本發(fā)明公開了一種連作滁菊土壤中總酚的測(cè)定方法。具體涉及到一種基于近紅外光譜技術(shù)，以連作滁菊土壤總酚為對(duì)象的快速無損測(cè)定方法，采用近紅外光譜分析技術(shù)，應(yīng)用偏最小二乘法構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，預(yù)測(cè)連作滁菊種植土壤中總酚含量。
背景技術(shù)：
中草藥或蔬菜連續(xù)在同一田地中種植，容易產(chǎn)生連作障礙問題。其中的原因之一是由于植物根系分泌或植株殘?bào)w腐解后，形成的酚酸類物質(zhì)導(dǎo)致植物產(chǎn)生自毒作用。植物產(chǎn)生的酚酸類自毒物質(zhì)很多，總體上分為單酚和多酚，在一起合稱為總酚。因此，為了監(jiān)測(cè)中草藥或蔬菜生產(chǎn)過程中總酚含量，避免連作障礙現(xiàn)象的產(chǎn)生，酚酸類物質(zhì)的檢測(cè)分析成為實(shí)際生產(chǎn)活動(dòng)的技術(shù)要求。對(duì)于單酚、多酚和總酚的測(cè)定方法很多，主要有液相色譜法、紫外分析法、分光光度法以及流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法，這些方法需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，需要加入化學(xué)試劑，對(duì)樣品擾動(dòng)大，測(cè)試耗時(shí)長，再加上各種酚酸具有穩(wěn)定性差，見光容易分解的特點(diǎn)，使得上述分析測(cè)試方法，很難滿足實(shí)際生產(chǎn)活動(dòng)中對(duì)酚酸分析要快速、簡便、無污染、擾動(dòng)小的需求。因此，開發(fā)出新的酚酸測(cè)試新方法勢(shì)在必行。
近紅外光譜技術(shù)是正在快速發(fā)展的綠色無損分析技術(shù)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)、食品、煙草、藥物行業(yè)的成分定量分析。近紅外光譜屬于分子振動(dòng)光譜的倍頻和主頻吸收光譜，主要是由于分子振動(dòng)的非諧振性，使分子振動(dòng)從基態(tài)向高能級(jí)躍遷時(shí)產(chǎn)生的，具有較強(qiáng)的穿透能力。近紅外光可以對(duì)酚酸類物質(zhì)中的酚羥基Ar—OH振動(dòng)的倍頻和合頻吸收，從而構(gòu)成了酚酸類化合物的組成和分子結(jié)構(gòu)的信息。由于不同的酚酸類物質(zhì)含有不同的基團(tuán)，不同的基團(tuán)有不同的能級(jí)，不同的基團(tuán)和同一基團(tuán)在不同物理化學(xué)環(huán)境中對(duì)近紅外光的吸收波長都有明顯差別，且吸收系數(shù)小，發(fā)熱少，因此近紅外光譜可作為單酚和多酚獲取信息的一種有效的載體。因此，選用連續(xù)改變頻率的近紅外光照射樣品時(shí)， 由于試樣對(duì)不同頻率近紅外光的選擇性吸收，通過試樣后的近紅外光線在某些波長范圍內(nèi)會(huì)變?nèi)酰干涑鰜淼募t外光線就攜帶樣品酚酸類物質(zhì)組分和結(jié)構(gòu)的信息。通過檢測(cè)器分析透射或反射光線的光密度，就可以確定酚酸類物質(zhì)的含量。
目前，有研究者利用近紅外光譜技術(shù)研究了單酚的定量分析，比如劉黎鋒研究了近紅外光譜法快速測(cè)定當(dāng)歸提取過程中阿魏酸含量，也有人研究了多酚的定量分析，比如中國發(fā)明專利公開號(hào)CN103592258A和CN101059426A研究了茶多酚的近紅外光譜定量技術(shù)，中國發(fā)明專利公開號(hào)CN105319331A發(fā)明了一種檢測(cè)水果酒中多酚類物質(zhì)的方法及數(shù)學(xué)模型。還有人發(fā)明了總酚的測(cè)定方法，比如中國發(fā)明專利公開號(hào)CN105628696A研究了參芎葡萄糖注射液中總酚酸含量的近紅外光譜分析方法。
總體上來說，對(duì)于酚酸類物質(zhì)導(dǎo)致土壤產(chǎn)生連作障礙的發(fā)生，不應(yīng)該只是某一個(gè)單酚或多酚，亦或是幾個(gè)單酚或幾個(gè)多酚起作用。相對(duì)單酚或多酚，考量土壤中總酚含量的變化情況，對(duì)于土壤連作障礙的實(shí)際意義更大。因此，利用近紅外技術(shù)定量分析土壤中總酚含量，對(duì)于防治連作障礙問題至關(guān)重要。然而，盡管前人對(duì)各種樣本中的總酚做了大量研究，但是酚酸樣品的差異、校正集數(shù)量、驗(yàn)證集數(shù)量、不同的近紅外光譜儀、原始光譜采集后預(yù)處理方法、奇異樣品的剔除、波段的選擇、回歸模型的選擇在內(nèi)的一些因素，都可極大影響近紅外模型預(yù)測(cè)的精度和可靠性，所以，有必要利用紅外光譜技術(shù)，對(duì)不同的連作土壤中的總酚進(jìn)行針對(duì)性監(jiān)測(cè)。
截至目前，尚無連作滁菊土壤中總酚近紅外光譜定量分析方法的報(bào)道，因此，利用近紅外光譜技術(shù)，研發(fā)連作滁菊土壤中總酚的快速無損監(jiān)測(cè)技術(shù)，對(duì)于提早預(yù)防和防治滁菊連作障礙問題有著重大意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明是基于當(dāng)前對(duì)于總酚測(cè)試分析技術(shù)的不足，提供了一種連作滁菊種植土壤中，總酚含量的近紅外光譜定量分析技術(shù)。采用近紅外光譜分析技術(shù)可對(duì)連作滁菊土壤樣品中總酚進(jìn)行快速無損測(cè)定，有效解決了傳統(tǒng)分析技術(shù)的問題，為連作滁菊土壤總酚含量的分析提供了新的綠色便捷、精確可靠的分析方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
（1）建立校正樣品光譜集。收集連作5年滁菊土壤樣品，利用近紅外光譜儀對(duì)樣品集進(jìn)行光譜掃描，獲得校正樣品集的近紅外光譜數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)為樣品的原始光譜。
（2）樣品中總酚含量的化學(xué)定量分析。利用分光光度法對(duì)所收集的樣品進(jìn)行測(cè)試，得到的數(shù)據(jù)為樣品總酚含量的真實(shí)值。
（3）異常光譜判斷。樣品譜圖采集過程中，由于設(shè)備本身的誤差，操作的失誤，波長的漂移以及環(huán)境因素的變化，近紅外光譜譜圖可能出現(xiàn)異常，從而引起模型精度的降低。對(duì)于異常樣品的診斷，采用馬氏距離、標(biāo)準(zhǔn)杠桿值和學(xué)生殘差來剔除奇異樣品。
（4）光譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理。樣品的物理性質(zhì)的差異會(huì)產(chǎn)生光譜基線和斜率的變化，在構(gòu)建校正模型之前，需要對(duì)近紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理，來消除這些因素的影響。常見的光譜預(yù)處理方法有兩種，一種是平滑處理，另一種是導(dǎo)數(shù)處理。
（5）最佳波段的選擇和數(shù)學(xué)模型的構(gòu)建。選擇最佳的波數(shù)范圍，利用偏最小二乘法（partial least squares, PLS）將步驟（2）中的數(shù)據(jù)與模型預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)建立數(shù)學(xué)模型，利用該模型預(yù)測(cè)驗(yàn)證集樣品中總酚含量，進(jìn)行多元交叉驗(yàn)證。
（6）模型的評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)近紅外光譜定量模型建模效果的指標(biāo)，主要有校正相關(guān)系數(shù)Rc、交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)Rcv，交叉驗(yàn)證誤差均方根（root mean square error of cross-validation, RMSECV）、校正集誤差均方根（root mean square error of calibration, RMSEC）和預(yù)測(cè)誤差均方根（root mean square error of validation, RMSEP），相對(duì)預(yù)測(cè)偏差（relative prediction error, RSEP）。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有的有益效果是：
（1）分析時(shí)間極大縮短。運(yùn)用近紅外光譜技術(shù)進(jìn)行連作滁菊土壤樣品中總酚含量的測(cè)定，分析時(shí)間為30秒以內(nèi)，有效提高了測(cè)定效率。
（2）對(duì)樣品無擾動(dòng)，做到了無損檢測(cè)。
（3）測(cè)試過程中無任何化學(xué)試劑使用，降低了分析成本，也不污染樣品。
附圖說明
圖1是近紅外光譜法快速無損檢測(cè)連作滁菊土壤樣品中總酚的技術(shù)原理圖。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作詳細(xì)描述。
（1）樣品的制備。取連作5年滁菊土壤樣品，加入30倍量無水乙醇，加熱回流提取3 h，提取3次，冷卻后抽濾3次后合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無乙醇味，收集濃縮液，再加入5倍量45℃溫水，室溫靜置24h，在5000rpm條件下離心30min，上清液儲(chǔ)存于棕色瓶中，4℃冷藏備用。D-101大孔樹脂先用無水乙醇浸泡過夜，用超純水反復(fù)沖洗直至無乙醇味，再用4%NaOH浸泡過夜，用超純水沖洗至中性，然后用4%HCl溶液浸泡過夜，用超純水沖洗至中性，裝柱（200 mm×50 mm）備用。將提取液用50%乙醇以20 ml/h的速度洗脫，洗脫過程中每隔一段時(shí)間收集大孔樹脂富集純化后的樣品，5根樹脂柱子平行操作，每根收集30個(gè)樣品，總共得到150個(gè)樣品，隨機(jī)取100份樣品為校正集，剩余為驗(yàn)證集。
（2）樣品近紅外光譜的采集。采集樣品的透射光譜，光譜掃描范圍為4000～10000 cm-1，掃描次數(shù)64次，增益2倍，單個(gè)樣品光譜掃描時(shí)間30 s，分辨率8 cm-1，液體樣品池為2 mm光程的石英比色皿。采用空氣為參比光譜，測(cè)試環(huán)境為25℃，相對(duì)濕度為50%。
（3）總酚含量的化學(xué)定量分析?？偡拥臏y(cè)定，采用福林酚法測(cè)定。
a. 標(biāo)準(zhǔn)品的處理：
準(zhǔn)確稱取0.1 g沒食子酸，用50 mL蒸餾水溶解、定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為1000 mg/L 的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0、1.25、2.5、5、10、20、40mL 于100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，配制質(zhì)量濃度為0、12.5、25、50、100、200和400 mg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。
b. 樣品的處理：
稱取2 g樣品，加入蒸餾水20 mL，溶解。以3000 r/min轉(zhuǎn)速離心10min后，取其上清液，稀釋50倍。
c. 測(cè)定與計(jì)算：
取1 mL標(biāo)準(zhǔn)液或樣品液于15 mL 的試管中，分別加入1 mL FC（福林酚）顯色劑及3 mL 20% Na2CO3，混勻，于50 ℃水浴反應(yīng)30 min。在765 nm波長下測(cè)定吸光度。每個(gè)濃度做3個(gè)平行試驗(yàn)，取平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到吸光度值A(chǔ)與沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(T，mg/mL)之間的回歸方程，計(jì)算總酚含量。
（4）奇異樣品的剔除。采用標(biāo)準(zhǔn)杠桿值（Standard leveragel）、學(xué)生殘差（Studentized residual）和馬氏距離（Mahalanobis distance）判斷異常光譜，如果馬氏距離超過閾值，可判斷該樣品光譜異常。杠桿值越接近1，表示該樣品越不利于建模，可視為異常樣品。最后通過樣品杠桿值和學(xué)生殘差聯(lián)合診斷，逐步剔除異常點(diǎn)。
（5）光譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理。譜圖的平滑處理可以有效去除噪聲，導(dǎo)數(shù)處理可以凈化譜圖信息。TQ Analyst軟件提供了Savitzky-Golay和Karl Norris兩種平滑濾波方法。根據(jù)RMSECV值最小和模型相關(guān)系數(shù)較高的篩選原則，本發(fā)明采用一階導(dǎo)數(shù)和Norris平滑濾噪預(yù)處理，建模效果比較理想。
（6）最佳波段的選擇和數(shù)學(xué)模型的構(gòu)建。利用TQ Analyst軟件中的Suggest向?qū)Чぞ撸詣?dòng)選擇最佳的波數(shù)范圍作為參考，根據(jù)光譜波段對(duì)PLS近紅外模型R和RMSECV的影響為依據(jù)，判斷連作滁菊土壤總酚近紅外光譜波段是7500-4000 cm-1，在此波數(shù)范圍內(nèi)，利用偏最小二乘法（partial least squares, PLS）將步驟（3）中的數(shù)據(jù)與模型預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)建立數(shù)學(xué)模型，利用該模型預(yù)測(cè)驗(yàn)證集樣品中總酚含量，進(jìn)行多元交叉驗(yàn)證。
（7）模型的評(píng)價(jià)。模型預(yù)測(cè)值與真實(shí)值呈現(xiàn)良好相關(guān)關(guān)系，校正相關(guān)系數(shù)Rc為0.9896，交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)Rcv為0.9905，校正集誤差均方根RMSEC為0.396，預(yù)測(cè)誤差均方根RMSEP為0.417，交叉驗(yàn)證誤差均方根RMSECV為0.523，相對(duì)預(yù)測(cè)偏差RSEP是4.06%。