說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，任何對本發(fā)明做有限次修改可得的技術(shù)方案仍然屬于本發(fā)明所要保護的范圍。

實施例1

1儀器與試藥

1.1儀器

ThermoFisher SCITIFIC ULTIMATE 3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技公司)，Agilent 1290高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，ASE350快速溶劑萃取儀(賽默飛世爾科技公司)，XA205DU電子分析天平(梅特勒儀器有限公司)，超純水機(默克密理博公司)。

色譜柱：Syncronis C18(100mm×3mm，3μm，賽默飛世爾科技公司)，Accucore C18(100mm×3mm，2.6μm，賽默飛世爾科技公司)，BDS Hypersil C18(100mm×4.6mm，2.4μm，賽默飛世爾科技公司)，Zorbax Extend C18(100mm×4.6mm，1.8μm，安捷倫科技公司)，Kinetex XB-C18(100mm×4.6mm，2.6μm，廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司)，Ultracore super C18(75mm×2.1mm，2.5μm，ACE公司)。

1.2試藥

對照品綠原酸(批號110753-201415，含量以96.2％計)、咖啡酸(批號110885-200102，含量以100％計)、木犀草苷(批號111720-200604，含量以100％計)、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?批號111782-201405，含量以92.0％計)、蒙花苷(批號111528-200606，含量以100％計)、木犀草素(批號111520-200504，含量以92.0％計)、芹菜素(批號111901-201102，含量以99.6％計)均由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈，色譜純，默克公司；超純水自制；其余試劑均為分析純。

野菊花藥材均為市售品(批號1510020、1511017、150802，產(chǎn)地安徽；批號E5040302、1511008、1511010、1601003，產(chǎn)地湖北；批號151001、150806、151106，產(chǎn)地江西)，經(jīng)廣西梧州食品藥品檢驗所黃蘅副主任中藥師鑒定為菊科植物野菊的頭狀花序。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱為Syncronis C18(100mm×3mm,3μm)，流動相為乙腈-0.5％磷酸水溶液，梯度洗脫程序為0～4min，10％～20％乙腈；4～10min，20％～26％乙腈；10～18min，26％～30％乙腈；18～20min，30％～40％乙腈；20～20.5min，40％～80％乙腈；20.5～23min，80％乙腈；23.1min，10％乙腈；流速0.5mL.min^-1，檢測波長334nm，柱溫35℃，進樣量2μL。在上述色譜條件下，混合對照品和供試品中綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素分離良好，以各成分色譜峰計算的理論塔板數(shù)均不低于3000。見圖1和圖2，1-綠原酸，2-咖啡酸，3-木犀草苷，4-3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸，5-蒙花苷，6-木犀草素，7-芹菜素。

2.2對照品溶液的制備

分別精密稱取綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?、蒙花苷、木犀草素、芹菜素對照品適量，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為0.8469mg.mL^-1、0.5670mg.mL^-1、0.3967mg.mL^-1、0.6738mg.mL^-1、0.1962mg.mL^-1、0.6244mg.mL^-1、1.049mg.mL^-1的對照儲備液，再分別精密吸取7個對照品儲備液0.6、0.9、1.3、0.8、2.5、0.8、0.5mL，置同一25mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得混合對照品溶液A，精密吸取對照品溶液A1mL至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，制得混合對照品溶液B(各濃度約為4μg.mL^-1)，避光保存。

2.3快速溶劑萃取法制備供試品溶液

取本品粉末(過三號篩)約0.25g，精密稱定，與約1g硅藻土混合均勻填充于5mL萃取池，按快速溶劑萃取儀優(yōu)化的條件進行提取，萃取溶劑為甲醇、萃取溫度100℃、靜態(tài)萃取時間7min、沖洗體積60％、循環(huán)萃取2次，萃取結(jié)束后，將萃取液濃縮至約5mL后，轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4線性關(guān)系考察

取混合對照品溶液B，分別進樣0.2、0.5、1、2、3、4、5μL，在上述色譜條件下測定其峰面積，以各成分進樣量(ng)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果表明七種成分在0.8ng～20ng范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，見表1。

表1野菊花中七種成分回歸方程和線性范圍

2.5精密度試驗

取上述混合對照品溶液B，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，結(jié)果綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素峰面積的RSD依次為0.15％、0.41％、0.30％、0.23％、0.37％、0.22％、0.18％，表明進樣精密度良好。

2.6重復(fù)性試驗

取野菊花樣品(批號151001)6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進行測定，計算綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?、蒙花苷、木犀草素、芹菜素含量分別為1.509mg.g^-1、0.701mg.g^-1、1.986mg.g^-1、2.491mg.g^-1、0.394mg.g^-1、0.854mg.g^-1、1.289mg.g^-1，RSD依次為0.72％、1.0％、0.87％、0.51％、1.3％、0.66％、1.0％，表明方法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗

取同一供試品(批號151001)，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別在0、4、8、12、16、20、24h測定，記錄峰面積，結(jié)果綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩帷⒚苫ㄜ?、木犀草素、芹菜素峰面積的RSD依次為0.38％、0.92％、0.43％、0.57％、0.27％、0.46％、0.96％，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8加標回收率試驗

取已測定含量的野菊花樣品(批號151001)9份，編號1～9號，每份0.25g，精密稱定，精密移取上述7種對照儲備液各0.2mL、0.4mL、0.6mL三個水平，揮干溶劑后分別定量轉(zhuǎn)移至1～3號、4～6號、7～9號樣品池中，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件進行測定，分別計算綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸、蒙花苷、木犀草素、芹菜素的平均回收率，結(jié)果詳見表2，各成分平均回收率為98.46％～103.67％，RSD為1.43％～2.67％，表明該方法的準確度良好。

表2七種成分加樣回收率試驗結(jié)果

2.9一測多評(QAMS)法

2.9.1相對校正因子的確定

取“線性關(guān)系考察”項下結(jié)果，以綠原酸為內(nèi)參物(S)，按公式f_si＝f_s/f_i＝(As×Ci)/(Ai×Cs)(As、Cs分別為內(nèi)參物對照品的峰面積和濃度，Ai、Ci分別為待測成分對照品的峰面積和濃度)計算咖啡酸(A)、木犀草苷(B)、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?C)、蒙花苷(D)、木犀草素(E)、芹菜素(F)的相對校正因子f_S/A、f_S/B、f_S/C、f_S/D、f_S/E、f_S/F，結(jié)果見表3。

表3以綠原酸為內(nèi)參物的f_S/i測定結(jié)果

2.9.2相對校正因子重現(xiàn)性考察

2.9.2.1不同儀器對f的影響

試驗考察了兩種高效液相色譜系統(tǒng)：THERMO SCITIFIC ULTIMATE 3000高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技公司)和Agilent 1290高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)對各成分f的影響，結(jié)果RSD依次為1.32％、1.61％、1.27％、1.51％、2.32％、1.33％，表明不同儀器對各成分的f無顯著影響。

2.9.2.2不同色譜柱對f的影響

試驗考察了6種色譜柱Syncronis C18、Accucore C18、BDS Hypersil C18、Zorbax Extend C18、Kinetex XB-C18、Ultracore super C18對各成分f的影響，結(jié)果RSD依次為2.57％、2.16％、1.92％、0.74％、2.31％、1.24％，表明此6根色譜柱對各成分的f無顯著影響。

2.9.2.3不同柱溫對f的影響

試驗考察了不同柱溫(25、30、35、40℃)對各成分f的影響，結(jié)果RSD依次為1.80％、3.67％、3.39％、2.01％、1.57％、1.90％，表明柱溫對各成分的f無顯著影響。

2.9.2.4不同實驗人員操作對f的影響

考察了3名實驗人員對各f的影響，結(jié)果RSD依次為1.79％、3.46％、3.48％、2.03％、1.59％、1.92％，表明不同操作人員所得各成分的f無顯著差別。

2.9.2.5f重現(xiàn)性影響因素綜合

綜合以上各種因素，咖啡酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?、蒙花苷、木犀草素、芹菜素f的RSD依次為2.04％、3.70％、2.21％、1.36％、2.22％、1.37％。結(jié)果見表4。

表4各考察因素對f_S/i的影響

2.9.3色譜峰定位參數(shù)考察

利用相對保留時間(r_i/s)進行峰定位，r_i/s＝t_R(i)/t_R(s)(i為待測成分，s為內(nèi)參物)，測得咖啡酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?、蒙花苷、木犀草素、芹菜素和綠原酸的r_i/s結(jié)果，見表5。不同色譜條件所得到相對保留值變動較小，RSD≤5％，表明采用r_i/s進行峰的定位較為可行。

表5不同儀器和色譜柱測得的r_i/s

2.9.4 QAMS法與外標法測定結(jié)果的比較

取10批野菊花樣品，每批3份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件，分別精密吸取混合對照品溶液B和供試品溶液各2μL進行測定，記錄峰面積，分別用外標法與一測多評法計算其含量并對結(jié)果進行比較，測定結(jié)果見表6，2種方法所得值的偏差均在3％以內(nèi)，由此說明一測多評法用于野菊花藥材的多成分質(zhì)量評價研究是可行的。

表6 QAMS法與外標法測定結(jié)果(mg.g^-1)

3討論

供試品溶液制備方法的選擇快速溶劑萃取是在高溫和高壓下用溶劑對固體或半固體樣品進行萃取的新穎前處理方法，本試驗采用快速溶劑萃取法制備供試品溶液，并利用正交實驗優(yōu)化了影響快速溶劑萃取的主要因素，最終確定萃取條件為：萃取溶劑甲醇、萃取溫度100℃、靜態(tài)萃取時間7min、沖洗體積60％、循環(huán)萃取2次。

QAMS法對待測色譜峰定位重現(xiàn)性本試驗通過考察不同品牌儀器和色譜柱中各待測成分與綠原酸內(nèi)參物相對保留時間的重現(xiàn)性，發(fā)現(xiàn)可通過綠原酸與野菊花中另外6種成分的相對保留時間實現(xiàn)色譜峰定位。

相對校正因子重現(xiàn)性本試驗選用價廉易購的綠原酸為內(nèi)參物，建立該成分與其余6種野菊花成分間的相對校正因子。通過對10批不同產(chǎn)地的野菊花中藥材的測定，驗證了該分析方法的線性、精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性以及QAMS法的準確性，并對不同品牌儀器、色譜柱、柱溫、實驗人員等影響因素考察QAMS法的重現(xiàn)性，結(jié)果表明采用QAMS法計算的結(jié)果與外標法測定結(jié)果無顯著性差異，可以在缺少咖啡酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡?；鼘幩帷⒚苫ㄜ?、木犀草素、芹菜素對照品的情況下，通過相對校正因子計算其量。實驗建立的QAMS法為野菊花藥材的質(zhì)量控制提供了新的方法。

以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡在本發(fā)明的精神和原則范圍內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。