本發(fā)明涉及一種基于納米氧化銅雙酶活性，作為模擬半胱氨酸氧化酶和模擬過氧化物酶，測定半胱氨酸的熒光分析方法和檢測試劑盒，屬于分析化學和納米技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

半胱氨酸是生命體內(nèi)一種重要的生理活性物質(zhì)，它作為還原型谷胱甘肽的底物可以增加谷胱甘肽的生成量，從而保護細胞膜的穩(wěn)定性，減輕心肌細胞在缺血再灌流中的損傷。此外，半胱氨酸還有刺激前T淋巴細胞分化為成熟的淋巴細胞的作用及增加人體對某些毒素的抵抗力。半胱氨酸用途廣泛，可用作發(fā)酵助劑、抗氧劑和穩(wěn)定劑等，用于化妝品、食品和藥物中，它對于抑制維生素C 褐變極為有效，可作為穩(wěn)定劑用于25% 抗壞血酸注射液中。因此，對半胱氨酸的研究包括定量分析引起了人們廣泛的興趣。目前，半胱氨酸的定量測定一般是利用其還原性及其與某些有機試劑發(fā)生反應(yīng)后，用電化學、分光光度法、化學發(fā)光法、催化動力學分光光度法及熒光方法進行測定。

熒光，是指一種光致發(fā)光的冷發(fā)光現(xiàn)象。當某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長的入射光（通常是紫外線或X射線）照射，吸收光能后進入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光的波長長的出射光；而且一旦停止入射光，發(fā)光現(xiàn)象也隨之立即消失。具有這種性質(zhì)的出射光就被稱之為熒光。近年來由于熒光分析法具有靈敏度高，線性范圍寬,分析成本低，設(shè)備操作簡單以及提供信息量大等優(yōu)點，已經(jīng)在分析化學﹑環(huán)境科學﹑臨床醫(yī)學等領(lǐng)域吸引了人們的廣泛關(guān)注。

由于納米材料比表面積大﹑吸附性強﹑水溶性﹑高活性和高選擇性等諸多優(yōu)點，近年來納米材料已廣泛應(yīng)用到熒光分析方法中。與納米技術(shù)的結(jié)合無疑將為熒光分析法在各種實際分析方面開辟更為廣闊的應(yīng)用前景。

本發(fā)明基于納米氧化銅雙酶活性，作為模擬半胱氨酸氧化酶和模擬過氧化物酶，提供一種測定半胱氨酸的熒光分析方法和檢測試劑盒。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是基于納米氧化銅雙酶活性，作為模擬半胱氨酸氧化酶和模擬過氧化物酶，提供一種測定半胱氨酸的熒光分析方法。

為了實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明所述的測定半胱氨酸的熒光分析方法，其特征是是在EP管中分別加入半胱氨酸溶液、磷酸鹽緩沖液、對苯二甲酸、納米氧化銅，溫浴反應(yīng)后，測定熒光，反應(yīng)產(chǎn)物最大激發(fā)波長和熒光波長分別為315 nm和421 nm，熒光強度與半胱氨酸濃度相關(guān)，以測定半胱氨酸。

所使用的納米氧化銅由以下方法制備而得：取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 mL和0.5 mL冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；快速加入0.04 g/mL的氫氧化鈉溶液10 mL，加完后繼續(xù)攪拌5分鐘，得到黑色氧化銅沉淀；將反應(yīng)得到的黑色氧化銅沉淀離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓干燥，得到納米氧化銅粉體。

所述的一種測定半胱氨酸的熒光分析方法，其特征是將0.5 mL濃度為20 mmol/L的對苯二甲酸，0.5 mL濃度為1.5 mmol/L的半胱氨酸和50 μL濃度為560 mg/L的納米氧化銅加入到2.95 mL濃度為200 mmol/L 的pH為7的磷酸鹽緩沖液中，混合搖勻后置于65 ℃溫浴，10分鐘后測定其在421 nm處的熒光強度，激發(fā)波長為315 nm。

所述的一種測定半胱氨酸的熒光分析方法，其特征是半胱氨酸檢測線性范圍為0.625-100 μmol/L，檢測限為6.6 nmol/L。

本發(fā)明所述的測定藥品半胱氨酸的熒光分析方法，其特征是取0.06 g藥品加入到50 mL蒸餾水中超聲溶解，用蒸餾水稀釋80倍得到樣品溶液；將0.5 mL樣品溶液，0.5 mL濃度為20 mmol/L對苯二甲酸和50 μL 濃度為560 mg/L的納米氧化銅加入到2.95 mL 濃度為200 mmol/L, pH為7.0的磷酸鹽緩沖液中，混合后置于65 ℃水浴中反應(yīng)10分鐘；反應(yīng)產(chǎn)物用熒光分光光度計測定421 nm處的熒光強度，激發(fā)波長為315 nm，根據(jù)半胱氨酸的標準曲線計算藥品中半胱氨酸含量。

本發(fā)明所述的測定血漿半胱氨酸的熒光分析方法，其特征是血漿經(jīng)超濾得到血漿樣品，將0.5 mL濃度為20 mmol/L的對苯二甲酸，0.5 mL血漿樣品和50 μL濃度為560 mg/L的納米氧化銅加入到2.95 mL濃度為200 mmol/L 的pH為7的磷酸鹽緩沖液中，混合搖勻后置于65 ℃溫浴，10分鐘后測定其在421 nm處的熒光強度，激發(fā)波長為315 nm，根據(jù)半胱氨酸標準曲線計算血漿中半胱氨酸含量。

所使用的納米氧化銅由以下方法制備而得：取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 mL和0.5 mL冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；快速加入0.04 g/mL的氫氧化鈉溶液10 mL，加完后繼續(xù)攪拌5分鐘，得到黑色氧化銅沉淀；將反應(yīng)得到的黑色氧化銅沉淀離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓干燥，得到納米氧化銅粉體。

本發(fā)明優(yōu)選條件為：

所述的測定半胱氨酸的熒光分析方法，其特征是反應(yīng)體系的pH 值為7.0。

所述的測定半胱氨酸的熒光分析方法，其特征是反應(yīng)溫度為65℃。

所述的測定半胱氨酸的熒光分析方法，其特征是反應(yīng)時間為10分鐘。

所述的測定半胱氨酸的熒光分析方法，其特征是反應(yīng)體系的納米氧化銅濃度為7 mg/L。

所述的測定半胱氨酸的熒光分析方法，其特征是反應(yīng)體系的對苯二甲酸濃度為2.5 mmol/L。

所述的測定半胱氨酸的熒光分析方法，其特征是有以下步驟組成：在EP管中分別加入不同濃度的半胱氨酸，磷酸鹽緩沖液、對苯二甲酸、納米氧化銅，混合液溫浴后將反應(yīng)產(chǎn)物放入熒光分光光度計中檢測熒光強度。

所述的測定半胱氨酸的熒光分析方法，其特征是所加入的半胱氨酸的體積為0.5 mL；加入的磷酸鹽緩沖液體積為2.95 mL，濃度為200 mmol/L，pH為7.0；加入的對苯二甲酸體積為0.5 mL，濃度為20 mmol/L；加入的納米氧化銅體積為50 μL，濃度為560 mg/L?；旌弦涸?5 ℃下溫浴10分鐘后，測定其在421 nm處的熒光強度（激發(fā)波長為315 nm）。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種基于納米氧化銅的半胱氨酸熒光檢測試劑盒。試劑盒中包括a液，b液，c液和標準貯備液；a液為納米氧化銅溶液，b液為磷酸鹽緩沖液，c液為對苯二甲酸溶液，標準貯備液為半胱氨酸溶液。

本發(fā)明所述的一種半胱氨酸熒光檢測試劑盒，其特征是a液濃度為560 mg/L；b液濃度為200 mmol/L、pH=7的磷酸鹽緩沖液；c液濃度為20 mmol/L的對苯二甲酸水溶液；標準貯備液為濃度為1 mmol/L的半胱氨酸水溶液。

所述的一種半胱氨酸熒光檢測試劑盒的使用方法為：將標準貯備液用雙蒸水稀釋為0.005、0.05、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L的系列標準溶液，在0.5 mL系列標準溶液中加入50 μL a液，2.95 mL b液和0.5 mL c液，充分混勻后置于65 °C水浴反應(yīng)10分鐘，以315 nm為激發(fā)波長，測定在421 nm處的熒光強度值，繪制半胱氨酸標準曲線或計算回歸方程；在0.5 mL樣品溶液中加入50 μL a液，2.95 mL b液和0.5 mL c液，充分混勻后置于65 °C水浴反應(yīng)10分鐘，以315 nm為激發(fā)波長，測定在421 nm處的熒光強度值，根據(jù)標準曲線進行定量；半胱氨酸檢測線性范圍為0.625-100 μmol/L，檢測限為6.6 nmol/L。

本發(fā)明的技術(shù)方案具體步驟如下：

（一）納米氧化銅的制備：

取醋酸銅溶液和冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰，快速加入氫氧化鈉溶液，加完后，繼續(xù)攪拌后，得到黑色氧化銅。將反應(yīng)得到的黑色氧化銅立即離心，用無水乙醇洗滌，減壓干燥，即得納米氧化銅粉體。

納米氧化銅具體制備步驟如下：

（1）取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 mL和0.5 mL冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；

（2）快速加入0.04 g/mL的氫氧化鈉溶液10 mL,加完后繼續(xù)攪拌5分鐘，得到褐色氧化銅沉淀；

（3）將反應(yīng)得到的黑色氧化銅沉淀離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓干燥，即得納米氧化銅粉體。

（二）半胱氨酸熒光分析方法

將0.5 mL濃度為20 mmol/L的對苯二甲酸，0.5 mL半胱氨酸和50 μL濃度為560 mg/L的納米氧化銅加入到2.95 mL濃度為200 mmol/L、pH=7的磷酸鹽緩沖液中，混合搖勻后置于65 ℃溫浴，10分鐘后測定在421 nm處的熒光強度，激發(fā)波長為315 nm。

為了實現(xiàn)上述試劑盒的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

（三）試劑盒組成

a液包括上述技術(shù)方案（一）制備的納米氧化銅加入超純水超聲分散所形成的溶液，其濃度為560 mg/L；b液包括濃度為200 mmol/L、pH=7的磷酸鹽緩沖液；c液包括濃度為20 mmol/L的對苯二甲酸水溶液；標準貯備液包括濃度為1 mmol/L的半胱氨酸水溶液。

（四）試劑盒使用方法

將技術(shù)方案（三）的標準貯備液用雙蒸水稀釋為0.005、0.05、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L的系列標準溶液，在0.5 mL系列標準溶液中加入50 μL技術(shù)方案（三）的a液，2.95 mL技術(shù)方案（三）的b液和0.5 mL技術(shù)方案（三）的c液，充分混勻后置于65 °C水浴反應(yīng)10分鐘，以315 nm為激發(fā)波長，測定在421 nm處的熒光強度值，繪制半胱氨酸標準曲線或計算回歸方程。在0.5 mL樣品溶液中加入50 μL技術(shù)方案（三）的a液，2.95 mL技術(shù)方案（三）的b液和0.5 mL技術(shù)方案（三）的c液，充分混勻后置于65 °C水浴反應(yīng)10分鐘，以315 nm為激發(fā)波長，測定在421 nm處的熒光強度值，根據(jù)標準曲線進行定量。

本發(fā)明的優(yōu)點：

（1））本發(fā)明基于納米氧化銅雙酶活性，作為模擬半胱氨酸氧化酶和模擬過氧化物酶，用于半胱氨酸的檢測。

（2）本發(fā)明所使用的納米氧化銅制備過程簡單快速。

（3）本發(fā)明的檢測速度快，可以在20分鐘內(nèi)完成樣品的預處理和檢測

（4）本發(fā)明所構(gòu)建的試劑盒與檢測方法特異性好、靈敏度高，測定半胱氨酸的線性范圍為0.625-100 μmol/L，檢測限為6.6 nmol/L?？捎糜谒幬锛把旱葮悠分邪腚装彼岬臏y定。

附圖說明

圖1為納米氧化銅-半胱氨酸-對苯二甲酸體系熒光光譜圖。

圖2為pH值對納米氧化銅-半胱氨酸-對苯二甲酸體系熒光的影響圖。

圖3為納米氧化銅濃度對納米氧化銅-半胱氨酸-對苯二甲酸體系熒光的影響圖。

圖4為對苯二甲酸濃度對納米氧化銅-半胱氨酸-對苯二甲酸體系熒光的影響圖。

圖5為納米氧化銅-半胱氨酸-對苯二甲酸體系測定半胱氨酸的標準曲線圖。

具體實施方式

本發(fā)明的一個方面在于提供一種基于納米氧化銅的半胱氨酸熒光檢測方法。以下結(jié)合附圖及若干實施例對本發(fā)明檢測方法的技術(shù)方案作進一步的說明。

實例1：

納米氧化銅制備：取0.02 mol/L的醋酸銅溶液150 mL和0.5 mL冰醋酸加入到裝有冷凝管的三頸瓶中，攪拌加熱至沸騰；快速加入0.04 g/mL的氫氧化鈉溶液10 mL，加完后繼續(xù)攪拌5分鐘，得到黑色氧化銅沉淀；將反應(yīng)得到的黑色氧化銅沉淀離心，用無水乙醇洗滌三次，減壓干燥，得到納米氧化銅粉體。

實例2：

將0.5 mL濃度為20 mmol/L的對苯二甲酸，0.5 mL濃度為1.5 mmol/L的半胱氨酸和50 μL濃度為560 mg/L的實例1制得的納米氧化銅加入到2.95 mL濃度為200 mmol/L 的pH為7的磷酸鹽緩沖液中，混合搖勻后置于65 ℃溫浴，10分鐘后測定其在421 nm處的熒光強度（激發(fā)波長為315 nm）。如圖1所示，納米氧化銅可顯著增強熒光信號強度。

實例3：

將0.5 mL濃度為20 mmol/L的對苯二甲酸，0.5 mL濃度為1.5 mmol/L的半胱氨酸和50 μL濃度為560 mg/L的實例1制得的納米氧化銅加入到2.95 mL濃度為200 mmol/L 的不同pH值的磷酸鹽緩沖液中（pH 4-10），混合搖勻后置于65 ℃溫浴，10分鐘后測定其在421 nm處的熒光強度（激發(fā)波長為315 nm）。如圖2所示，熒光強度隨pH值增大而增大并在pH為6.0-7.0時達到峰值，繼續(xù)增大pH熒光強度減小。

實例4：

將0.5 mL濃度為20 mmol/L的對苯二甲酸，0.5 mL濃度為1.5 mmol/L的半胱氨酸和50 μL不同濃度的實例1制得的納米氧化銅（0.01-1100 mg/L）加入到2.95 mL濃度為200 mmol/L 的pH為7的磷酸鹽緩沖液中，混合搖勻后置于65 ℃溫浴，10分鐘后測定其在421 nm處的熒光強度（激發(fā)波長為315 nm）。如圖3所示，熒光強度隨混合液中納米氧化銅濃度增大而增大并在濃度為7 mg/L后達到平臺。

實例5：

將0.5 mL不同濃度的對苯二甲酸（0.01-40 mmol/L），0.5 mL濃度為1.5 mmol/L的半胱氨酸和50 μL濃度為560 mg/L的實例1制得的納米氧化銅加入到2.95 mL濃度為200 mmol/L 的pH為7的磷酸鹽緩沖液中，混合搖勻后置于65 ℃溫浴，10分鐘后測定其在421 nm處的熒光強度（激發(fā)波長為315 nm）。如圖4所示，熒光強度隨混合液中對苯二甲酸濃度增大而增大，在終濃度為2.5 mmol/L時，熒光強度達到平臺。

實例6：

將0.5 mL濃度為20 mmol/L的對苯二甲酸，0.5 mL不同濃度的半胱氨酸和50 μL濃度為560 mg/L的實例1制得的納米氧化銅加入到2.95 mL濃度為200 mmol/L 的pH為7的磷酸鹽緩沖液中，混合搖勻后置于65 ℃溫浴，10分鐘后測定其在421 nm處的熒光強度（激發(fā)波長為315 nm）。以熒光強度對半胱氨酸濃度作圖得到標準曲線。如圖5所示，熒光強度與半胱氨酸濃度在0.625~100 μmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢測限為6.6 nmol/L。

實例7：

將0.5 mL濃度為20 mmol/L的對苯二甲酸，0.5 mL濃度為0.6 mmol/L的半胱氨酸和50 μL濃度為560 mg/L的實例1制得的納米氧化銅加入到2.95 mL濃度為200 mmol/L 的pH為7的磷酸鹽緩沖液中，混合搖勻后置于65 ℃溫浴，10分鐘后測定其在421 nm處的熒光強度（激發(fā)波長為315 nm）。重復8次，其檢測結(jié)果的相對標準偏差為1.1%。

實例8：

將0.5 mL濃度為20 mmol/L的對苯二甲酸，50 μL濃度為560 mg/L的實例1制得的納米氧化銅和0.5 mL不同物質(zhì)（10 mmol/L 的尿酸或10 mmol/L的檸檬酸或10 mmol/L的草酸或10 mmol/L的谷胱甘肽或10 mmol/L的精氨酸或10 mmol/L的天門冬氨酸或10 mmol/L的甘氨酸或10 mmol/L的組氨酸或10 mmol/L異亮氨酸或10 mmol/L的亮氨酸或10 mmol/L的甲硫氨酸或10 mmol/L苯丙氨酸或10 mmol/L的脯氨酸或10 mmol/L的色氨酸或10 mmol/L的蘇氨酸或10 mmol/L的丙氨酸或100 mmol/L的氯化鈉或100 mmol/L的葡萄糖或100 mmol/L的麥芽糖或100 mmol/L的乳糖或5mmol/L的果糖或0.01 mmol/L的抗壞血酸）代替L-半胱氨酸加入到2.95 mL濃度為200 mmol/L 的pH為7的磷酸鹽緩沖液中，混合搖勻后置于65 ℃溫浴，10分鐘后測定其在421 nm處的熒光強度（激發(fā)波長為315 nm）。與0.8 mmol/L的L-半胱氨酸產(chǎn)生的信號相比，上述干擾物質(zhì)所產(chǎn)生的信號可忽略不計。

實例9：

半胱氨酸藥物的測定：取0.06 g藥品加入到50 mL蒸餾水中超聲溶解，用蒸餾水稀釋80倍得到樣品溶液，將0.5 mL濃度為20 mmol/L的對苯二甲酸，0.5 mL藥物樣品溶液和50 μL濃度為560 mg/L的實例1制得的納米氧化銅加入到2.95 mL濃度為200 mmol/L 的pH為7的磷酸鹽緩沖液中，混合搖勻后置于65 ℃溫浴，10分鐘后測定其在421 nm處的熒光強度（激發(fā)波長為315 nm）。經(jīng)實施例6所得半胱氨酸標準曲線計算得出藥品樣品中半胱氨酸含量，此數(shù)值與理論值和中國藥典中的碘-硫代硫酸鈉反滴定法得到的數(shù)據(jù)一致。樣品回收率99.1～115.0%，相對標準偏差0.4-1.3%。

實例10：

血漿中半胱氨酸的測定：血漿經(jīng)超濾得到血漿樣品，將0.5 mL濃度為20 mmol/L的對苯二甲酸，0.5 mL血漿樣品和50 μL濃度為560 mg/L的實例1制得的納米氧化銅加入到2.95 mL濃度為200 mmol/L 的pH為7的磷酸鹽緩沖液中，混合搖勻后置于65 ℃溫浴，10分鐘后測定其在421 nm處的熒光強度（激發(fā)波長為315 nm）。經(jīng)實施例6所得半胱氨酸標準曲線計算得出血漿中半胱氨酸含量。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種基于納米氧化銅的半胱氨酸熒光檢測試劑盒。試劑盒中包括提供納米氧化銅溶液（a液），磷酸鹽緩沖液（b液），對苯二甲酸溶液（c液），半胱氨酸溶液（標準貯備液）。

實例11：

試劑盒的制備：a液將實例1制備的納米氧化銅加入超純水超聲分散所形成的溶液，其濃度為560 mg/L；b液為濃度為200 mmol/L、pH=7的磷酸鹽緩沖液；c液為濃度為20 mmol/L的對苯二甲酸水溶液；標準貯備液為濃度為1 mmol/L的半胱氨酸水溶液。

實例12：

試劑盒使用方法：將實例11的標準貯備液用雙蒸水稀釋為0.005、0.05、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L的系列標準溶液，在0.5 mL系列標準溶液中加入50 μL實例11的a液，2.95 mL實例11的b液和0.5 mL實例11的c液，充分混勻后置于65 °C水浴反應(yīng)10分鐘，以315 nm為激發(fā)波長，測定在421 nm處的熒光強度值，繪制半胱氨酸標準曲線或計算回歸方程。在0.5 mL樣品溶液中加入50 μL實例11的a液，2.95 mL實例11的b液和0.5 mL實例11的c液，充分混勻后置于65 °C水浴反應(yīng)10分鐘，以315 nm為激發(fā)波長，測定在421 nm處的熒光強度值，根據(jù)標準曲線進行定量。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改，等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。