本發(fā)明屬于檢測(cè)試劑技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于tnf-α檢測(cè)的半定量核酸適配體試紙條及其制備方法。

背景技術(shù)：

阿爾茲海默癥(alzheimer’sdisease，ad)是一種危害性高、醫(yī)療護(hù)理成本巨大、尚無根治方法的神經(jīng)退行性疾病，隨著我國(guó)社會(huì)老齡化過程，患者人數(shù)逐年增加。而ad早期診斷一直是國(guó)際性的難題。

目前，已有的臨床檢測(cè)ad手段主要為：依靠認(rèn)知能力測(cè)試結(jié)合核磁共振掃描判斷ad病理發(fā)展，鑒定結(jié)果可靠度高，但對(duì)ad的早期診治敏感性不佳(患者沒有明顯癥狀或具有輕微的認(rèn)知功能的減退)，此外，檢測(cè)樣本為腦脊液，取樣時(shí)常采用脊椎穿刺等手段，時(shí)常伴有副作用，而且不能以一定的時(shí)間間隔進(jìn)行多次取樣，給疾病的追蹤性檢測(cè)與治療效果的監(jiān)測(cè)帶來困難；在臨床ad標(biāo)志物，特別是ad早期標(biāo)志物方面，尚無公認(rèn)的簡(jiǎn)便、可靠的臨床檢測(cè)指標(biāo)或標(biāo)準(zhǔn)，亟待攻關(guān)解決。

體液標(biāo)志物作為一種敏感性佳、特異性高、易于使用的指示劑，可真實(shí)反應(yīng)ad的病理進(jìn)程。腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactor-α，tnf-α)是一種主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)。腦內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)是ad的重要病理特征之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的問題在于提供一種用于tnf-α檢測(cè)的半定量核酸適配體試紙條及其制備方法，該試紙條利用核酸適配體和納米金交聯(lián)復(fù)合物進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)簡(jiǎn)便、靈敏、快速，可用于老年癡呆的早期篩查。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種用于tnf-α檢測(cè)的半定量核酸適配體試紙條，包括兩端分別設(shè)有樣品墊和吸水墊的底板，底板的中部設(shè)置有硝酸纖維素膜檢測(cè)層；硝酸纖維素膜檢測(cè)層上靠近吸水墊的一端設(shè)有檢測(cè)線，檢測(cè)線包被有特異性結(jié)合生物素的鏈霉親和素；在硝酸纖維素膜檢測(cè)層和樣品墊之間設(shè)置有結(jié)合墊，結(jié)合墊上摻有適配體納米金復(fù)合物；樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊依次搭接；

所述的適配體納米金復(fù)合物是不能通過硝酸纖維素膜檢測(cè)層的核酸-適配體-納米金網(wǎng)格狀復(fù)合物，其中核酸連接在納米金顆粒上并雜交形成雙鏈，適配體能夠與tnf-α特異性識(shí)別，在識(shí)別后打開雙鏈，使核酸-適配體-納米金網(wǎng)格狀復(fù)合物分解；納米金顆粒上還連接有末端設(shè)有生物素的單鏈核酸，其在適配體納米金復(fù)合物分解后能通過硝酸纖維素膜檢測(cè)層，并泳動(dòng)到檢測(cè)線處。

所述的適配體納米金復(fù)合物，是aunps-dna1顆粒和aunps-dna2，3顆粒通過dna1、dna2與linker通過dna雜交后形成的核酸-適配體-納米金網(wǎng)格狀復(fù)合物；

所述的aunps-dna1顆粒是巰基化的dna1連接于納米金顆粒上，aunps-dna2，3顆粒是巰基化的dna2、dna3分別連接于納米金顆粒上；

所述的linker含有與tnf-α特異性結(jié)合的適配體序列，且linker的兩端分別與dna1、dna2相互補(bǔ)；dna1、dna2和linker可雜交形成雙鏈；dna3的末端設(shè)有生物素，其序列不能與dna1、dna2相雜交。

所述的dna1的核苷酸序列為：tcacttcgctgaaaaaaa-(ch3)3-sh；

所述的dna2的核苷酸序列為：sh-(ch3)6-ctgtattgtcgc；

所述的linker的核苷酸序列為：tcctccatccgcgagtgggcgacaatactgtcagcgttcact；其中適配體序列為tggtcctaggcgcagagcgcatgta。

當(dāng)樣品墊存在tnf-α?xí)r，tnf-α特異性結(jié)合適配體納米金復(fù)合物，使連接構(gòu)成適配體納米金復(fù)合物的linker從其上分離，分離后的帶有生物素的顆粒通過硝酸纖維素膜，與檢測(cè)線上的鏈霉親和素結(jié)合，從而顯示出紅色，tnf-α濃度越大，則紅色越明顯。

所述的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊在相搭接時(shí)相互重疊1～3mm。

所述的用于tnf-α檢測(cè)的半定量核酸適配體試紙條的制備方法，包括以下操作：

1)利用檸檬酸鈉還原法制備出粒徑13～20nm的納米金顆粒；

2)巰基化的dna1與納米金經(jīng)鹽老化方法連接形成aunps-dna1顆粒；

巰基化的dna2、dna3與納米金經(jīng)鹽老化方法連接形成aunps-dna2，3顆粒；

3)將aunps-dna1顆粒、aunps-dna2，3顆粒和linker在緩沖溶液中雜交形成藍(lán)色的適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物；將得到的適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物離心，去除上清，沉淀重懸；

所述的linker含有與tnf-α特異性結(jié)合的適配體序列，且linker的兩端分別與dna1、dna2相互補(bǔ)；dna1、dna2和linker可雜交形成雙鏈；dna3的末端設(shè)有生物素，其序列不能與dna1、dna2相雜交；

4)將樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼組裝到底板上，相鄰粘貼物之間的重疊部分為1～3毫米；

5)將核酸-適配體-納米金網(wǎng)格狀復(fù)合物重懸液加于結(jié)合墊上，烘干；

6)在硝酸纖維素膜的檢測(cè)線位置加鏈霉親和素溶液，烘干后完成tnf-α檢測(cè)的半定量核酸適配體試紙條的制備。

所述納米金的制備為：將氯金酸邊攪拌邊加熱至沸騰，然后加入檸檬酸三鈉水溶液，溶液由藍(lán)轉(zhuǎn)為紅色后持續(xù)加熱2～8min，冷卻后得到納米金溶液，其中納米金粒徑為10～20nm。

所述dna1、dna2在與納米金結(jié)合前，先將其溶于滅菌超純水中；dna1、dna2的濃度為0.1～1mm；所述的linker的濃度為10～100μm；雜交條件為室溫反應(yīng)1小時(shí)，4℃過夜；

所述的dna1的核苷酸序列為：tcacttcgctgaaaaaaa-(ch3)3-sh；

所述的dna2的核苷酸序列為：sh-(ch3)6-ctgtattgtcgc；

所述的linker的核苷酸序列為：tcctccatccgcgagtgggcgacaatactgtcagcgttcact。

在緩沖液中孵育時(shí)，aunps-dna1顆粒、aunps-dna2，3顆粒和linker的摩爾比為1～10∶1～0∶1～10；

所述的重懸液含有質(zhì)量濃度3～5％的蔗糖、100～300mmnacl和10～30mmtris-acetate；重懸液的ph為7～8。

所述的樣品墊在檢測(cè)時(shí)加入溶解狀態(tài)的tnf-α；

適配體納米金復(fù)合物的重懸液加入量為5～10μl，37℃過夜烘干；

所述檢測(cè)線位置的鏈霉親和素濃度為0.1～10mg/ml；

所述試紙條的寬度為2～5mm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

體液標(biāo)志物作為一種敏感性佳、特異性高、易于使用的指示劑，可真實(shí)反應(yīng)ad的病理進(jìn)程。腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactor-α，tnf-α)是一種主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)。腦內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)是ad的重要病理特征之一。試紙條檢測(cè)是一種相對(duì)簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)方法，現(xiàn)在尚沒有適用于ad檢測(cè)的試紙條檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。

本發(fā)明提供的用于tnf-α檢測(cè)的半定量核酸適配體試紙條及其制備方法，基于靶標(biāo)特異性，優(yōu)選出核酸適配體，核酸適配體無需標(biāo)記，只需要通過檢測(cè)線的顏色變化即可進(jìn)行tnf-α的檢測(cè)。

本發(fā)明提供的用于tnf-α檢測(cè)的半定量核酸適配體試紙條及其制備方法，dna1，dna2和linker是互補(bǔ)的單鏈核酸，在一定條件下，這三條單鏈可以雜交形成雙鏈；而dna3一端帶有生物素，可與鏈霉親和素特異性結(jié)合；linker中的一段序列為tnf-α的適配體，可與tnf-α特異性結(jié)合。巰基連接的aunps-dna1和aunps-dna2，3通過linker可以雜交形成一個(gè)大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使納米金發(fā)生沉聚，溶液會(huì)由紅色變?yōu)樗{(lán)紫色，藍(lán)紫色的適配體納米金復(fù)合物不能通過硝酸纖維素膜，停留在結(jié)合墊上，檢測(cè)線為無色，而當(dāng)tnf-α存在時(shí)，可以和linker進(jìn)行結(jié)合，使適配體納米金復(fù)合物分離，形成初始的aunps-dna1和aunps-dna2，3，其中aunps-dna2，3可通過硝酸纖維素膜，與檢測(cè)線上的鏈霉親和素結(jié)合，使檢測(cè)線顯示紅色，根據(jù)紅色的深淺程度，可以判斷tnf-α的濃度高低。

本發(fā)明方法的選擇性和特異性好，這是由核酸適配體本身的特點(diǎn)和結(jié)構(gòu)決定的，在篩選適配體的過程中加入tnf-α，用selex篩選方法，選出能與tnf-α特異性結(jié)合而不與其他物質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)的核酸適配體；

本發(fā)明可用于老年癡呆的早期篩查，方法操作簡(jiǎn)便，核酸適配體無需標(biāo)記，無需使用大型的儀器設(shè)備，具有檢測(cè)速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)；克服了適配體需要標(biāo)記而導(dǎo)致成本提高和電化學(xué)操作相對(duì)復(fù)雜的不足，降低了檢測(cè)成本。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為pvc底板，2為樣品墊，3為結(jié)合墊，4為硝酸纖維素膜檢測(cè)層，5為吸水墊，6為檢測(cè)線；

圖2為檢測(cè)結(jié)果示意圖，無tnf-α存在時(shí)，藍(lán)色的交聯(lián)復(fù)合物不能通過硝酸纖維素膜，檢測(cè)線為無色；有tnf-α存在時(shí)，交聯(lián)復(fù)合物分離，形成初始的aunps-dna1和aunps-dna2，3，aunps-dna2，3可以通過硝酸纖維素膜，檢測(cè)線為紅色。

圖3為檢測(cè)試紙條結(jié)果圖，左邊為無tnf-α存在時(shí)，藍(lán)紫色的交聯(lián)復(fù)合物不能通過硝酸纖維素膜，少量未交聯(lián)的通過硝酸纖維素膜，檢測(cè)線紅色較淺；有tnf-α存在時(shí)，檢測(cè)線紅色變深。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。

本發(fā)明提供的用于tnf-α檢測(cè)的半定量核酸適配體試紙條，包括兩端分別設(shè)有樣品墊2和吸水墊5的底板1，底板1的中部設(shè)置有硝酸纖維素膜檢測(cè)層4；硝酸纖維素膜檢測(cè)層4上靠近吸水墊5的一端設(shè)有檢測(cè)線6，檢測(cè)線6包被有特異性結(jié)合生物素的鏈霉親和素；在硝酸纖維素膜檢測(cè)層4和樣品墊2之間設(shè)置有結(jié)合墊3，結(jié)合墊3上摻有適配體納米金復(fù)合物；樣品墊2、結(jié)合墊3、硝酸纖維素膜4和吸水墊5依次搭接；

所述的適配體納米金復(fù)合物是不能通過硝酸纖維素膜檢測(cè)層的核酸-適配體-納米金網(wǎng)格狀復(fù)合物，其中核酸連接在納米金顆粒上并雜交形成雙鏈，適配體能夠與tnf-α特異性識(shí)別，在識(shí)別后打開雙鏈，使核酸-適配體-納米金網(wǎng)格狀復(fù)合物分解；納米金顆粒上還連接有末端設(shè)有生物素的單鏈核酸，其在適配體納米金復(fù)合物分解后能通過硝酸纖維素膜檢測(cè)層，并泳動(dòng)到檢測(cè)線處。

具體的，所述的適配體納米金復(fù)合物，是aunps-dna1顆粒和aunps-dna2，3顆粒通過dna1、dna2與linker通過dna雜交后形成的核酸-適配體-納米金網(wǎng)格狀復(fù)合物；

所述的aunps-dna1顆粒是巰基化的dna1連接于納米金顆粒上，aunps-dna2，3顆粒是巰基化的dna2、dna3分別連接于納米金顆粒上；

所述的linker含有與tnf-α特異性結(jié)合的適配體序列，且linker的兩端分別與dna1、dna2相互補(bǔ)；dna1、dna2和linker可雜交形成雙鏈；dna3的末端設(shè)有生物素，其序列不能與dna1、dna2相雜交。

本發(fā)明提供的一種用于tnf-α檢測(cè)的半定量核酸適配體試紙條，，利用核酸適配體和納米金交聯(lián)復(fù)合物比色檢測(cè)tnf-α，基于核酸適配體和納米金交聯(lián)復(fù)合物來進(jìn)行的，下面分別對(duì)其進(jìn)行說明。

關(guān)于核酸適配體：

適配體是在體外通過selex過程人工篩選出來的一類和靶分子有著高度的特異性親和能力的短鏈寡核苷酸序列，就像抗原-抗體結(jié)合一樣，靶分子可以和它對(duì)應(yīng)的適配體特異性地結(jié)合。

selex技術(shù)即指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)，利用分子生物學(xué)的技術(shù)，構(gòu)建人工合成的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)，將寡核苷酸文庫(kù)和靶分子相互作用，保留結(jié)合的寡核苷酸配基，經(jīng)反復(fù)擴(kuò)增、篩選數(shù)個(gè)循環(huán)，即可使與該靶分子特異性結(jié)合的寡核苷酸序列得到富集，利用該技術(shù)可以從隨機(jī)單鏈核酸序列庫(kù)中篩選出特異性與靶物質(zhì)高度親和的適配體。

dna1和dna2首先需與linker的對(duì)應(yīng)區(qū)域互補(bǔ)，并通過linker連接后形成線性分子；同時(shí)，dna1、dna2自身以及之間不形成穩(wěn)定的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)；linker設(shè)計(jì)時(shí)除考慮與dna1和dna2互補(bǔ)外，還考慮互補(bǔ)序列自身結(jié)構(gòu)對(duì)適配體構(gòu)象的影響，避免獨(dú)自形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)等，影響對(duì)靶分子的識(shí)別。

而dna3的末端設(shè)有生物素，其序列只要不與dna1、dna2相雜交即可，其序列非特異性。

具體的設(shè)計(jì)結(jié)果如表1所示，其中序列1為tnf-α適配體序列，序列2為dna1序列，序列3為dna2序列，序列4為linker序列。

序列表1

具體的，本發(fā)明所提供的dna1、dna2、linker均由上海生工生物工程有限公司合成。

當(dāng)樣品墊2存在tnf-α?xí)r，tnf-α特異性結(jié)合適配體納米金復(fù)合物，使連接構(gòu)成適配體納米金復(fù)合物的linker從其上分離，分離后的帶有生物素的顆粒通過硝酸纖維素膜，與檢測(cè)線上的鏈霉親和素結(jié)合，從而顯示出紅色，tnf-α濃度越大，則紅色越明顯。

具體的，所述的樣品墊2、結(jié)合墊3、硝酸纖維素膜4、吸水墊5在相搭接時(shí)相互重疊1～3mm。

下面給出用于tnf-α檢測(cè)的半定量核酸適配體試紙條的制備方法，包括以下操作：

1)利用檸檬酸鈉還原法制備出粒徑13～20nm的納米金顆粒；

2)巰基化的dna1與納米金經(jīng)鹽老化方法連接形成aunps-dna1顆粒；

巰基化的dna2、dna3與納米金經(jīng)鹽老化方法連接形成aunps-dna2，3顆粒；

3)將aunps-dna1顆粒、aunps-dna2，3顆粒和linker在緩沖溶液中雜交形成藍(lán)色的適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物；將得到的適配體納米金交聯(lián)復(fù)合物離心，去除上清，沉淀重懸；

所述的linker含有與tnf-α特異性結(jié)合的適配體序列，且linker的兩端分別與dna1、dna2相互補(bǔ)；dna1、dna2和linker可雜交形成雙鏈；dna3的末端設(shè)有生物素，其序列不能與dna1、dna2相雜交；

4)將樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼組裝到底板上，相鄰粘貼物之間的重疊部分為1～3毫米；

5)將核酸-適配體-納米金網(wǎng)格狀復(fù)合物重懸液加于結(jié)合墊上，烘干；

6)在硝酸纖維素膜的檢測(cè)線位置加鏈霉親和素溶液，烘干后完成tnf-α檢測(cè)的半定量核酸適配體試紙條的制備。

具體的，所述納米金的制備為：將氯金酸邊攪拌邊加熱至沸騰，然后加入檸檬酸三鈉水溶液，溶液由藍(lán)轉(zhuǎn)為紅色后持續(xù)加熱2～8min，冷卻后得到納米金溶液，其中納米金粒徑為10～20nm。

所述dna1、dna2在與納米金結(jié)合前，先將其溶于滅菌超純水中；dna1、dna2的濃度為0.1～1mm；所述的linker的濃度為10～100μm；雜交條件為室溫反應(yīng)1小時(shí)，4℃過夜；

在緩沖液中孵育時(shí)，aunps-dna1顆粒、aunps-dna2，3顆粒和linker的摩爾比為1～10：1～0：1～10；

所述的重懸液含有質(zhì)量濃度3～5％的蔗糖、100～300mmnacl和10～30mmtris-acetate；重懸液的ph為7～8。

所述的樣品墊2)在檢測(cè)時(shí)加入溶解狀態(tài)的tnf-α；

適配體納米金復(fù)合物的重懸液加入量為5～10μl，37℃過夜烘干；

所述檢測(cè)線位置的鏈霉親和素濃度為0.1～10mg/ml；

所述試紙條的寬度為2～5mm。

本發(fā)明的技術(shù)方案是基于以下原理實(shí)現(xiàn)的：dna1，dna2和linker是互補(bǔ)的單鏈核酸，在一定條件下，這三條單鏈可以雜交形成雙鏈；而dna3一端帶有生物素，可與鏈霉親和素特異性結(jié)合；linker中的一段序列為tnf-α的適配體，可與tnf-α特異性結(jié)合。巰基連接的aunps-dna1和aunps-dna2，3通過linker可以雜交形成一個(gè)大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使納米金發(fā)生沉聚，溶液會(huì)由紅色變?yōu)樗{(lán)紫色，藍(lán)紫色的適配體納米金復(fù)合物不能通過硝酸纖維素膜，停留在結(jié)合墊上，檢測(cè)線為無色，而當(dāng)tnf-α存在時(shí)，可以和linker進(jìn)行結(jié)合，使適配體納米金復(fù)合物分離，形成初始的aunps-dna1和aunps-dna2，3，其中aunps-dna2，3可通過硝酸纖維素膜，與檢測(cè)線上的鏈霉親和素結(jié)合，使檢測(cè)線顯示紅色，根據(jù)紅色的深淺程度，可以判斷tnf-α的濃度高低。下面給出具體的實(shí)施例。

參見圖2，無tnf-α存在時(shí)，藍(lán)色的交聯(lián)復(fù)合物不能通過硝酸纖維素膜，檢測(cè)線為無色；有tnf-α存在時(shí)，交聯(lián)復(fù)合物分離，形成初始的aunps-dna1和aunps-dna2，3，aunps-dna2，3可以通過硝酸纖維素膜，檢測(cè)線為紅色。

實(shí)施例1

一種檢測(cè)tnf-α的金標(biāo)試紙條，包括底板，底板上依次相連的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜以及吸水紙，在結(jié)合墊上有適配體納米金復(fù)合物；所述硝酸纖維素膜上靠近吸水紙一端設(shè)有檢測(cè)線，檢測(cè)線為鏈霉親和素，可特異性結(jié)合生物素。

tnf-α可以特異性結(jié)合其適配體，使linker從交聯(lián)復(fù)合物上分離，分離后的顆?？梢酝ㄟ^硝酸纖維素膜和檢測(cè)線上的鏈霉親和素結(jié)合，從而顯示出紅色，tnf-α濃度越大，則紅色越明顯，檢測(cè)過程無需復(fù)雜的儀器和專業(yè)的操作人員，顯色迅速，在室溫下就可以進(jìn)行，具有良好的靈敏性和特異性。

實(shí)施例2

用于tnf-α檢測(cè)的半定量核酸適配體試紙條的制備方法，包括以下操作：

步驟一、納米金溶液的制備：采用檸檬酸三鈉還原法制備納米金溶液；具體的，所述納米金粒徑為10～20nm，濃度為5～10nm。

]步驟二、巰基化的dna和納米金連接：末端巰基修飾的dna和納米金采用鹽老化方法來進(jìn)行連接；其中，dna濃度為10～100μm。納米金溶液在使用前先用0.22μm的濾膜過濾

步驟三、適配體膠體金交聯(lián)復(fù)合物的形成：上一步驟中形成的顆粒和linker在一定的條件下進(jìn)行雜交，形成適配體膠體金交聯(lián)復(fù)合物，此時(shí)溶液會(huì)由紅色變?yōu)樗{(lán)紫色；其中，雜交條件為室溫反應(yīng)1小時(shí)，4℃過夜。所形成的適配體納米金復(fù)合物可用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行表征。

步驟四、適配體膠體金交聯(lián)復(fù)合物離心，用buffer重懸；反應(yīng)條件為室溫、避光反應(yīng)1小時(shí)。離心條件為11600g，15min。重懸buffer為3～5％蔗糖、100～300mmnacl、25～100mmtris-hcl。重懸buffer的ph為7～8.5。

將適量tnf-α溶解于200μl滅菌超純水中，得到0.25mg/ml母液以便供檢測(cè)使用；

步驟五、試紙條的組裝：將樣品墊(玻璃纖維膜)、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙按照一定規(guī)格依次粘貼在pvc底板上，制定檢測(cè)線和金標(biāo)墊；試紙條的寬度為3毫米。金標(biāo)墊的制定是在結(jié)合墊上，用移液槍加5～10μl適配體納米金藍(lán)色交聯(lián)復(fù)合物，37℃過夜烘干備用。

步驟六、tnf-α的檢測(cè)：將樣品墊浸入不同濃度的tnf-α溶液(將不同量的tnf-α母液溶于水中。)，迅速拿出，孵育，同時(shí)以加入水的處理為對(duì)照溶液；水平靜置，觀察檢測(cè)線處的顏色變化，同時(shí)拍照進(jìn)行分析。孵育條件為室溫，30分鐘。

具體的，檢測(cè)線的制定是在硝酸纖維素膜上靠近吸水紙的一端，用3μl鏈霉親和素溶液劃一條檢測(cè)線，37℃過夜烘干備用。鏈霉親和素的濃度為0.1～10mg/ml。

參見圖3所示的檢測(cè)試紙條結(jié)果圖，左邊為無tnf-α存在時(shí)，藍(lán)紫色的交聯(lián)復(fù)合物不能通過硝酸纖維素膜，少量未交聯(lián)的通過硝酸纖維素膜，檢測(cè)線紅色較淺；有tnf-α存在時(shí)，檢測(cè)線紅色變深。

以上給出的實(shí)施例是實(shí)現(xiàn)本發(fā)明較優(yōu)的例子，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明技術(shù)方案的技術(shù)特征所做出的任何非本質(zhì)的添加、替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。