本發(fā)明涉及臨床體外檢測試劑技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及一種髓過氧化物酶免疫比濁法檢測試劑盒。
背景技術(shù):
髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)是一種重要的含鐵溶酶體,存在于髓系細(xì)胞(主要是中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞)的嗜苯胺藍(lán)顆粒中,是髓細(xì)胞的特異性標(biāo)志,隨著對MPO研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)MPO基因多態(tài)性導(dǎo)致個體對一些疾病易感性的差異,與人類多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),因此越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。髓過氧化物酶是由中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和某些組織的巨噬細(xì)胞分泌的含血紅素輔基的血紅素蛋白酶,是血紅素過氧化物酶超家族成員之一。MPO的合成是粒細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)之前在骨髓內(nèi)合成并貯存于嗜天青顆粒內(nèi),外界刺激可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞聚集,釋放髓過氧化物酶。在成熟的粒細(xì)胞中,MPO是含量最豐富的糖蛋白,約占外周血多形核中性粒細(xì)胞(PMNs)內(nèi)總蛋白質(zhì)含量的5%,血液中95%的MPO來源于PMNs。MPO以3種亞形存在于髓系細(xì)胞中,分別為MPOⅠ、Ⅱ、Ⅲ。3種亞型主要是重鏈有差異,輕鏈的差異較小,導(dǎo)致它們在相對分子質(zhì)量及疏水性等方面不同,3種亞型在功能上的差異還不明確,有待進(jìn)一步研究。
MPO是中性粒細(xì)胞的功能標(biāo)志和激活標(biāo)志,其水平及活性變化代表著嗜中性多形核白細(xì)胞的功能和活性狀態(tài)。髓過氧化物酶是一種既與天然免疫防御有關(guān),又與組織損傷有關(guān)的酶,它參與多種疾病的發(fā)生,如白血病、阿爾茨海默病、血管炎和動脈粥樣硬化等。許多研究發(fā)現(xiàn),MPO不僅能殺滅吞噬于細(xì)胞內(nèi)的微生物,而且可釋放到細(xì)胞外,破壞多種靶物質(zhì),如腫瘤細(xì)胞、血小板、NK細(xì)胞、原蟲、毒素等,對機體產(chǎn)生和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等多方面發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)MPO有促進(jìn)動脈粥樣硬化病變形成的作用,MPO通過產(chǎn)生自由基和多種反應(yīng)性物質(zhì),促進(jìn)斑塊形成和不穩(wěn)定性增加,加速動脈粥樣硬化進(jìn)展,進(jìn)而引起多種并發(fā)癥如急性冠脈綜合征。急性冠脈綜合征是由冠狀動脈斑塊破裂、血栓形成導(dǎo)致急性或亞急性心肌缺血的臨床綜合癥。炎癥反應(yīng)伴隨斑塊形成是該綜合癥發(fā)生發(fā)展的主要病理機制。髓過氧化物酶在炎癥發(fā)生時由中性粒細(xì)胞釋放入血,因此定量測定血液中髓過氧化物酶含量可一定程度上反映機體炎癥反應(yīng)的狀態(tài)與嚴(yán)重程度,用于輔助診斷急性冠脈綜合癥的發(fā)生與發(fā)展。
膠乳增強免疫比濁法,是從免疫凝集實驗發(fā)展而來一種高靈敏度、可用于全自動生化分析儀的簡便快速免疫分析方法,從而使待檢測物質(zhì)的分子量和含量上突破了原有免疫透射比濁法的局限性。以其高特異性、高靈敏度、線性范圍寬泛和高度自動化被大量應(yīng)用于臨床檢驗中。
鑒于此,本發(fā)明提供一種用膠乳免疫比濁法檢測髓過氧化物酶的試劑盒,優(yōu)化其反應(yīng)體系,使其操作簡單、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好、可進(jìn)行批量樣本全自動化檢測,從而消除上述背景技術(shù)中缺陷。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定性好的用于檢測髓過氧化物酶的試劑盒,該試劑盒采用膠乳免疫比濁法。該試劑盒與常規(guī)的試劑盒相比,穩(wěn)定性和線性范圍比常規(guī)的檢測試劑盒要好有利于試劑在臨床上的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明的基本原理如下:采用羊抗人髓過氧化物酶抗體致敏的膠乳顆粒,與待測樣品中髓過氧化物酶在液相中相遇,立即形成不溶性抗原-抗體復(fù)合物,并形成一定濁度。濁度高低反應(yīng)樣品中髓過氧化物酶的含量,通過與同樣處理的校準(zhǔn)品比較,即可計算出樣品中髓過氧化物酶含量。
本發(fā)明是通過以下步驟得到的:
一種髓過氧化物酶檢測試劑盒,其特征在于,它包含試劑R1和試劑R2。試劑組成如下:試劑R1組成為50mmol/L pH 7.4的HEPES緩沖液、1% 聚氧乙烯聚丙烯嵌段聚合物、2mmol/L EDTA-Na2、50mmol/L氯化鈉、10mmol/L疊氮鈉;試劑R2組成為50mmol/L pH 7.4的HEPES緩沖液、2mg/mL羊抗人髓過氧化物酶抗體、0.2%膠乳顆粒、1% 聚氧乙烯聚丙烯嵌段聚合物、10mmol/L甘露醇、10mmol/L疊氮鈉。
所述的一種髓過氧化物酶檢測試劑盒,其特征在于試劑R1緩沖液為25℃,pH為7.4的HEPES緩沖液(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)。
所述的一種髓過氧化物酶檢測試劑盒,其特征在于試劑R2緩沖液為25℃,pH為7.4的HEPES緩沖液(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)。
所述的一種髓過氧化物酶檢測試劑盒,其特征在于,所述的表面活性劑為聚氧乙烯聚丙烯嵌段聚合物。
所述的一種髓過氧化物酶檢測試劑盒,其特征在于,所述的膠乳顆粒直徑為150-250nm的聚苯乙烯。
所述的一種髓過氧化物酶檢測試劑盒,其特征在于,使用全自動生化分析儀采用終點法進(jìn)行測定,檢測主波長為600nm。
所述的一種髓過氧化物酶檢測試劑盒,其特征在于,所述試劑R1和試劑R2在使用時的比例為R1:R2=3:1。
本發(fā)明的試劑盒在具有雙試劑功能的全自動生化分析儀上進(jìn)行,其具體使用方法如附圖1所示。
加入生理鹽水、樣本或校準(zhǔn)品9μl,再加入225μl 的R1試劑預(yù)孵育5min,之后再加入75μl的R2試劑,30s后讀取吸光度A1,反應(yīng)5min后讀取吸光度A2,并計算ΔA。
本發(fā)明的有益效果:
1)采用新的緩沖體系,改善了試劑的穩(wěn)定性;
2)采用新的表面活性劑聚氧乙烯聚丙烯嵌段聚合物,增強了試劑的穩(wěn)定性和抗干擾能力,而且不會對試劑的準(zhǔn)確度產(chǎn)生影響;
3)試劑的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性良好,價格便宜,使用方便,有利于該試劑在市場中進(jìn)一步的推廣。
附圖說明
圖1為全自動生化分析儀操作說明;
圖2為兩種試劑的相關(guān)性曲線圖;
圖3為兩種試劑效期穩(wěn)定性曲線圖;
圖4為實施例1試劑與市場認(rèn)可的髓過氧化物酶檢測試劑對比檢測結(jié)果;
圖5為實施例1試劑線性相關(guān)驗證實驗檢測結(jié)果;
圖6為實施例1試劑穩(wěn)定性驗證實驗檢測結(jié)果。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明:
實施例1
一種常規(guī)的髓過氧化物酶檢測試劑盒,它包括試劑R1和試劑R2。
其中試劑R1組成為:
pH 7.4 HEPES緩沖液 50mmol/L
聚氧乙烯聚丙烯嵌段聚合物 1%
EDTA-Na2 2mmol/L
氯化鈉 50mmol/L
疊氮鈉 10mmol/L
試劑R2組成為:
pH 7.4的HEPES緩沖液 50mmol/L
羊抗人髓過氧化物酶抗體 2mg/mL
膠乳顆粒 0.2%
聚氧乙烯聚丙烯嵌段聚合物 1%
甘露醇 10mmol/L
疊氮鈉 10mmol/L
本實施例所述試劑R1和試劑R2,配置時需先配制緩沖液,調(diào)到適當(dāng)pH值后,再添加其它物質(zhì)。本實施例所述試劑盒,在使用時,其測定方法是采用具有雙試劑功能的邁瑞800全自動生化分析儀,利用終點法進(jìn)行測定,操作如下:
加入生理鹽水、樣本或校準(zhǔn)品9μl,再加入225μl 的R1試劑預(yù)孵育5min,之后再加入75μl的R2試劑,30s后讀取吸光度A1,反應(yīng)5min后讀取吸光度A2,并計算ΔA。
ΔA=A2- A1
髓過氧化物酶含量(ng/mL)=(?A測定÷?A標(biāo)準(zhǔn))×C標(biāo)準(zhǔn)。
測定:檢測樣本吸光度變化 ?A標(biāo)準(zhǔn):標(biāo)準(zhǔn)品吸光度變化
實施例2
準(zhǔn)確度驗證試驗:將實施例1的髓過氧化物酶檢測試劑作為實驗組,市場上獲得認(rèn)可的一種準(zhǔn)確度好、穩(wěn)定性好的髓過氧化物酶檢測試劑作為對照組進(jìn)行檢測,對20個臨床血清樣本進(jìn)行檢測,檢測結(jié)果如圖4所示。獲得了兩種試劑的相關(guān)性曲線(如圖2所示),結(jié)果表明,兩組試劑盒的相關(guān)系數(shù)為0.9980,說明兩者相關(guān)性比較好。證明本發(fā)明試劑盒添加及更改的組分對其準(zhǔn)確性不會造成影響,試劑盒依然保持較好的準(zhǔn)確度。
實施例3
線性相關(guān)性驗證試驗:選取髓過氧化物酶含量為1200ng/mL的高值樣本,用生理鹽水進(jìn)行系列稀釋,配制6個不同濃度的樣本,濃度依次為1200ng/mL、960ng/mL、720ng/mL、480ng/mL、240ng/mL、0ng/mL。分別利用實施例1試劑及對照組試劑進(jìn)行檢測,每個濃度的樣本分別測定三次,分別取平均值,檢測結(jié)果如圖5所示。
如上圖所示,實施例1與對照組試劑檢測結(jié)果相關(guān)系數(shù)均大于0.990,且實施例1試劑檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)略大于對照組試劑檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù),這表明本發(fā)明試劑具有更好的線性相關(guān)性。
實施例4
穩(wěn)定性驗證實驗:在2℃~8℃、無腐蝕性氣體的避光環(huán)境中貯存試劑,檢測實施例1及對照組試劑的穩(wěn)定性。每月1號分別用兩組試劑測定同一混合血清樣本,測定三次取平均值,檢測數(shù)據(jù)如圖6所示。
實驗結(jié)果顯示,實施例1試劑在2℃~8℃、無腐蝕性氣體的避光環(huán)境中貯存15個月穩(wěn)定,而對照組試劑在2℃~8℃、無腐蝕性氣體的避光環(huán)境中貯存10個月后開始不穩(wěn)定,如圖3所示,說明本發(fā)明試劑更換緩沖液及表面活性劑后穩(wěn)定性增強。
綜上所述,本發(fā)明提供的髓過氧化物酶檢測試劑盒,試劑R1與試劑R2中的緩沖液更換為pH 7.4的HEPES緩沖液,同時采用新的表面活性劑聚氧乙烯聚丙烯嵌段聚合物,提高了試劑盒的穩(wěn)定性,線性范圍較好,試劑的準(zhǔn)確度也較好。因此,本發(fā)明提供的髓過氧化物酶檢測試劑盒有利于在市場中進(jìn)一步的推廣使用。