本發(fā)明屬于食品分析研究領域，具體涉及一種檢測飲料中苯甲酸的方法，尤其是一種薄膜微萃取結合表面增強拉曼光譜技術檢測飲料中苯甲酸的方法。

背景技術：

苯甲酸是一種酸性防腐劑，未離解酸具有抗菌活性。苯甲酸可作為食品和藥品防腐劑，能夠有效防止食品和藥品變質，延長保質期。由于苯甲酸在ph2.5～4.0的液體環(huán)境中抗菌活性最強，因此被廣泛用作飲料的防腐劑。有研究表明，攝入過量的苯甲酸可能會引起腹瀉、腹痛和心跳加快等癥狀。過量的苯甲酸還會干擾人體的中間代謝過程，包括尿素循環(huán)，糖異生，脂肪酸代謝和三羧酸循環(huán)等。目前用于檢測苯甲酸含量的主要方法有高效液相色譜法(hplc)、氣相色譜法(gc)、分光光度法等，這些方法存在不同的缺點，或者樣品前處理過程較為復雜，或者檢測需要貴重的儀器設備，或者檢測花費較長的時間。因此，有必要發(fā)展一類快速高效、低成本、高靈敏度地檢測飲料中苯甲酸的新方法。

薄膜微萃取技術(tfme)是一種新型的固相微萃取(spme)技術，當具有相同體積的萃取相時，薄膜微萃取技術與傳統(tǒng)的纖維式固相微萃取技術相比，擁有更大的表面積和更薄的萃取層厚度，從而縮短了分析時間。近年來，薄膜微萃取被廣泛應用于生物化學分析、環(huán)境污染分析、食品安全分析等各種領域中。此外，表面增強拉曼光譜(sers)是指當被分析物分子吸附在膠質金屬顆粒如銀、金或銅表面的樣品，或吸附在這些金屬片的粗糙表面上，其拉曼光譜強度可提高10³～10⁶倍的一類光譜技術。相較于傳統(tǒng)分析檢測技術，表面增強拉曼光譜可以實現(xiàn)非侵入性檢測，適用于水溶液等多種體系，并且?guī)缀鯚o需試樣制備，測量過程方便快捷，這些優(yōu)點使得sers技術成為近年來的研究熱點。但目前還未有一種薄膜微萃取結合表面增強拉曼光譜技術檢測苯甲酸的方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足之處，提供了一種檢測飲料中苯甲酸的方法，將薄膜微萃取技術與表面增強拉曼光譜技術聯(lián)用，既可以實現(xiàn)對苯甲酸的選擇性分析，又可對苯甲酸進行快速檢測，從而提高分析靈敏度并且縮短檢測時間。

本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種檢測飲料中苯甲酸的方法，包括：

1)制備硅膠萃取基板：

1-1)對玻璃片基底進行羥基化處理：將0.8～1.2cm×0.8～1.2cm的玻璃片依次在超純水、乙醇、丙酮中各超聲清洗8～12min，氮氣吹干；另將濃硫酸和雙氧水按照體積比6～8:2～4混合，冷卻；將氮氣吹干的玻璃片加入至該濃硫酸和雙氧水混合液中，85～95℃水浴加熱0.5～1.5h后，取出玻璃片，超純水沖洗，氮氣吹干；

1-2)往55～65℃的超純水中加入羧甲基纖維素鈉，攪拌溶解，得到濃度為0.3～0.5％的羧甲基纖維素鈉溶液；

1-3)將步驟1-2)得到的羧甲基纖維素鈉溶液與薄層色譜硅膠按照2～4ml:0.5～1.5g的配方比例混合，攪勻，得到糊狀物；

1-4)將步驟1-3)得到的糊狀物迅速涂在步驟1-1)得到的玻璃片上，不斷振動玻璃片使其上的糊狀物分布均勻；

1-5)將步驟1-4)得到的涂覆了糊狀物的玻璃片放置在水平面上自然晾干，然后在100～110℃干燥20～40min，即得所述硅膠萃取基板，該硅膠萃取基板呈宏觀平面形態(tài)，玻璃片基底上涂覆的硅膠層厚度為100～150μm，硅膠層中的硅膠材料呈多孔洞粗糙無定型狀態(tài)；

硅膠材料是一類具有開放多孔結構、吸附性強、對多種有機物質均具有吸附性能的萃取材料，并且硅膠化學惰性很強，耐溶劑，不容易發(fā)生化學變化。將其作為薄膜微萃取材料，不僅成本低廉，更可以達到苯甲酸的良好富集效果。

此外，宏觀平面形態(tài)的硅膠萃取基板可以提供更大的比表面積，并且成本低廉，制備快速；經(jīng)羥基化處理的玻璃基底親水性增加，使硅膠更容易鋪開，有利于硅膠材料的均勻分布，具有更好的檢測效果；宏觀平面形態(tài)的硅膠萃取基板有利于噴灑或滴加適用于表面增強拉曼光譜分析的增強基底，并且便于拉曼激光的照射，從而可用于表面增強拉曼光譜分析。

2)薄膜微萃取富集待測樣品中目標物苯甲酸：待測樣品無需任何預處理，將待測樣品移入薄膜微萃取裝置中，將步驟1)制得的硅膠萃取基板浸入待測樣品中，在室溫、800～1500rpm攪拌速率下進行薄膜微萃取，萃取15～25min后，取出硅膠萃取基板，揮干水分；

3)表面增強拉曼光譜技術檢測待測樣品中目標物苯甲酸：將4～12μl濃縮的aunps滴加于步驟2)得到的硅膠萃取基板表面，之后用拉曼儀器進行檢測。

一實施例中：所述步驟2)中，薄膜微萃取裝置包括萃取支架和瓶身；該萃取支架包括瓶蓋、密封墊和支撐架；該瓶蓋與所述瓶身適配裝接，所述密封墊設于該瓶蓋內，所述支撐架位于瓶身內，支撐架上部與密封墊固接，支撐架下部設有用于安放所述硅膠萃取基板的u型平臺。

一實施例中：所述瓶身的容積為10～50ml；

一實施例中：所述支撐架長度為5～7cm；

一實施例中：所述支撐架的寬度為0.5～1.0cm。

一實施例中：所述支撐架為鋁片制成。

一實施例中：所述步驟3)中，濃縮的aunps的制備方法為：將4.5ml商品化的金納米溶液原液(廈門普識納米科技有限公司，型號為cp-1，金納米顆粒濃度約為0.3mmol/l，平均粒徑為55nm。)于3000～5000rpm條件下離心10～20min后棄去上清液以濃縮至0.1ml。

本技術方案與背景技術相比，它具有如下優(yōu)點：

本發(fā)明將薄膜微萃取技術與表面增強拉曼光譜技術結合，利用薄膜微萃取技術分離富集樣品中的苯甲酸，再采用表面增強拉曼光譜技術進行檢測；苯甲酸分子的苯環(huán)結構具有很強的拉曼信號，可在一定程度上排除其他分子的干擾。該方法成本低廉，操作簡單，靈敏度高，檢測快速高效，適用于飲料等各種樣品中苯甲酸的測定。

附圖說明

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。

圖1(a)為本發(fā)明實施例中制備的硅膠萃取基板上硅膠層中硅膠材料的sem圖；(b)為硅膠萃取基板的截面sem圖。

圖2為本發(fā)明實驗例2中同一硅膠萃取基板上不同取樣點sers光譜重現(xiàn)性結果示意圖，圖中橫坐標為拉曼位移(cm^-1)，縱坐標為強度(a.u.)。

圖3為本發(fā)明實驗例2中不同硅膠萃取基板萃取同濃度苯甲酸的重現(xiàn)性結果示意圖，圖中縱坐標為峰強(a.u.)。

圖4為本發(fā)明實驗例3中用本發(fā)明的tfme-sers法測定不同濃度苯甲酸溶液的拉曼光譜圖及其線性范圍，圖4(a)坐標分別為拉曼位移(cm^-1)、濃度(μg/ml)、強度(a.u.)；圖4(b)中橫坐標為濃度(μg/ml)，縱坐標為峰強(a.u.)。

圖5為本發(fā)明實驗例4中用本發(fā)明的tfme-sers法測定不同飲料樣品中苯甲酸濃度的拉曼光譜圖：(a)樣品1，(b)樣品2，(c)樣品3，(d)樣品4，(e)樣品5以及(f)苯甲酸標準溶液(500μgml^-1)，圖中橫坐標為拉曼位移(cm^-1)，縱坐標為強度(a.u.)。

圖6為本發(fā)明的薄膜微萃取裝置的結構及組裝過程示意圖，其中a為萃取支架，b為瓶身，1為支撐架上部，2為密封墊，3為支撐架，4為支撐架下部，5為瓶蓋。

具體實施方式

下面通過實施例具體說明本發(fā)明的內容：

實施例

一種檢測飲料中苯甲酸的方法(tfme-sers法)，包括：

1)制備硅膠萃取基板：

1-1)對玻璃片基底進行羥基化處理：將1.0cm×1.0cm尺寸大小的的玻璃片依次在超純水、乙醇、丙酮中各超聲清洗10min，氮氣吹干；另向燒杯中加入35ml濃硫酸，邊攪拌邊向其中加入15ml的雙氧水，混合液冷卻后，將清洗過后氮氣吹干的玻璃片加入至該濃硫酸和雙氧水混合液中，90℃水浴加熱1h后，取出玻璃片，超純水沖洗，氮氣吹干；

1-2)往60℃的30ml超純水中加入0.12g羧甲基纖維素鈉，攪拌溶解，得到濃度為0.4％的羧甲基纖維素鈉溶液；

1-3)將步驟1-2)得到的羧甲基纖維素鈉溶液30ml倒入研缽中，然后加入10g薄層色譜硅膠(g型或者gf254型，本實施例中選用的薄層色譜硅膠購自阿拉丁試劑有限公司，g型，sku號t116946)，攪勻，得到糊狀物；

1-4)用玻璃棒將步驟1-3)得到的糊狀物迅速涂在步驟1-1)得到的玻璃片上，不斷振動玻璃片使其上的糊狀物分布均勻；

1-5)將步驟1-4)得到的涂覆了糊狀物的玻璃片放置在水平面上自然晾干，然后在105℃烘箱中干燥30min，取出，即得所述硅膠萃取基板，放入干燥器中，備用；該硅膠萃取基板呈宏觀平面形態(tài)，玻璃片基底上涂覆的硅膠層厚度為130μm，硅膠層中的硅膠材料呈多孔洞粗糙無定型狀態(tài)；

2)薄膜微萃取(tfme)富集待測樣品中目標物苯甲酸：將待測樣品移入薄膜微萃取裝置中，所述薄膜微萃取裝置如圖6所示，包括萃取支架a和瓶身b；該萃取支架a包括瓶蓋5、密封墊2和支撐架3；該瓶蓋5與所述瓶身b適配裝接，所述密封墊2設于該瓶蓋5內，所述支撐架3位于瓶身b內，支撐架上部1與密封墊2固接，支撐架下部4設有用于安放所述硅膠萃取基板的u型平臺。

所述薄膜微萃取裝置的瓶蓋5與瓶身b可以采用現(xiàn)有的血清瓶瓶蓋與瓶身改制而成，支撐架3采用長度5.5～6.5cm、寬度0.6～0.8cm的鋁片制成。薄膜微萃取裝置的組裝過程如圖6所示：根據(jù)需要，選用容積10～30ml的血清瓶，將瓶蓋5內的密封墊2取出并在中部開一小口，將鋁片上端穿過小口并超出約0.5cm，將超出部分翻折固定于密封墊2上表面，鋁片下端取1cm垂直于鋁片平面折疊，其末端再取0.2～0.3cm沿垂直方向折起，使下部呈現(xiàn)u型形成所述u型平臺，用于放置硅膠萃取基板，防止掉落；然后將密封墊2放回瓶蓋5內，如此即形成萃取支架a。

將待測樣品10ml加入至薄膜微萃取裝置的瓶身b內，硅膠萃取基板放在萃取支架a的u型平臺上，再將萃取支架a通過瓶蓋5與瓶身b螺紋配合裝接，支撐架3下部及硅膠萃取基板浸入待測樣品液面下，并使硅膠萃取基板位于待測樣品液體中部；隨后在室溫、磁子攪拌速率1000rpm的條件下進行薄膜微萃取，萃取20min后，取出萃取支架a，取下硅膠萃取基板并揮干水分，留待下一步檢測；

3)表面增強拉曼光譜技術(sers)檢測待測樣品中目標物苯甲酸：將5～10μl濃縮的aunps滴加于步驟2)得到的硅膠萃取基板表面，之后用拉曼儀器進行檢測。該濃縮的aunps的制備方法為：將4.5ml商品化的金納米溶液原液于4000r/min條件下離心15min后，棄去上清液，以濃縮至0.1ml。

上述實施例可實現(xiàn)下述實驗例之效果：

實驗例1

本實驗例對實施例中得到的硅膠萃取基板進行了表征。圖1a為硅膠萃取基板上硅膠層中硅膠薄膜萃取材料的掃描電鏡圖，圖中表明該硅膠材料表面微觀呈粗糙無定型狀態(tài)，具有較多孔洞，這使得該涂層具有較多的吸附位點與較大的吸附面積。如圖1b所示，從硅膠萃取基板的截面sem圖可知，該硅膠萃取涂層的厚度約為130μm，較薄的涂層厚度有利于傳質過程的快速進行，并且較大的萃取面積保證了較大的吸附容量，有助于分析方法靈敏度的提高。

實驗例2

本實驗例檢驗了實施例中檢測方法的重現(xiàn)性，對同一硅膠萃取基板的不同取樣點sers信號的重現(xiàn)性及不同硅膠萃取基板對同一分析物信號的重現(xiàn)性進行了考察。首先，實驗采用500μg/ml的苯甲酸的標準溶液作為萃取液，選取單片硅膠萃取基板進行tfme過程，隨后在萃取片噴灑金膠納米粒子的范圍內隨機選取10個區(qū)域點采集其sers信號，所得結果如圖2所示?？梢钥闯龉枘z萃取基板不同區(qū)域內所得分析物苯甲酸的sers信號十分明顯，且具有較高的一致性。

其次，實驗隨機選取5片不同硅膠萃取基板，并將其應用于同一濃度苯甲酸標準溶液tfme-sers檢測的重現(xiàn)性考察中，每個硅膠萃取基板的信號采集5次，所得苯甲酸特征峰的強度差異如圖3所示。不同硅膠萃取基板萃取苯甲酸檢測的sers信號rsd為10.2％，顯示出較高的重現(xiàn)度。

實驗例3

本實驗例考察了實施例中檢測方法的線性范圍以及檢測限，實驗用該方法分別對25μg/ml～500μg/ml的苯甲酸標準溶液進行了測定。測定時，分別將10ml25μg/ml～500μg/ml的苯甲酸標準溶液移入10ml血清瓶中，將硅膠萃取基板置于薄膜微萃取裝置中浸入樣品中。萃取過程中溶液處于攪拌狀態(tài)，磁子攪拌速率為1000rpm，萃取時間為20min，萃取溫度為室溫，萃取過程完成后，將硅膠萃取基板從薄膜微萃取裝置中取下。待硅膠萃取基板表面水分揮發(fā)后，將10μl金膠溶液濃縮后的aunps滴加在硅膠萃取基板表面，之后用表面增強拉曼光譜進行檢測。所有測定樣品均一式三份，表面增強拉曼光譜數(shù)據(jù)均采集3次，所得數(shù)據(jù)為測定結果的平均值。

所得sers譜圖及線性關系如圖4a及4b所示，從圖4a可看出隨著苯甲酸濃度的降低，苯甲酸的sers譜圖強度也相應降低，至較低濃度25μg/ml時，其特征譜圖仍然清晰可見，說明該方法的靈敏度較高。圖4b以苯甲酸最強的特征峰994cm^-1的相對峰強為縱坐標，苯甲酸濃度為橫坐標來繪制標準曲線，其線性相關系數(shù)達到0.995，顯示出較好的線性。經(jīng)計算，該方法檢測限為3.6μg/ml(s/n＝3)，完全符合飲料中苯甲酸的檢測要求。

實驗例4

本實驗例考察了實施例中檢測方法的可靠性，實驗采用gb/t5009.29-2003中高效液相色譜法作為對照方法，對8種不同市售飲料中苯甲酸的含量進行了測定，其結果如表1和圖5所示。從結果可看出，兩種方法的測定結果基本一致，說明建立的新方法具有較高的可靠性。并且tfme-sers法可實現(xiàn)多個樣品的同時萃取分析，從而大大縮短分析時間。由圖5可知，實際樣品與苯甲酸標準溶液經(jīng)過tfme-sers得到的拉曼光譜圖譜峰較為一致，并且實際樣品的譜圖中并未出現(xiàn)強度較大的雜峰，說明該方法可大大降低檢測的背景干擾，在一定程度上實現(xiàn)選擇性檢測。

表1tfme-sers與國標方法測定飲料中苯甲酸結果對比

以上所述，僅為本發(fā)明較佳實施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內容所作的等效變化與修飾，皆應仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內。