本發(fā)明涉及一種檢測試紙，具體而言，涉及基于光敏介孔硅基分子印跡微球的可視化檢測試紙及其制備方法。
背景技術(shù)：
：分子印跡聚合物(mips)可選擇性識別被印跡的痕量/微量模板分子，已廣泛用于復(fù)雜樣品分析的前處理。近年來，分子印跡技術(shù)已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，而將分子印跡技術(shù)與固相微萃取技術(shù)相結(jié)合，更是分離富集領(lǐng)域的新突破。分子印跡聚合物的制備主要包括以下三個步驟：首先，通過共價鍵或非共價鍵使模板分子與功能單體之間結(jié)合形成可逆的化合物或復(fù)合物；然后，在交聯(lián)劑、引發(fā)劑和致孔劑的作用下發(fā)生聚合形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的共聚物，同時將模板分子固定在網(wǎng)狀共聚物中；最后，通過酸解或溶劑抽提等方法將模板分子脫除，從而在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中形成與模板分子在空間結(jié)構(gòu)上完全匹配，并且有專一性識別作用的三維孔穴。制得的分子印跡聚合物不但具有與模板分子相匹配的結(jié)合位點(diǎn)和孔穴，而且能抵抗惡劣環(huán)境、穩(wěn)定性好、使用壽命長，在手性分離、色譜分離、膜分離、固相萃取、化學(xué)仿生傳感器以及模擬酶催化等領(lǐng)域都有很好的應(yīng)用前景。通過傳統(tǒng)的表面聚合法制備的表面分子印跡微球吸附容量較大，選擇性強(qiáng)，但機(jī)械強(qiáng)度較差。本發(fā)明通過使用介孔sio2材料，然后雙鍵修飾介孔sio2表面，使用光敏異構(gòu)的偶氮苯作為功能單體進(jìn)行表面聚合，實(shí)現(xiàn)了光控吸附-解析，解決吸附殘留問題，聚合物殼層實(shí)現(xiàn)了厚度可控，不僅吸附容量、牢固度、機(jī)械強(qiáng)度大為增強(qiáng)，而且隨偶氮苯功能單體的改變，制得的分子印跡微球也呈現(xiàn)出不同顏色，有利于待測物的可視化顯色分析。相對于其他具有分子識別功能的生物大分子(如：酶與底物、抗原與抗體、受體與激素)來說，分子印跡聚合物在很多方面都具有一定的比較優(yōu)勢，如：(1)可以通過功能基團(tuán)的特殊修飾，有目的的提高分子印跡聚合物的親和性和催化能力；(2)分子印跡聚合物能重復(fù)使用，而且在循環(huán)使用多次后，依然保持較高的親和能力；(3)分子印跡聚合物的印跡位點(diǎn)，是人為合成而非天然形成的，因此能有效地抵抗惡劣環(huán)境；(4)制備的分子印跡聚合物形態(tài)均一，親和力強(qiáng)，制備過程簡單，耗時短。模板分子不同，制備出的分子印跡聚合物也不同，可滿足日常的分離分析(如食品安全、藥物分離等)中的不同需求。定性或半定量的試紙檢測是一種直觀的、可視化檢測方法，因此將分子印跡與試紙相結(jié)合進(jìn)行物質(zhì)的快速檢測，將是一種非常有效，能夠推廣的方法，目前市場上這種試紙產(chǎn)品很少。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一是提供一種基于光敏介孔硅基分子印跡微球的檢測試紙的制備方法?；诠饷艚榭坠杌肿佑≯E微球的檢測試紙的制備方法：具體包括以下步驟：(1)光敏介孔硅基分子印跡微球的制備：a)介孔sio2納米球的雙鍵改性：采用溶膠制備法，將介孔sio2納米球懸于3-(三甲氧基硅基)-丙基甲基丙烯酸酯(mps)溶液中，攪拌，收集分離，反復(fù)水洗，真空干燥即得；b)光敏介孔硅基分子印跡微球的制備：通過表面聚合法，以經(jīng)過雙鍵改性的介孔sio2納米球?yàn)檩d體，以待測物為模板分子，以具有光敏異構(gòu)化作用的偶氮苯類化合物為功能單體，二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，偶氮異丁腈為引發(fā)劑，乙腈為致孔劑，制備含有模板分子的光敏介孔硅基分子印跡微球；c)光控溶劑脫除模板分子：制備含有模板分子的分子印跡微球后，利用特定波長的紫外光照射，使印跡微球中功能單體片段由反式構(gòu)型變?yōu)轫樖綐?gòu)型，便于模板分子的脫除；再用特定波長的可見光照射使其恢復(fù)反式構(gòu)型，制得留有模板空穴的光敏介孔硅基分子印跡微球；(2)將步驟(1)制備的光敏介孔硅基分子印跡微球，用于制作檢測試紙。步驟b)中具有光敏異構(gòu)化作用的偶氮苯類化合物為：4-甲基丙烯酸酯基-4′-羥基偶氮苯，4-甲基丙烯酸酯基-4′-羧基偶氮苯，4-甲基丙烯酸酯基-4′磺酸基偶氮苯或4-(4-甲基丙烯酰氧基)-偶氮苯基吡啶等，均可購得(如：sigma-aldrich公司，杭州凱方科技有限公司，北京伊諾凱科技有限公司)。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟(1)中在微球表面聚合過程中通過控制改性介孔sio2、功能單體和引發(fā)劑的摩爾比、聚合反應(yīng)的反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間控制微球聚合物殼層的厚度；實(shí)現(xiàn)吸附容量的調(diào)控優(yōu)化。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，控制微球聚合物殼層的厚度50～70nm，優(yōu)選60nm。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)：控制改性介孔sio2、功能單體和引發(fā)劑的摩爾比3:1:0.1～4:1:0.2，優(yōu)選3:1:0.1；控制聚合反應(yīng)的反應(yīng)溫度55～60℃，優(yōu)選60℃；控制反應(yīng)時間24～36h，優(yōu)選24h。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)：控制功能單體、交聯(lián)劑和致孔劑的摩爾比為1:4:40～1:7:80。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)：步驟(1)的a)具體如下：介孔sio2納米球(粒徑2～50nm)的雙鍵改性：采用溶膠制備法，將介孔sio2納米球懸于3-(三甲氧基硅基)-丙基甲基丙烯酸酯溶液中，40～50℃磁力攪拌5～10h，收集分離，反復(fù)水洗，45～60℃真空干燥即得。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)：步驟(1)的c)具體如下：光控溶劑脫除模板分子：制備含有模板分子的分子印跡微球后，利用360nm紫外光照射5～10min，使印跡微球中功能單體片段由反式構(gòu)型變?yōu)轫樖綐?gòu)型，便于模板分子的脫除，用甲醇回流3～5次即可；再用470nm可見光照射5～10min使其恢復(fù)反式構(gòu)型，制得留有模板空穴的光敏介孔硅基分子印跡微球。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)：同時按步驟(1)中的a)、b)制備不含模板分子的對照印跡微球；步驟(1)中所述的模板分子依檢測對象而定，能噴涂制成一種以上檢測線用于同時檢測一種以上的物質(zhì)。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，噴膜儀噴于nc膜的濃度要進(jìn)行優(yōu)化，將不同濃度的分子印跡微球噴于nc膜上，依次測定同一濃度的待測溶液。通過調(diào)試，獲得以檢測線顯色適當(dāng)，目測靈敏度最好，試劑用量最省的分子印跡微球的最佳濃度。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，噴膜儀在選擇連續(xù)式噴膜儀時，應(yīng)預(yù)先調(diào)整好濃度和噴量，噴膜速度應(yīng)保持不變，使噴量準(zhǔn)確，所噴出的檢測線均勻穩(wěn)定。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)：步驟(2)的具體過程如下：1)硝酸纖維素膜(nc膜)的制備：用50％甲醇懸混制備的光敏介孔硅基分子印跡微球至1～2mg/ml，用噴膜儀按1～2μl/cm速度分別噴涂于硝酸纖維素膜上作為檢測線，每條檢測線相距4～10mm；同樣地，將1～2mg/ml的對照印跡微球50％甲醇懸混液噴涂于質(zhì)控區(qū)作為質(zhì)控線，用封閉液封閉硝酸纖維素膜，然后室溫晾干備用；優(yōu)選要在37℃烘箱烘干。2)檢測試紙的組裝：將干燥后的樣品墊、玻璃纖維膜(反應(yīng)墊)、硝酸纖維素膜和吸水濾紙依次裝配在預(yù)先涂有pvc專用膠的pvc底板上，然后用切條機(jī)切割成5～10mm寬的試紙條成品。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)：所述的封閉液為含有0.25％聚乙烯吡咯烷酮、0.25％牛血清白蛋白、5％蔗糖的混合溶液；所述的基于光敏介孔硅基分子印跡微球各部件長度為：吸水濾紙3cm，nc膜4cm，玻璃纖維膜1cm，樣品墊3cm，pvc底板10cm；寬度均為5～10mm。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述基于光敏介孔硅基分子印跡微球各部件長度為：吸水濾紙3cm，nc膜4cm，玻璃纖維膜1cm，樣品墊3cm，pvc底板10cm，各部件比例適中，結(jié)果更可靠、清晰。本發(fā)明的第二個目的是提供上述的方法制備得到的基于光敏介孔硅基分子印跡微球的檢測試紙。本發(fā)明為將分子印跡技術(shù)與可視化檢測試紙相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)待測物的快速簡便檢識。試紙條顯色作用原理基于以下兩點(diǎn)：第一，分子印跡微球的選擇性識別原理，以待測物為模板制備的分子印跡微球選擇識別該待測物，對其他物質(zhì)無響應(yīng)；第二，分子印跡微球中，功能單體偶氮苯的光敏異構(gòu)化，結(jié)合模板分子后的光致變色原理。將偶氮苯類作為功能單體，可以獲得既能選擇性識別待測物，又能光致變色的分子印跡微球。具體地，如將功能單體4-甲基丙烯酸酯基-4′-羥基偶氮苯參與共聚反應(yīng)后得到的mips，用紫外光(360nm)照射后其結(jié)構(gòu)由穩(wěn)定的反式構(gòu)型變?yōu)椴环€(wěn)定的順式構(gòu)型，利于將模板分子脫除，如用可見光(470nm)照射使其恢復(fù)反式構(gòu)型，則有利于模板分子的吸附。由于4-甲基丙烯酸酯基-4′-羥基偶氮苯本身是橙紅色的，所以可得到橙紅色的分子印跡微球。由于功能單體與模板分子之間通過分子間力、氫鍵結(jié)合，模板分子如果含有羥基等助色基團(tuán)，從而導(dǎo)致功能單體的分子軌道能級發(fā)生變化，因而最大吸收波長發(fā)生改變。對于偶氮苯化合物中的π→π*躍遷來說，由于分子偶極和氫鍵的作用可能更多的降低π*軌道能級(與π軌道相比)，導(dǎo)致k吸收帶向長波方向位移(紅移)，導(dǎo)致顏色變深，因此吸附模板分子后，該分子印跡微球會由橙紅色變成紫紅色。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：(1)使用sio2介孔材料后，由于介孔材料巨大的比表面，增強(qiáng)了分子印跡微球的吸附量、牢固度與機(jī)械強(qiáng)度。(2)使用光敏異構(gòu)的偶氮苯作為功能單體進(jìn)行表面聚合，同時實(shí)現(xiàn)了光控吸附-解析，解決吸附殘留問題，制得的分子印跡微球也呈現(xiàn)出不同顏色，有利于待測物的可視化顯色分析。由于分子印跡微球的功能單體具有光敏異構(gòu)化作用和光致變色效果，在吸附待測物后發(fā)生顏色變化，可以很直觀地辨別待測物是否存在，為定量檢測提供了定性依據(jù)。(3)分子印跡微球聚合物殼層實(shí)現(xiàn)了厚度可控，有利于吸附容量的調(diào)控優(yōu)化。(4)利用本發(fā)明制備的可視化檢測試紙檢測靈敏度高，速度快，并能同時檢測多個指標(biāo)。(5)該檢測試紙可以根據(jù)檢測需要更換不同待測物為模板，應(yīng)用廣泛。整個檢測過程最快可以在3min內(nèi)完成，更適合于現(xiàn)場快速篩選，操作簡單，檢測快速，非專業(yè)人士可完成全程檢測，有利于該法的推廣和普及。附圖說明圖1為基于光敏介孔硅基分子印跡微球的檢測試紙組裝示意圖；圖2為油樣中三種地溝油標(biāo)志物均為陽性示意圖；圖3為油樣中三種地溝油標(biāo)志物均為陰性示意圖；圖4為t1變成紫紅色，而t2、t3不變，即該油樣黃曲霉素超標(biāo)示意圖；圖5為t2變成紫紅色，而t1、t3不變，即該油樣茴香胺超標(biāo)示意圖；圖6為t3變成紫紅色，而t1、t2不變，即該油樣dbs超標(biāo)示意圖；圖7為質(zhì)控線變色，即試紙失效示意圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，不是對本發(fā)明的限制。實(shí)施例1：基于光敏介孔硅基分子印跡微球的檢測試紙的制備該試紙條可以根據(jù)檢測指標(biāo)改變模板分子，以地溝油的重要標(biāo)志物黃曲霉素、茴香胺、十二烷基苯磺酸鈉(dbs)為例：(1)光敏介孔硅基分子印跡微球的制備：a)介孔sio2納米球的雙鍵改性：利用溶膠制備方法，以介孔sio2納米球?yàn)檩d體，以3-(三甲氧基硅基)-丙基甲基丙烯酸酯(mps)為原料引入雙鍵，具體地，將介孔sio2納米球懸于mps溶液中，50℃磁力攪拌5h，收集分離，反復(fù)水洗，50℃真空干燥即得；b)光敏介孔硅基分子印跡微球的制備：分別以黃曲霉素、茴香胺、dbs為模板分子，與功能單體(4-甲基丙烯酸酯基-4′-羥基偶氮苯)溶解于無水乙腈中進(jìn)行預(yù)組裝，用n2吹掃保護(hù)，然后放入4℃冰箱存放12h，備用；然后以雙鍵改性后的介孔sio2納米球?yàn)檩d體，二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，偶氮異丁腈為引發(fā)劑，溶于致孔劑乙腈中，冰上操作，n2吹掃下加入預(yù)組裝溶液，然后60℃攪拌24h。同時按步驟a)、b)制備不含模板分子的對照印跡微球；c)光控溶劑脫除模板分子：獲得含有模板分子的分子印跡微球后，利用360nm紫外光照射5min，使功能單體由反式構(gòu)型變?yōu)轫樖綐?gòu)型，便于模板分子的脫除，用甲醇回流3～5次即可；再用470nm可見光照射5min使其恢復(fù)反式構(gòu)型，分別得到以黃曲霉素、茴香胺、dbs為模板分子的光敏介孔硅基分子印跡微球。(2)nc反應(yīng)膜的制備：將最終獲得的光敏介孔硅基分子印跡微球，用50％甲醇懸混至2mg/ml，用噴膜儀按1μl/cm分別噴涂于同一條硝酸纖維素(nc)膜上的指定區(qū)域作為檢測線，每條檢測線相距4～10mm；同樣，用噴膜儀將濃度為2mg/ml的對照印跡微球噴涂于質(zhì)控區(qū)作為質(zhì)控線，用封閉液封閉nc反應(yīng)膜，然后室溫晾干備用。(3)檢測試紙的組裝：將干燥后的樣品墊、玻璃纖維膜、nc反應(yīng)膜和吸水濾紙依次裝配在預(yù)先涂有pvc專用膠的pvc底板上，然后用切條機(jī)切割成5mm寬的試紙條，制成基于分子印跡微球的地溝油檢測試紙。實(shí)施例2：光敏介孔硅基分子印跡微球殼層厚度控制與核殼結(jié)合牢固度評價在微球表面聚合過程中通過控制改性sio2、功能單體和引發(fā)劑三者的摩爾比、聚合反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等得到不同條件下的微球，經(jīng)tem檢測微球的厚度。然后分別取50mg微球，置于5ml離心管中，分別加入不同濃度模板的甲醇溶液3.0ml，于震蕩器上震蕩24h，取上層清液用甲醇稀釋之后，用紫外分光光度計(jì)檢測模板分子的濃度，平行測定3次，取平均值。再計(jì)算微球的吸附量。然后比較得出微球的最佳厚度所對應(yīng)的條件。得到的結(jié)果如下：表1改性sio2、功能單體和引發(fā)劑的摩爾比對厚度的影響t＝60℃t＝24hn(改性sio2):n(功能單體):n(偶氮異丁腈)1.5:1:0.022:1:0.053:1:0.14:1:0.25:1:0.5微球殼的厚度(nm)2030605040表2反應(yīng)溫度對厚度的影響n(改性sio2):n(功能單體):n(偶氮異丁腈)＝3:1:0.1t＝24h溫度(℃)4050607080微球殼的厚度(nm)204060105表3反應(yīng)時間對厚度的影響t＝60℃n(改性sio2):n(功能單體):n(偶氮異丁腈)＝3:1:0.1表4微球的厚度對吸附量的影響微球殼的厚度(nm)3040506070最大吸附量(μmol/g)103.5139.8185.4230.7221.3從以上四個表可以看出，最佳反應(yīng)溫度為60℃，因?yàn)殡S著溫度的升高，反應(yīng)開始時，引發(fā)劑分解產(chǎn)生的自由基濃度提高，可以提高聚合以及接枝率，但是溫度太高則會使聚合反應(yīng)中自由基濃度過高，相互之間碰撞而發(fā)生雙基終止的幾率以及發(fā)生鏈轉(zhuǎn)移的幾率提高，因此又會使得聚合以及接枝率降低；改性sio2、功能單體和引發(fā)劑的摩爾比為3:1:0.1時最佳，因?yàn)橐l(fā)劑用量較少時，可以提高體系中的自由基濃度，所以粒子表面的接枝率以及單體的轉(zhuǎn)化率、轉(zhuǎn)化效率均有所提高。但是，引發(fā)劑含量增加到一定程度時，預(yù)引發(fā)產(chǎn)生的自由基之間發(fā)生雙基終止的程度增大，所以使得單體的轉(zhuǎn)化率以及接枝率降低；反應(yīng)時間增加，微球的厚度也有所增加，但最大厚度基本保持在70nm左右。通過吸附實(shí)驗(yàn)得出厚度為60nm時，吸附效果最佳，因?yàn)楹穸忍?，則吸附量較小，會導(dǎo)致試紙的顯色不夠明顯，但是厚度太厚則會導(dǎo)致模板脫除較難，從而微球中可能存在少量模板，吸附量反而降低，所以最佳厚度為60nm。交聯(lián)劑和致孔劑的添加量對厚度影響不大，控制功能單體、交聯(lián)劑和致孔劑的摩爾比為1:4:40～1:7:80即可。針對不同殼層厚度的分子印跡微球，在200r/min往復(fù)振蕩條件下進(jìn)行連續(xù)多次的吸附-解析實(shí)驗(yàn)，每次吸附-解析后計(jì)算吸附容量的下降率(與第1次的相比)，以此評價分子印跡微球球核與聚合物殼層的結(jié)合牢度。我們發(fā)現(xiàn)所有制備獲得的分子印跡微球，在使用10次后，吸附容量下降率不超過5％；在使用20次后，吸附容量下降率不超過12％。這說明，分子印跡微球球核與聚合物殼層的結(jié)合牢度非常好，而且有很強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度。實(shí)施例3：試紙條最低檢出限與選擇性評價1、試紙條最低檢出限的測定將黃曲霉素、茴香胺和dbs標(biāo)準(zhǔn)品分別配成系列濃度(0～100μg/ml)的溶液，分別取100μl滴加到實(shí)施例1制備的試紙條樣品墊上進(jìn)行檢識，重復(fù)3次；通過肉眼觀察，試紙條檢測線變色程度明顯小于對照質(zhì)控線顏色的變化程度時的最小濃度，即為該試紙條的肉眼判定檢出限；其中黃曲霉素檢出限為0.5μg/ml，茴香胺檢出限為0.5μg/ml，dbs檢出限為1.0μg/ml(表5)。表5分子印跡微球檢測試紙檢識黃曲霉素、茴香胺和dbs結(jié)果注：+表示變色，++表示明顯變色，－表示不變色。2、試紙條的檢識選擇性評價分別配制50μg/ml的黃曲霉素、茴香胺、丁香酚、草蒿腦、dbs溶液，取不同體積(20～200μl)用該試紙進(jìn)行檢測，重復(fù)3次，5min后觀察結(jié)果，如表6所示?？梢钥闯鲈撛嚰垖Φ販嫌椭卸∠惴印⒉葺锬X不顯色，而對地溝油常見標(biāo)志物黃曲霉素、茴香胺和dbs具有特異選擇性。表6試紙條的特異性測定結(jié)果體積/μl黃曲霉素茴香胺丁香酚草蒿腦dbs20++－－+40++－－+60++－－+100++－－+200++－－+注：－表示不變色，+表示變色實(shí)施例4：樣品的檢測及結(jié)果判定(以食用油為例)1、待測樣品的處理用膠頭滴管吸取食用油樣品，取2滴至1ml的小離心管中，再加入4滴石油醚和4滴乙醇，混勻，靜置分層后用膠頭滴管小心吸取上層液體棄掉，然后加入15滴純水，混勻待檢。2、樣品檢測將一條試紙的樣品墊端浸入預(yù)處理后的待檢樣品中，樣品液面不可超過檢測線；當(dāng)液體全部浸濕nc膜后的3～5min內(nèi)判定結(jié)果。3、結(jié)果判定試紙條的檢測線顯色分析：(1)三條檢測線均變成紫紅色，表明此油樣中三種地溝油的標(biāo)志物均為陽性，即可判定該油樣為地溝油或摻有地溝油，如圖2所示；(2)檢測線中三條檢測線均不變?yōu)樽霞t色，即可判定該油樣中三種地溝油標(biāo)志物均為陰性，即為合格油樣，如圖3所示；(3)t1變成紫紅色，而t2、t3不變，則說明該油樣黃曲霉素超標(biāo)，如圖4所示；(4)t2變成紫紅色，而t1、t3不變，則說明該油樣茴香胺超標(biāo)，如圖5所示；(5)t3變成紫紅色，而t1、t2不變，則說明該油樣dbs超標(biāo)，如圖6所示。(6)因?yàn)橘|(zhì)控線為不加模板的分子印跡微球，所以它表現(xiàn)的是非特異性吸附，且吸附量比較小，用肉眼觀察不到顏色變化，如果質(zhì)控線變色則說明試紙失效，如圖7所示。當(dāng)前第1頁12